Um sensor baseado em Polianilina de Ácidos Nucleicos

O objetivo geral deste procedimento é sintetizar polianilina dispersa em água que possa ser usada para detectar ácidos nucléicos de maneira livre de rótulos. Esta técnica é um método econômico para detectar ácidos nucléicos. Os laboratórios que o adotarem o acharão fácil, robusto e sensível.

A principal vantagem da técnica é que ela é livre de marcação e pode ser usada para detectar diretamente RNAs e DNAs sem a necessidade de manipulação enzimática. Essa técnica tem potencial para novas tecnologias de diagnóstico e, como não usa rótulo, pode ser usada para processar amostras de pacientes com pouca manipulação. A demonstração visual ajudará a desmistificar o sensor.

Esta plataforma inclui ciência e biologia de polímeros, que parecem muito exóticas, mas são, na verdade, extraordinariamente fáceis de implementar. Dissolver completamente a anilina em 60 ml de clorofórmio num balão de fundo redondo de 250 ml. Depois de mexer a 600 RPM por cinco minutos, deixe esfriar de zero a cinco graus Celsius com gelo.

Isso geralmente leva de 15 a 20 minutos. Em seguida, adicionar o dodecilbenzenossulfonato de sódio à solução de anilina num balão de fundo redondo, agitando a 600 RPM. Dissolver o persulfato de amónio em 20 ml de água e adicioná-lo gota a gota durante 30 minutos para evitar o sobreaquecimento da reacção.

Realize a reação de zero a cinco graus Celsius por 24 horas. Observe a mistura de reação inicialmente ficar branco-leitosa após 15 minutos, depois marrom escuro após duas horas e, finalmente, verde escuro após 24 horas. Em seguida, deixe-o atingir a temperatura ambiente por mais 24 horas.

Filtrar a solução PANI de dodecilbenzenossulfonato de sódio com um funil de buchner. Misturar o filtrado com 80 ml de clorofórmio e 120 ml de água numa ampola de decantação. Incubar a solução durante 24 horas à temperatura ambiente e, em seguida, recolher o PANI verde-escuro da ampola de separação, deixando o dodecilbenzenossulfonato de sódio e o APS não reagidos no sobrenadante aquoso.

Dilua a solução de PANI 10 X com água de clorofórmio e, em seguida, misture 200 microlitros de PANI diluído com 6,4 micromoles de oligonucleotídeos de DNA de sonda balançando suavemente por 15 minutos em um tubo de microfífugo. Irradiar a solução de ADN PANI com 1200 microjoules por centímetro quadrado de UV num reticulador durante dois minutos. É fundamental que a exposição aos raios UV seja limitada à quantidade indicada.

A exposição prolongada aos raios UV compromete a mudança de fluorescência no PANI, provavelmente devido ao vazamento cruzado covalente do PANI e do DNA. Complexos de pellets por centrifugação a 17.000 x g por seis minutos e lavagem com solução salina tamponada com fosfato ou PBS. Depois de peletizar uma segunda vez, ressuspenda em PBS.

Adicione oito microlitros de oligonucleotídeos de DNA complementares de 100 micromolers ou ácidos nucléicos alvo a 200 microlitros de complexos de sonda PANI. Realize a hibridização balançando a mistura de solução por 15 minutos a 40 graus Celsius. Após a peletização dos complexos PANI por centrifugação a 17.000 x g durante seis minutos, lavar com PBS e ressuspender em água.

Adicione PANI de diferentes tratamentos em uma microplaca de 96 poços e meça a fluorescência de emissão na faixa de 270 a 850 nanômetros por excitação a 250 nanômetros. Um pico de emissão para PANI deve ser observado em torno de 500 nanômetros. Para realizar a medição de microscopia de fluorescência do duplex hyberdizado, coloque PANI em uma lamínula de vidro borossilicato e seque a 40 graus Celsius por 48 horas.

Adicione oito microlitros de sonda de 100 micromoler em um filme PANI seco e irradie-o com luz ultravioleta por dois minutos. Após a radiação, lave o filme da sonda PANI com PBS e seque a 40 graus Celsius por 48 horas. Realize a hibridização por 15 minutos adicionando ácidos nucléicos alvo.

Pode ser uma amostra biológica ou um oligonucleotídeo alvo controlado. Siga com uma lavagem PBS. Obtenha as imagens fluorescentes com ampliação de 40 x com um filtro passa-longo de 500 nanômetros.

Aqui é mostrada a interação eletrostática de PANI e sondas de DNA aprimoradas por irradiação UV. A hibridização do ácido nucleico alvo desencadeia a formação de duplex, alterando a confirmação estrutural, o que resulta na dissociação do alvo da sonda da superfície PANI. Esta figura mostra a mudança na fluorescência PANI na ausência ou presença de sonda, tanto em solução quanto em meio de revestimento sólido.

O aumento da fluorescência é devido ao fluxo de elétrons do DNA carregado negativamente, aumentando a densidade eletrônica do polímero. Após a hibridização de oligonucleotídeos alvo complementares, as sondas se desprendem, levando à restauração da fluorescência do manjericão. Por outro lado, a hibridização com oligonucleotídeos alvo incompatíveis únicos não resulta nessa restauração da fluorescência do manjericão.

A principal novidade desta técnica é que ela usa UV suave para uma interação exata e isso realmente ajuda a distinguir a interação não específica e a luz. Uma vez dominada, essa técnica pode levar até duas horas, excluindo o tempo dos sentidos e o tempo de secagem dos revestimentos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o DNA se dissolve na água e o chá ácido realmente altera a propriedade eletrônica do PANI.

Depois de assistir a este vídeo, os espectadores devem ter uma boa compreensão de como sintetizar polianilina dispersa em água e usar suas propriedades fluorescentes para detectar ácidos nucléicos. Eles serão capazes de imobilizar DNAs de sonda e realizar hibridização para detectar alvos. Trabalhando com o monômero, é importante lembrar que essa síntese é perigosa e deve ser feita em um capuz com os equipamentos de proteção como óculos de segurança, luvas e jalecos.