Name: Um sensor baseado em Polianilina de Ácidos Nucleicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-01T10:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Aprenda a sintetizar polianilina dispersa em água para detecção sem marcadores de ácidos nucleicos. Este método sensível e econômico distingue diferenças de nucleotídeo único em RNAs e DNAs sem manipulação enzimática.

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Os autores não têm nada a divulgar.

1. processável PANI Síntese <ol><li> Dissolve-se anilina (1 ml, 11 mmol) completamente em 60 ml de clorofórmio num balão de 250 ml de fundo redondo. Agita-se a 600 rpm durante 5 min e arrefecer a 0-5 ° C com gelo. Isso normalmente leva 15-20 min (Figura 2A). </li><li> Adicionar sulfonato de sódio dodecil benzeno (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) para a solução de anilina em um balão de fundo redondo, enquanto se agitava a 600 rpm. </li><li> Dissolver persulfato de amónio (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) em 20 ml de água e adicionar tudo isso gota a gota ao longo de 30 min para evitar o superaquecimento da reação. </li><li> Efectua-se a reacção a 0-5 ° C durante 24 h, e permitir-lhe atingir a temperatura ambiente durante mais 24 h. </li><li> Observe-se a mistura de reacção inicialmente transformar branca leitosa após 15 min, em seguida, castanho escuro após 2 horas, e, finalmente, para verde escuro após 24 h (Figura 2B-F). </li><li> Filtra-se a solução PANI-NaDBS com um funil de Buchner. Misturar com 80 ml de clorofórmio e 120 ml de água, em queeparation funil (Figura 2G). </li><li> Incubar a solução durante 24 horas à temperatura ambiente e recolher o PANI verde escuro a partir do funil de separação, deixando NaDBS que não reagiram e APS no sobrenadante aquoso. </li></ol> 2. A mistura PANI-sonda e irradiação UV <ol><li> Diluir solução PANI 10x com clorofórmio-água (1: 3 v / v) e misturar 200 ul de PANI diluída com 6,4 pmol de oligonucleótidos de DNA sonda por agitação suave durante 15 min num tubo de microcentrífuga. </li><li> Irradiar a solução de ADN com 1.200 PANI μJ / cm 2 de UV em um reticulador durante 2 min. É crítico que a exposição UV é limitado ao valor indicado. A exposição prolongada à radiação UV compromete a mudança de fluorescência no PANI, provavelmente devido à ligação covalente cruzada de PANI e ADN. </li><li> complexos por centrifugação a 17000 xg durante 6 minutos, e lava-se com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Sedimentar novamente, e re-suspensão em PBS. </li></ol> 3. Hybridization de PANI-sonda <ol><li> Adicionar 8 uL de 100 uM oligonucleótidos de ADN complementares ou ácidos nucleicos alvo com 200 ul de complexos PANI-sonda. </li><li> Realizar hibridação por mistura de balanço solução durante 15 min a 40 ° C. </li><li> Agregar as complexos PANI por centrifugação a 17000 xg durante 6 min. Lavar com PBS e re-suspensão em água. </li></ol> 4. Emissão constante Medição Estado de fluorescência <ol><li> Adicionar PANI de diferentes tratamentos para uma microplaca de 96 poços e medir a emissão de fluorescência na gama de 270-850 nm por excitação a 250 nm. Um pico de emissão para PANI devem ser observadas cerca de 500 nm. </li></ol> 5. Medição da Microscopia de Fluorescência duplex hibridado <ol><li> Gota revestimento PANI sobre uma lamela de vidro de borosilicato e seco a 40 ° C durante 48 h. </li><li> Adicionar sonda (8 uL de 100 uM) num filme de PANI e secou-se irradiar com luz UV (1200 μJ / cm2 </suP&gt;) durante 2 min. </li><li> Lava-se a película PANI-sonda com PBS e seco a 40 ° C durante 48 h. </li><li> Realizar a hibridação durante 15 min pela adição de ácidos nucleicos alvo. Esta poderia ser uma amostra biológica, ou um oligonucleótido alvo de controlo (8 uL de 100 uM). Siga com uma lavagem PBS. </li><li> Obtenção das imagens fluorescentes em aumento de 40 vezes, com um filtro de passagem longa de 500 nm. </li></ol>

<ol><li>Hahm, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+polymers+in+protein+detection+platforms%3A+optical%2C+electrochemical%2C+electrical%2C+mass-sensitive%2C+and+magnetic+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors.</a> Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).</li>
<li>Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+DNA+hybridization+sensors+based+on+conducting+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers.</a> Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).</li>
<li>Sengupta, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Intrinsic+Properties+of+Polyaniline+to+Detect+Nucleic+Acid+Hybridization+through+UV-Enhanced+Electrostatic+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction.</a> Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).</li>
<li>Song, E., Choi, J. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conducting+Polyaniline+Nanowire+and+Its+Applications+in+Chemiresistive+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing.</a> Nanomaterials. 3 (3), 498(2013).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyaniline+nanofibres+for+fluorescent+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection.</a> Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).</li>
<li>Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+of+DNA+Immobilized+onto+a+Highly+Oriented+Pyrolytic+Graphite+Electrode+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface.</a> Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28m-Phenylenediamine%29+Nanospheres+and+Nanorods%3A+Selective+Synthesis+and+Their+Application+for+Multiplex+Nucleic+Acid+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection.</a> PLoS ONE. 6 (6), e20569(2011).</li>
<li>Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-chemical+structure+of+polyaniline+synthesized+by+self-stabilized+dispersion+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Res%22%5BJournal%5D)">Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization.</a> Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).</li>
<li>John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+preparation+of+solution+processable+conducting+polyaniline+by+inverted+emulsion+polymerization+using+didecyl+ester+of+4-sulfophthalic+acid+as+multifunctional+dopant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Polym+Sci+A%3A+Polym+Chem%22%5BJournal%5D)">One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant.</a> J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).</li>
<li>El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+polyaniline+nanostructures+in+micellar+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Polym+Sci%22%5BJournal%5D)">Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions.</a> J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).</li>
<li>Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Investigations+of+Polyaniline+Prepared+in+the+Presence+of+Dodecylbenzenesulfonic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Therm+Anal+Calorim%22%5BJournal%5D)">Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid.</a> J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).</li>
<li>Jia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyaniline-DBSA%2Forganophilic+clay+nanocomposites%3A+synthesis+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+Met%22%5BJournal%5D)">Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization.</a> Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).</li>
<li>Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Polyaniline+Nanoparticles+in+Micellar+Solutions+as+Polymerization+Medium%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium.</a> Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).</li>
<li>Scales, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corona-Stabilized+Interpolyelectrolyte+Complexes+of+siRNA+with+Nonimmunogenic%2C+Hydrophilic%2FCationic+Block+Copolymers+Prepared+by+Aqueous+RAFT+Polymerization%E2%80%A0%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†.</a> Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).</li>
<li>Kadashchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+trions+in+conjugated+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+B%22%5BJournal%5D)">Localized trions in conjugated polymers.</a> Phys Rev B. 76 (23), 235205(2007).</li>
<li>Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+DNA+Biosensor+Based+on+Conducting+Polyaniline+nanotube+Array%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array.</a> Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).</li>
<li>Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemically+fabricated+polyaniline+nanowire-modified+electrode+for+voltammetric+detection+of+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Eletrochim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization.</a> Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).</li>
</ol>

O trabalho foi apoiado pela Faculdade de Ciência e Tecnologia da Universidade do Sul do Mississippi e pela Faculdade de Ciência e Tecnologia do Mississippi e pelo programa INBRE do Mississippi (Prêmio Número P204M103476 do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais).

Um sensor baseado em ácidos nucleicos de PANI requer a solubilização do polímero em água, a fim de interagir com o DNA e RNA. A dispersão de PANI em água é realizada usando tensioactivos, formando micelas, como relatado previamente 8. Além dos NaDBS utilizados aqui outros agentes tensioactivos aniónicos, como éster de dodecilo de ácido 4-sulfophthalic, tensioactivos não iónicos tais como etoxilato de nonil-fenol, ou tensioactivos catiónicos como brometo de cetiltrimetil amónio também pode ser utilizado para a...

Os polímeros conjugados fornecem muitas opções para sensores moleculares. Isso inclui respostas fluorescentes, eletrônicas e colorimétricas1. Tem havido muitos esforços para incorporar polímeros conjugados em sensores de ácido nucleico. No entanto, a maioria dos sistemas requer detecção secundária, limitando as opções de detecção2. Recentemente, relatamos uma plataforma de sensor baseada em polímero conjugado construída em polianilina (PANI) que explora as propriedades desse polímero, criando um sistema livre de rótulos3. PANI é um polímero eletroativo extensivamente conjugado com propriedades como fluorescência e resistência que são adequadas para medir sistemas biológicos4. Os éxcitons dentro da estrutura não estão localizados, levando à mobilidade da carga positiva entre as subunidades monoméricas. Isso fornece uma estrutura flexível de cargas positivas que podem interagir com a espinha dorsal carregada negativamente do DNA5,6. É importante ressaltar que o DNA ligado eletrostaticamente é orientado de tal forma que as bases nitrogenadas podem participar do emparelhamento de bases. A associação com o DNA altera as propriedades eletrônicas da PANI, um efeito que pode ser potencializado pela irradiação UV (Figura 1)3. Usando este sistema, oligonucleotídeos complementares aos ácidos nucléicos alvo podem ser imobilizados em PANI. Vários estudos demonstraram que, após a hibridização, os oligonucleotídeos adsorvidos eletrostaticamente se dissociam do PANI ou de outras matrizes catiônicas devido a alterações conformacionais causadas pela mudança para uma estrutura de DNA de fita dupla3,5,7.
Em um sistema de sensor onde a fixação da sonda modula as propriedades do polímero conjugado, os eventos de hibridização podem ser transduzidos sem rótulos ou modificação enzimática de sondas ou ácidos nucléicos alvo. Os polímeros conjugados oferecem grande flexibilidade nos métodos de detecção, um dos quais é a fluorescência. Através do monitoramento da fluorescência PANI, concentrações de ácidos nucléicos alvo tão baixas quanto 10-11 M (10 pM) podem ser detectadas3. A detecção é rápida, ocorrendo dentro de 15 minutos após a hibridização, e específica onde uma única incompatibilidade em uma molécula alvo pode ser diferenciada3. 
A fabricação de sensores PANI é direta. Pode-se gerar PANI de alto peso molecular que é bem disperso em água usando procedimentos de síntese padrão envolvendo monômero de anilina, surfactante e adição controlada de um oxidante. O rendimento pode ser muito alto e o oxidante não reagido é removido por lavagem com água, garantindo que não haja mais crescimento de PAN. A associação PANI-sonda ocorre espontaneamente após a mistura, e a formação do complexo é aumentada pela exposição leve aos raios UV. A hibridização pode ser realizada imediatamente e as alterações na fluorescência PANI testadas após uma curta incubação. A simplicidade dessa tecnologia a torna altamente acessível a muitos laboratórios.

<table><tbody><tr><td>Anilina&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A7401-500&nbsp;</td><td>ACS, líquido, refrigerado</td></tr><tr><td>Peroxidissulfato de amônio</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A682-500&nbsp;</td><td>ACS, cristalino</td></tr><tr><td>Dodecilbenzeno sulfonato de sódio</td><td>Pfaltz & Bauer&nbsp;</td><td>D56340&nbsp;</td><td>95% sólido</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>MCX 10601&nbsp;</td><td>líquido</td></tr><tr><td>Primers de DNA</td><td>MWG operon</td><td>n/a</td><td>sequência de DNA personalizada ~20&nbsp; </td></tr><tr><td>bps Microplaca&nbsp;</td><td>Científica dos EUA</td><td>1402-9800&nbsp;</td><td>96 bem, polipropileno, pois não é reativo ao clorofórmio</td></tr><tr><td>Filme Adesivo Microplate</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>2920-0000</td><td>Reduz a contaminação poço a poço, derramamento de amostras e evaporação</td></tr><tr><td>Tampa de Vidro para Microscópio</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-544-D&nbsp;</td><td>PANI revestido em vidro de cobertura irradiado UV</td></tr><tr><td>Reticulador UV&nbsp;</td><td>UVP&nbsp;</td><td>HL-2000&nbsp;</td><td>Energia: X100 &mu; J/cm2; Tempo: 2 min</td></tr><tr><td>Forno de Hibridização</td><td>VWR</td><td>01014705 T</td><td>Temperatura: 400&nbsp; &#176; C; com balanço por 15 min</td></tr><tr><td>Aparelho de vidro&nbsp;</td><td>Cantil</td><td>de fundo redondo de três pescoços da Fisher Scientific para reação; funil de queda, rolhas, condensador, funil de separação</td>Microscópio Leica Microsystems&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Leica IMC S80</td><td>Ampliação 20X; Pseudo cor 536 nm; Exposição 86 mseg; Ganho 1,0x; Gamma 1.6</td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td>89429-536</td><td></td></tr></tbody></table>

um sensor baseado em polianilina de Ácidos nucleicos

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

A detecção de ácidos nucléicos está no centro das tecnologias de diagnóstico usadas na pesquisa e na clínica. As abordagens padrão usadas nessas tecnologias dependem de modificações enzimáticas que podem introduzir vieses e artefatos. Um elemento crítico das plataformas de detecção de próxima geração será o sensoriamento molecular direto, evitando assim a necessidade de amplificação ou rótulos. Os nanomateriais avançados podem fornecer as modalidades químicas adequadas para realizar sensores sem rótulos. Os polímeros conjugados são ideais para sensoriamento biológico, possuindo propriedades compatíveis com biomoléculas e exibindo alta sensibilidade a mudanças ambientais localizadas. Neste artigo, é apresentado um método para detecção de ácidos nucléicos utilizando o polímero eletrocondutor polianilina. Oligonucleotídeos simples de "sonda" de DNA complementares aos ácidos nucléicos alvo são ligados eletrostaticamente ao polímero, criando um sistema de sensor que pode diferenciar diferenças de nucleotídeo único nas moléculas-alvo. Fora da natureza específica e imparcial dessa tecnologia, ela é altamente econômica.

Figura 2A capta a configuração de reacção no início do processo de polimerização, isto é, antes da adição APS. A formação de micelas é o passo inicial na reacção de síntese de processo de PANI ocorre na interface micelar. A Figura 2B mostra uma solução leitosa após 5 min. 30 min após a APS é adicionada a reacção se vira para uma cor ligeiramente castanha. A Figura 2C mostra a alteração de cor associada com a formação de oligómer...

Os ácidos nucléicos são analitos comuns para avaliar sistemas biológicos; no entanto, o viés da manipulação enzimática pode causar preocupação. Aqui é descrito um método para detecção sem marcação de ácidos nucléicos usando polianilina. Essa tecnologia de sensor sensível e econômica pode distinguir diferenças de nucleotídeo único entre moléculas.

Um sensor baseado em Polianilina de Ácidos Nucleicos

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

O objetivo geral deste procedimento é sintetizar polianilina dispersa em água, que pode ser usada para detectar ácidos nucleicos de forma livre de marcadores. Esta técnica é um método econômico para detecção de ácidos nucleicos. Laboratórios que a adotarem a considerarão fácil, robusta e sensível.A principal vantagem da técnica é que ela é livre de marcadores e pode ser usada para detectar diretamente RNAs e DNAs sem a necessidade de manipulação enzimática. Esta técnica tem potencial para novas tecnologias diagnósticas e, como não utiliza marcador, pode ser empregada no processamento de amostras de pacientes com pouca manipulação. A demonstração visual ajudará a desmistificar o sensor.Esta plataforma inclui ciência dos polímeros e biologia, que parecem muito exóticas, mas na verdade são extraordinariamente fáceis de implementar. Dissolva anilina completamente em 60 ml de clorofórmio em um balão de fundo redondo de 250 ml. Após agitar a 600 RPM durante cinco minutos, resfrie a zero a cinco graus Celsius com gelo.Isso geralmente leva de 15 a 20 minutos. Em seguida, adicione dodecilsulfonato de sódio à solução de anilina em um balão de fundo redondo sob agitação a 600 rpm. Dissolva persulfato de amônio em 20 ml de água e adicione-o gota a gota durante 30 minutos para evitar o superaquecimento da reação.Realize a reação a zero a cinco graus Celsius por 24 horas. Observe inicialmente a mistura reacional ficar esbranquiçada após 15 minutos, depois marrom-escura após duas horas e, finalmente, verde-escura após 24 horas. Em seguida, deixe-a atingir a temperatura ambiente por mais 24 horas.Filtre a solução de polianilina dodecilsulfonato de sódio com um funil de Büchner. Misture o filtrado com 80 ml de clorofórmio e 120 ml de água em um funil de separação. Incube a solução por 24 horas à temperatura ambiente, depois colete a polianilina verde-escura do funil de separação, deixando o dodecilsulfonato de sódio não reagido e o APS no sobrenadante aquoso.Dilua a solução de PANI 10 vezes com água de clorofórmio, depois misture 200 microlitros da solução de PANI diluída com 6,4 micromols de oligonucleotídeos de DNA da sonda, agitando suavemente por 15 minutos em um tubo de microcentrífuga. Irradie a solução de DNA PANI com 1200 microjoules por centímetro quadrado de UV em um cruzador durante dois minutos. É fundamental que a exposição ao UV seja limitada à quantidade indicada.A exposição prolongada à radiação UV compromete a alteração da fluorescência na PANI, provavelmente devido à reticulação covalente entre PANI e DNA. Peliculizar os complexos por centrifugação a 17.000 x g durante seis minutos e lavar com solução salina tamponada com fosfato ou PBS. Após a segunda pelicularização, ressuspender em PBS.Adicione oito microlitros de oligonucleotídeos de DNA complementar ou ácidos nucleicos alvo a 100 micromolares a 200 microlitros de complexos de sonda PANI. Realize a hibridização agitando suavemente a mistura por 15 minutos a 40 graus Celsius. Após a centrifugação dos complexos PANI a 17.000 × g por seis minutos, lave com PBS e reconstitua em água.Adicione PANI de diferentes tratamentos a uma placa microplaqueta de 96 poços e meça a fluorescência de emissão na faixa de 270 a 850 nanômetros com excitação em 250 nanômetros. Deve-se observar um pico de emissão para PANI em torno de 500 nanômetros. Para realizar a medição de microscopia de fluorescência do duto hibridizado, deposite uma camada de PANI sobre uma lamínula de vidro borossilicato e seque a 40 graus Celsius por 48 horas.Adicione oito microlitros de sonda a 100 micromolar sobre um filme seco de PANI e irradie com luz UV por dois minutos. Após a irradiação, lave o filme de sonda de PANI com PBS e seque a 40 graus Celsius por 48 horas. Realize a hibridização por 15 minutos adicionando ácidos nucleicos alvo.Isso pode ser uma amostra biológica ou um oligonucleotídeo alvo controlado. Lave com PBS. Obtenha as imagens fluorescentes com aumento de 40 x utilizando um filtro de passagem longa de 500 nanômetros.É mostrada aqui a interação eletrostática entre PANI e sondas de DNA potencializada pela irradiação UV. A hibridização do ácido nucleico alvo desencadeia a formação do duplex, alterando a confirmação estrutural, o que resulta na dissociação da sonda alvo da superfície de PANI. Esta figura mostra a alteração na fluorescência da PANI na ausência ou presença da sonda, tanto em meio de solução quanto em revestimento sólido.O aumento na fluorescência é devido ao fluxo de elétrons proveniente do DNA com carga negativa, aumentando a densidade eletrônica do polímero. Após a hibridização com oligonucleotídeos alvo complementares, as sondas se destacam, levando à restauração da fluorescência basal. Por outro lado, a hibridização com oligonucleotídeos alvo contendo um único erro de pareamento não resulta nessa restauração da fluorescência basal.A principal novidade desta técnica é que utiliza UV suave para uma interação exata e que, na verdade, ajuda a distinguir interações não específicas e fracas. Uma vez dominada, esta técnica pode levar até duas horas, excluindo o tempo de sensibilização e o tempo de secagem dos revestimentos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o DNA se dissolve em água e que o chá ácido altera efetivamente a propriedade eletrônica da PANI.Após assistir a este vídeo, os espectadores deverão compreender bem como sintetizar polianilina dispersa em água e utilizar suas propriedades fluorescentes para detectar ácidos nucleicos. Eles poderão imobilizar DNAs marcadores e realizar hibridização para detectar alvos. Ao trabalhar com o monômero, é importante lembrar que essa síntese é perigosa e deve ser realizada em uma capela com equipamentos de proteção, como óculos de segurança, luvas e jalecos de laboratório.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Este protocolo descreve a fabricação de uma gaveta pequena, ready-to-use que pode ser aplicada para a detecção visual de vários ácidos nucleicos em um teste único, que é fácil de operar. Nesta abordagem, uma matriz capilar foi usado para multiplex e altamente eficiente detecção de alvos de OGM.

Detecção visual de vários ácidos nucleicos em uma matriz capilar

Aqui, nós relatamos o protocolo para a preparação de um sensor de pH micro grafeno Nafion-revestido, acrescida de polianilina, eletroquimicamente reduzida de óxido de chemiresistive. Este sensor de estado sólido, baseado em chemiresistor, pH micro pode detectar mudanças de pH em tempo real durante o processo de fermentação Lactococcus lactis .

Fabricação de um Nafion-revestido, reduzido grafeno óxido/polianilina Chemiresistive Sensor de pH de Monitor em tempo real durante a fermentação microbiana

Aqui, descrevemos um protocolo para criar nanoestruturas inorgânicas discretas e precisas em substratos usando formas de DNA origami como modelos orientadores. O método é demonstrado através da criação de antenas de ouro plasmônicas em forma de bowtie em um substrato transparente (safira).

DNA origami-mediada substrato Nanopatterning de estruturas inorgânicas para aplicações de sensoriamento

As nanomáquinas baseadas em DNAzyme podem ser usadas para detecção altamente seletiva e sensível de ácidos nucléicos. Este artigo descreve um protocolo detalhado para o projeto de nanomáquinas baseadas em DNAzyme com um núcleo 10-23 usando software livre e sua aplicação na detecção de um fragmento de vírus Epstein-Barr como exemplo.

DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas baseadas para reconhecimento de ácidos nucleicos

Aprenda a sintetizar polianilina dispersa em água para detecção sem marcadores de ácidos nucleicos. Este método sensível e econômico distingue diferenças de nucleotídeo único em RNAs e DNAs sem manipulação enzimática.

Um sensor baseado em Polianilina de Ácidos Nucleicos

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