Name: Isolamento e Activação de Linfócitos murinos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprenda a purificar linfócitos murinos com microesferas magnéticas anti-CD43 para estudos de imunologia e biologia molecular. Este método permite análises funcionais in vitro e in vivo com mínimo estresse celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O estudo é apoiado pelo Ministério da Educação, Singapore (ACRF Tier1-RG40 / 13 e Tier2-MOE2013-T2-2-038). O manuscrito foi editado por Amy Sullivan de Obrizus Communications.

Todos os ratos são criados e mantidos sob condições específicas livres de patógenos e todos os protocolos do mouse são conduzidos de acordo com as diretrizes da Comissão Cuidado e Uso Institucional Animal. 1. Preparação de Tampões e reagentes <ol><li> Prepare completa do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio (10% de soro inactivado por calor de bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina, penicilina (100 UI / mL) / estreptomicina (100 ug / ml), 55 uM de 2-mercaptoetanol ). </li><li> Prepare 20x solução salina equilibrada (BSS) Stock 1 e da 2, separadamente. <ol><li> Prepare 20x BSS Estoque 1 (111 mM dextrose, fosfato de potássio 8,8 mM, 26,7 mM fosfato de sódio dibásico em 1 L de água esterilizada) e adicionar 40 ml de 0,5% Fenol Vermelho 20x estoque BSS 1 antes do ajuste de volume final. Filtrar em condições estéreis através de filtro de 0,2 um antes de armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare 20x BSS stock 2 (25,8 mM de cloreto de cálcio di-hidratado, cloreto de potássio 107 mM, ch de sódio 2,73 Mloride, 19,6 mM de cloreto de magnésio hexa-hidratado, sulfato de magnésio 16,6 mM em 1 L de água estéril). Filtrar em condições estéreis através de filtro de 0,2 um antes de armazenar a 4 ° C. </li><li> Para preparar 1x BSS para uso experimental, diluir 50 ml BSS Estoque 1 e 50 ml da BSS 2, separadamente, em 400 ml de água estéril cada. Combinar as duas soluções diluídas, ajustar até pH 7, e adicionar 20 ml de FBS (2%). Topo até 1 L com água estéril e filtro estéril usando 0,2 m de filtro. NOTA: soluções de BSS devem ser preparados separadamente, pois a mistura de stocks BSS concentradas diretamente pode resultar em precipitação. </li></ol></li><li> Glóbulo Vermelho (RBC) Tampão de Lise <ol><li> Para preparar tampão de lise dos glóbulos vermelhos, mistura 9 partes de cloreto de estoque de amónio (cloreto de amónio 155 mM em água esterilizada) para uma parte da base Tris (130 mM de Tris (hidroximetil) -aminometano em água estéril, pH 7,65) antes do uso. NOTA: Loja soluções de estéreis de cloreto de amônio e Tris-base a 4 ° C. Prepare lise bpode ser prejudicado fresco para assegurar a lise eficiente de hemácias. </li></ol></li></ol> 2. Geração de Linfócitos suspensão de baço ou gânglios linfáticos NOTA: É importante para preparar todos os reagentes e equipamentos necessários para a experiência antes da eutanásia do rato e para gerar suspensões de células únicas de linfócitos tão rapidamente quanto possível para manter as viabilidades celulares elevadas. <ol><li> Euthanize rato experimental por deslocamento cervical ou CO 2 asfixia. NOTA: A partir desta etapa em diante, todos os procedimentos experimentais devem ser realizados de forma asséptica. </li><li> Mergulhe o rato inteiro em 70% de etanol antes de fazer qualquer incisões. Remover os gânglios linfáticos e do baço assepticamente 8, e colocá-los em separadas tubos de 15 ml contendo 5 ml de gelo-frio RPMI / FBS (meio RPMI com SFB a 2%) ou BSS / FBS (a partir do passo 1.2.3). NOTA: Uma vez que BSS impede eficiente lise RBC, use RPMI para a preparação da suspensão de células do baço e mudar para BSS aftelise r RBC. </li><li> Para gerar uma suspensão de células isoladas a partir do baço ou nodos linfáticos, colocar o órgão (s) entre duas peças de estéril de malha 100 uM coador de células numa placa de Petri contendo 2 ml de gelo-frio RPMI / FBS ou BSS / FBS. Usando o êmbolo de uma seringa de 1 ml, triturar o órgão (s) até que tenha sido rasgada em partes muito finas. </li><li> Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml e lava-se o filtro de células de malha com gelada RPMI / FBS ou BSS / FBS. Recolhe-se o restante suspensão de células, adicioná-lo para o mesmo tubo de 15 ml, e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante. NOTA: Re-suspender as células peletizadas sacudindo o tubo com os dedos antes de adicionar tampão de lise RBC ou médio nas etapas subsequentes. </li><li> Preparar tampão de lise temperatura ambiente (RT) RBC durante a centrifugação da suspensão de células (ver passo 1.3.). Após a peletização das células e remoção do sobrenadante, re-suspender as células com 1 ml de tampão de lise dos glóbulos vermelhos para cada 10 8 células. incuBATE a reacção de lise à TA durante 3-4 min. </li><li> Pare a lise de RBC com 14 ml de gelo-BSS frio / FBS e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C. </li></ol> 3. Purificação de células B e T <ol><li> A purificação de células B <ol><li> Contar as células usando um hemocitômetro. Re-suspender até 10 8 células esplênicas em 300 ul BSS / FBS e adicionar 50 ul anti-CD43 microesferas magnéticas 9,10. Para remover as células mortas, adicionar 30 ul anexina V esferas magnéticas. Incubar a suspensão de células num frigorífico a 4 ° C durante 30 min. </li></ol></li><li> Purificação de células T <ol><li> Contar as células usando um hemocitômetro. Re-suspender-se a 10 8 células em não-T cocktail de anticorpos de depleção de células (anticorpos biotinilados contra CD19, B220, Gr-1, TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 e CD4 ou CD8, dependendo da população de células alvo para ser purificado), diluído 1: 200 em 200 ul BSS / FBS a 4,5. Incubar a suspensão de células numa4 ° C frigorífico durante 15 min. </li><li> Após incubação, adicionam-se 10 ml de BSS / FBS para lavar as células e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 165 ul de BSS / FBS a 30 com micro-esferas de estreptavidina ul e 15 ul anexina V esferas magnéticas. Incubar a suspensão de células num frigorífico a 4 ° C durante 30 min. NOTA: Para assegurar mesmo marcação com as microesferas magnéticas, incubar as células com microesferas durante 15 minutos, em seguida, misturar a suspensão de células suavemente batendo no tubo de 15 ml e incubar mais 15 minutos durante o passo 3.1.1. ou 3.2.2. </li></ol></li><li> Preparação da coluna de separação para a purificação celular <ol><li> Prepara-se uma coluna de separação não utilizada, durante a etiquetagem micropérola das células (passo 3.1.1. Ou 3.2.2.). Pré-aquecido BSS (sem FBS) à temperatura ambiente e utilizar 2 ml de lavar e equilibrar a coluna em condições assépticas. Após o equilíbrio com BSS, a coluna lavada não devem ser deixadas a secar fora. NOTA: Nós usamos os LS column em vez da coluna LD recomendada, devido à sua possibilidade de reutilização (ver passo 3.4.). </li><li> Após marcação com as esferas magnéticas, adicionar 14 ml de BSS / FBS para lavar as células e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e re-suspender as células em 1-3 ml RT BSS. </li><li> Anexar uma agulha estéril 21 L para a ponta da coluna de reduzir a taxa de fluxo durante o processo de purificação. Carregar a suspensão de células na coluna equilibrada e recolher o fluxo através contendo as células alvo purificados. Nota: Evite a introdução de bolhas na coluna durante o carregamento. </li><li> Lava-se a coluna uma vez com 1 ml de BSS / FBS e recolher o fluxo através contendo as células alvo purificados. Recarregar a coluna com o fluxo através de uma vez. Recolhe-se o fluxo através após a segunda carga no mesmo tubo de 15 ml. </li><li> Lavar a coluna 3 vezes com 1 ml de BSS / FBS e recolher o fluxo através contendo as células alvo purificados. Depois disso, adicionar 5 ml de BSS / FBS a the coluna e, com um êmbolo, lave as células magneticamente marcadas para fora da coluna para um novo tubo de 15 ml. </li><li> Verifique a pureza das células recolhidas por citometria de fluxo utilizando anticorpos que se ligam a antigénios purificados de células T 4,5 B ou superfície. </li></ol></li><li> Re-usando a coluna de separação NOTA: A coluna LS pode ser reutilizado até 4 vezes sem afectar a eficiência da purificação. <ol><li> Lavar a coluna 3 vezes com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 3 vezes com 5 ml de água destilada a partir do topo usando o êmbolo. </li><li> Lavar a coluna com 5 ml de etanol a 70% e seca-se a coluna extensivamente usando uma torneira de ar para evitar a formação de ferrugem na coluna. </li><li> Para preparar uma coluna LS usado para uma experiência de purificação separada, lavar a coluna de baixo para cima com 5 ml de etanol a 70% utilizando o adaptador de seringa. Em seguida, lava-se a coluna a partir de baixo para cima duas vezes com 5 ml de PBS estéril, seguido de 5 ml de PBS, uma vez a partir do topo da coluna. Adicionar 2ml RT BSS para equilibrar a coluna e depois prosseguir para carregar a coluna com células marcadas. </li></ol></li></ol> 4. CFSE Labeling e Estimulação NOTA: Purificado células podem ser submetidas a uma variedade de ensaios in vitro e em ensaios funcionais in vivo. Aqui, utilizamos células T purificadas para determinar a capacidade de estimulação de célula T de APCs 5. <ol><li> solução pré-aquecido rotulagem (0,1% de FBS em PBS) a 37 ° C antes do carregamento CFSE. NOTA: Usando uma baixa percentagem de FBS em PBS reduz a morte celular durante CFSE carga e minimiza a perda de células durante a centrifugação. No entanto, muito FBS pode interferir com carga CFSE. </li><li> Lavar as células purificadas duas vezes com solução de rotulagem, em seguida, re-suspensas a 2 x 10 7 células / ml na solução de marcação pré-aquecido em um tubo de 15 ml. </li><li> Preparar solução de 10 uM CFSE (diluição 1: 500 de CFSE 5 mM de solução de reserva) em solução de etiquetagem pré-aquecido. solução CFSE deveser preparada a cada vez para alcançar rotulagem ideal. </li><li> Para carregar as células com CFSE, adicionar uma suspensão de células parte para 1 parte de solução de 10 uM CFSE em um tubo de 15 ml e incuba-se no escuro durante 10 min a 37 ° C. Uma concentração final de 5 uM CFSE é utilizado para marcar 1 x 10 7 células / ml. </li><li> Inverter o tubo a cada dois minutos para assegurar uma mistura homogénea de células durante o carregamento CFSE. </li><li> Para parar a reacção, adicionar vários volumes de meio RPMI completo gelada e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C. Após o bem sucedido CFSE carregamento, o sedimento celular aparece amarelado. </li><li> Lavar as células CFSE carregado mais uma vez com meio RPMI completo gelada e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C antes de utilizar para a cultura in vitro ou in vivo estimulação. </li></ol> 5. estimulação in vitro Em <ol><li> Preparar uma solução 2x estoque de estímulos (2x estímulos solução estoque) imediatamente antes da utilização de modo a que 100 ul de solução de estoque 2x estímulos pode ser adicionada a 100 ul de células até um volume final de 200 ul por poço numa placa de 96 poços. </li><li> Se é necessária uma placa revestida com estímulos (IgM ou CD40 para células B ou CD3 e CD28 para as células T), dilui-se os estímulos em PBS e pré-revestimento da placa de cultura a 4 ° C durante a noite. Em alternativa, a placa de cultura podem ser revestidos a 37 ° C durante 1 hora no dia da experiência. Lave a placa revestida duas vezes com PBS (Não permita que o prato para secar a qualquer momento). </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Para as células B </td><td></td></tr><tr><td> estímulos </td><td> A concentração final </td></tr><tr><td> F (ab &#39;) 2 de cabra anti-IgM de ratinho </td><td> 0,6-2,4 ug / ml </td></tr><tr><td> Anti-ratinho CD40 mAb </td><td> 0,5-2 ug / ml </td></tr><tr><td> recombinanterato IL-4 </td><td> 25 U / ml </td></tr><tr><td> lipopolissacarídeo </td><td rowspan="2"> 0,1-10 ug / ml </td></tr><tr><td> (LPS) de E. coli serotipo 055: B5 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Para as células T </td><td></td></tr><tr><td> estímulos </td><td> A concentração final </td></tr><tr><td> Anti-CD3 (placa revestida) </td><td> 2-10 ug / ml </td></tr><tr><td> (50 ul / poço para o revestimento) </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD28 (placa revestida) </td><td> 2 ug / mL </td></tr><tr><td> IL-2 recombinante </td><td> 40 U / ml </td></tr><tr><td> PDBu (éster de forbol) </td><td> 5-50 ng / ml </td></tr><tr><td> A23187 (ionóforo de cálcio) </td><td> 250 ng / mL </td></tr></tbody></table> Quadro 1: Concentrações de estímulos utilizados para estimular os linfócitos em cultura in vitro.<ol start="3"><li> Para as células B CFSE-rotulados, re-suspender a 3 X 10 6 células / ml em meio RPMI completo e a cultura em triplicado com 3 x 10 5 células / poço em placas de 96 poços de fundo plano, durante 72 h. </li><li> No caso de células T marcadas com CFSE-, re-suspender a 0,5-3 x 10 6 células / ml em meio RPMI completo e a cultura em triplicado com 0,5-3 x 10 5 células / poço em placas de 96 poços de fundo redondo de 48 ou 72 hr . </li></ol> 6. Promoção Vivo Em <ol><li> Para a estimulação in vivo, transferência adoptiva 4 x 10 6 células T CFSE marcados por ratinho (por via intravenosa (IV) em 200 ul de PBS) em cada rato receptor semelhantes em MHC. NOTA: Neste protocolo, as células T CFSE rotulados podem ser adoptively transferidos usando veia da cauda ou injeção retro-orbital como essas células vão para casa para linfóides órgãos como o baço e os linfonodos. </li><li> Desafiar os ratos receptores um dia mais tarde com o antigénio. NOTA:Neste exemplo, usamos a ovalbumina (OVA proteína, 50 ug / ratinho) como antigénio específico porque OVA-, receptor de células T (TCR), as células T foram -transgenic adoptivamente transferidos para ratinhos receptores. Prepare proteína OVA em PBS estéril e injectar 100 ul de proteína OVA / PBS ou PBS de controlo, por meio de injecção subcutânea (Si), em cada rato receptor 5. </li><li> Colheita e gerar suspensões individuais de células de órgãos linfóides (nódulos linfáticos e baços de ratinhos receptores) 3 dias após a imunização com a proteína OVA ou PBS. linfonodos separar em nodos linfáticos proximais (PLN), que inclui axilar, braquial e nódulos linfáticos cervical superficial) e nódulos linfáticos distais (DLN), que inclui mesentérica, popliteal, inguinal, lombar, e nódulos linfáticos caudal. células mancha usando os anticorpos FACS apropriados para verificar se há a proliferação de células T. NOTA: Nesta célula experimento de rastreamento CFSE, CFSE marcado com células T de ratinhos de controlo injectados com PBS estabelecer uma linha de base para a fluorescência não-dinecer células. Divisões celulares de proliferação, as células, marcadas com CFSE-estimulado com antigénio são visualizados através da medição de fluorescência picos 12,13. Com o controlo de PBS, o número de divisões celulares de proliferação, as células T CFSE-marcados podem ser determinadas 12,13. </li><li> Analisar os dados de proliferação de células marcadas com CFSE, comparando o número de divisões celulares ou picos entre amostras (Figuras 1 e 2). NOTA: Por exemplo, CFSE marcado, as células T específicas de OVA adoptivamente transferidos para ratinhos receptores que recebem o antigénio OVA vai sofrer proliferação activa em comparação com os ratinhos de controlo injectados com PBS 5,12. Além disso, é de salientar salientar que há muitas maneiras para analisar dados de proliferação de células CFSE, como demonstrado por Hawkins e seus colegas 14. </li></ol>

<ol><li>Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+important+facets+of+T-cell+repertoire+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The many important facets of T-cell repertoire diversity.</a> Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).</li>
<li>LeBien, T. W., Tedder, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes%3A+how+they+develop+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes: how they develop and function.</a> Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).</li>
<li>Brownlie, R., Zamoyska, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+signaling+networks%3A+branched%2C+diversified+and+bound%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor signaling networks: branched, diversified and bound.</a> Nat. Rev. Immunol. 13 (4), 257-269 (2013).</li>
<li>Neo, W. H., Lim, J. F., Grumont, R., Gerondakis, S., Su, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-rel+regulates+ezh2+expression+in+activated+lymphocytes+and+malignant+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">C-rel regulates ezh2 expression in activated lymphocytes and malignant lymphoid cells.</a> J. Biol. Chem. 289 (46), 31693-31707 (2014).</li>
<li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16 (5), 505-516 (2015).</li>
<li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).</li>
<li>Cabatingan, M. S., Schmidt, M. R., Sen, R., Woodland, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%C3%AFve+B+lymphocytes+undergo+homeostatic+proliferation+in+response+to+B+cell+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Naïve B lymphocytes undergo homeostatic proliferation in response to B cell deficit.</a> J. Immunol. 169 (12), 6795-6805 (2002).</li>
<li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Th17+differentiation+of+na%C3%AFve+CD4+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Th17 differentiation of naïve CD4 lymphocytes.</a> J. Vis. Exp. (79), e50765(2013).</li>
<li>Su, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezh2+controls+B+cell+development+through+histone+h3+methylation+and+Igh+rearrangement%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ezh2 controls B cell development through histone h3 methylation and Igh rearrangement.</a> Nat. Immunol. 4 (2), 124-131 (2003).</li>
<li>Mecklenbräuker, I., Saijo, K., Zheng, N., Leitges, M., Tarakhovsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C%CE%B4+controls+self-antigen-induced+B-cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein kinase Cδ controls self-antigen-induced B-cell tolerance.</a> Nature. 416 (6883), 860-865 (2002).</li>
<li>Rush, J. S., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+activated+via+CD40+and+IL-4+undergo+a+division+burst+but+require+continued+stimulation+to+maintain+division%2C+survival+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cells activated via CD40 and IL-4 undergo a division burst but require continued stimulation to maintain division, survival and differentiation.</a> Eur. J. Immunol. 31 (4), 1150-1159 (2001).</li>
<li>Quah, B. J. C., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li>
<li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).</li>
<li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+lymphocyte+proliferation%2C+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).</li>
<li>Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation%3A+Terminology+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell separation: Terminology and practical considerations.</a> J. Tissue Eng. 4 (1), 1-14 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Neste protocolo, demonstramos um procedimento para a purificação de linfócitos de órgãos linfóides. purificação celular utilizando esférulas magnéticas triagem é um método rápido e simples que produz células alvo viáveis, altamente purificados. Passos críticos dentro do Protocolo A viabilidade celular e rendimento celular Mantendo a viabilidade das células de linhagem hematopoiéticas in vitro é fundamental para...

Os linfócitos maduros geralmente existem no estado de repouso se não houver infecção ou inflamação pré-existente no indivíduo. Portanto, é importante manter o status ingênuo dos linfócitos durante o processo de isolamento antes de realizar ensaios funcionais in vitro ou in vivo. A chave para garantir resultados consistentes e reprodutíveis é limitar qualquer manipulação desnecessária das células. 
A classificação magnética de células utiliza anticorpos e microesferas para rotular as células, de modo a enriquecer a população de células de interesse. Com essa abordagem, existem duas estratégias de purificação: enriquecimento positivo e esgotamento negativo. O enriquecimento positivo enriquece a população de células de interesse usando um anticorpo que se liga às células-alvo. A depleção negativa, por outro lado, esgota as células não-alvo, deixando a população celular de interesse. Em nosso laboratório, preferimos a depleção negativa ao enriquecimento positivo porque a ligação de anticorpos às células-alvo pode alterar as características e o comportamento das células. De fato, muitos marcadores de superfície celular estabelecidos adequados para o isolamento de uma determinada população celular também são receptores funcionais. 
A classificação magnética de células não apenas produz populações altamente puras de células-alvo viáveis, mas também consome menos tempo e evita o estresse celular induzido pelo fluxo de alta pressão usado na classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). Ao rotular as populações de células indesejadas e esgotá-las usando uma coluna de separação magnética, somos capazes de realizar um rápido isolamento celular sem comprometer a viabilidade da população de células-alvo. Neste protocolo, demonstramos o uso de estratégias de depleção negativa para purificar células B ou células T virgens.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (sem L-Glutamina)</td><td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>Soro</td><td></td><td></td> Fetal Bovino <td>Inativado por Calor&nbsp;</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140114</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas magnéticas anti-CD43</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-801</td><td>Misturar bem o uso prévio</td></tr><tr><td>de estreptavidina</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td>Misturar bem o uso prévio</td></tr><tr><td>Contas magnéticas anti-anexina V</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-201</td><td>Misture bem o uso prévio</td></tr><tr><td>MACS LD&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura estéril de fundo em U de 96 poços</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura estéril de fundo em F de 96 poços</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; malha</td><td></td><td></td> de filtro de células m <td>Para esterilizar usando radiação UV uso prévio</td></tr><tr><td>0,2 &mu; m&nbsp; unidades de filtro descartáveis estéreis</td><td>Nalgene</td><td>567-0020</td><td>Pode ser substituído por qualquer dispositivo de filtro estéril</td></tr><tr><td>CellTrace Violet</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td>CTV para abreviar; alternativa ao CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Yellow</td><td>Invitrogen</td><td>C34567</td><td>CTY para abreviar; alternativa ao CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Far Red</td><td>Invitrogen</td><td>C34564</td><td>CTFR para abreviar; alternativa ao CFSE</td></tr><tr><td>Corante de proliferação celular eFluor 670</td><td>eBioscience</td><td>65-0840</td><td>CPD670 para abreviar; alternativa para CFSE</td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PKH26GL</td><td>PKH26, alternativa para CFSE</td></tr><<tr><td>strong>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Chemicals </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Vermelho de fenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Merck Millipore</td><td>S7653</td><td>Pode ser usado de outras fontes</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de amônio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D8418</td><td></td></tr> <tr><td>(5- (e 6-) éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE)</td> <td>Sondas moleculares</td><td>C-1157</td><td>Reconstituem em DMSO</td></tr><tr><td>Phorbol 12,13-dibutirato (PBDU, éster de forbol)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P1269</td><td></td></tr><tr><td>A23187 (ionóforo de cálcio)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>C7522</td><td></td></tr> <tr><td> Nome </td> <td> Empresa </td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Anticorpos e proteína recombinante</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>CD11b biotina (clone m1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101204</td><td>coquetel de depleção de células T</td></tr><tr><td>CD11c biotina (clone N418)</td><td>Biolegend</td><td>117304</td><td>coquetel de depleção de células T</td></tr><tr><td>Gr-1 (clone RB6-8C5)</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td>coquetel de depleção de células T</td></tr><tr><td>Ter119 biotina (clone Ter119)</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td>coquetel de depleção de células T</td></tr><tr><td>TCR-&gama; &delta; biotina (clone GL-3)</td><td>Biolegend</td><td>118103</td><td>coquetel de depleção de células T</td></tr><tr><td>CD19 biotina (clone 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115504</td><td>coquetel de depleção de células T</td></tr><tr><td>B220 biotina (clone RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td>coquetel de depleção de células T</td></tr><tr><td>CD49b biotina (clone DX5)</td><td>Biolegend</td><td>108904</td><td>coquetel de depleção de células T</td></tr><tr><td>CD4 biotina (clone GK1.5)</td><td>Biolegend</td><td>100404</td><td>Coquetel de depleção de células T</td></tr><tr><td>CD8 Biotina (clone 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td>Coquetel de depleção de células T</td></tr><tr><td>F(ab')2 IgM anti-rato para cabras (revestidas com placa)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>115-006-075</td><td>50 &micro; l/well para revestimento (96-well)</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD40 mAb (revestido com placa)</td><td>Pharmingen&nbsp;</td><td>553722</td><td>50 &micro; l/well para revestimento (96-well)</td></tr><tr><td>Recombinante IL-4</td><td>ProSpec&nbsp;</td><td>Cyt-282</td><td></td></tr><tr><td>LPS de E. coli Sorotipo 055:B5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L-4005</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 (clone clone OKT3) (revestido em placa)</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>16-0037-85</td><td>50 &micro; l/poço para revestimento (96 poços)</td></tr><tr><td>Anti-CD28 (clone clone 37.51) (revestido com placa)</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>16-0281-85</td><td>50 &micro; l/poço para revestimento (96 poços)</td></tr><tr><td>Albumina recombinante IL-2</td><td>ProSpec</td><td>Cyt-370</td><td></td></tr><tr><td>de clara de ovo de galinha, Ovalbumina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7641</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e activação de linfócitos murinos

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

células B e T, com seus repertórios de antígeno-receptor extremamente diversos, têm a capacidade de montar respostas imunes específicas contra quase qualquer patógeno invasor1,2. Compreensivelmente, essas habilidades intrincadas são controladas por um grande número de moléculas envolvidas em vários processos celulares para garantir respostas imunes oportunas e espacialmente reguladas3. Aqui, descrevemos procedimentos experimentais que permitem o isolamento rápido de linfócitos murinos altamente purificados usando a tecnologia de classificação magnética de células. Os linfócitos purificados resultantes podem então ser submetidos a vários ensaios funcionais in vitro ou in vivo, como a determinação da capacidade de sinalização de linfócitos após estimulação por immunoblotting4 e a investigação de habilidades proliferativas por incorporação de 3H-timidina ou marcação de éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE)5-7. Além de comparar as capacidades funcionais de linfócitos controle e geneticamente modificados, também podemos determinar a capacidade estimulatória de células T de células apresentadoras de antígenos (APCs) in vivo, conforme mostrado em nossos resultados representativos usando células T OT-I marcadas com CFSE transplantadas.

purificação magnética de células de linfócitos permite que os utilizadores para purificar uma população de células alvo num período relativamente curto de tempo. Utilizando o nosso protocolo de esgotamento, que foram capazes de aumentar a percentagem de células T CD8 (OT-I em recombinação-activação do gene-1 (RAG-1) -deficient ratinhos) a partir de 72,8% (antes da purificação) a 94,2% (após purificação; Figura 1A) 4,5. Estes linfócitos purificadas podem então ...

Os linfócitos são os principais atores nas respostas imunes adaptativas. Aqui, apresentamos um protocolo de purificação de linfócitos para determinar as funções fisiológicas das moléculas desejadas na ativação de linfócitos in vitro e in vivo. Os procedimentos experimentais descritos são adequados para comparar as capacidades funcionais entre linfócitos controle e geneticamente modificados.

Isolamento e Activação de Linfócitos murinos

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

O objetivo geral deste experimento é estudar as capacidades funcionais de linfócitos murinos purificados utilizando diversos ensaios funcionais in vitro e in vivo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de Imunologia e Biologia Molecular, como investigar a função de uma proteína de interesse em linfócitos deficientes em gene.A principal vantagem desta técnica é a capacidade de purificar rapidamente linfócitos com manipulação mínima e baixo estresse ambiental. Para purificar células B, re-suspenda até um vezes dez à oitava potência de células do baço inteiro lisadas de hemácias em 300 microlitros de solução salina balanceada ou BSS suplementada com FBS. Em seguida, adicione 50 microlitros de microesferas magnéticas anti-CD43.Para remover as células mortas, adicione 30 microlitros de microesferas magnéticas de Anexina V durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Agite suavemente a suspensão celular a intervalos de 15 minutos para garantir uma marcação uniforme das células. Ao final da incubação, lave as células marcadas com 14 mililitros de BSS suplementado com FBS.Após a centrifugação, remova o sobrenadante, agite suavemente o tubo e re-suspenda o pellet em um a três mililitros de BSS à temperatura ambiente suplementado com FBS. Durante a centrifugação, coloque uma coluna de separação em um suporte magnético e acople uma agulha estéril de 21 gauge à extremidade da coluna para reduzir a taxa de fluxo. Equilibre a coluna com dois mililitros de BSS à temperatura ambiente.Após a re-suspensão do pellet em um a três mililitros de BSS à temperatura ambiente, coloque o tubo de coleta sob a agulha e, em seguida, adicione as células marcadas com B na coluna equilibrada. Colete o fluxo que atravessa em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, lave a coluna com um mililitro de BSS fresco suplementado com FBS.Reunindo a lavagem com as células-alvo coletadas, recarregue a coluna com a alueta contendo as células-alvo, coletando o fluxo passante no mesmo tubo de 15 mililitros. Em seguida, lave a coluna três vezes com um mililitro de BSS suplementado com FBS, continuando a reunir as lavagens com a suspensão de células-alvo. Após a terceira lavagem, remova a coluna do ímã e carregue-a com cinco mililitros de BSS suplementado com FBS.Usando o êmbolo da coluna para transferir as células não alvo marcadas magneticamente para um novo tubo de 15 mililitros. Em seguida, verifique a pureza das células separadas por citometria de fluxo. Para reutilizar uma coluna de separação, após a eluição das células marcadas com microesferas magnéticas, lave a coluna três vezes a partir do topo com cinco mililitros de PBS por lavagem e três vezes com cinco mililitros de água destilada por lavagem.Em seguida, lave a coluna com cinco mililitros de etanol a 70 por cento da mesma maneira e use uma torneira de ar para secar completamente a coluna antes do armazenamento. Para reutilizar a coluna em um novo experimento de purificação, lave novamente a coluna de baixo para cima com cinco mililitros de etanol a 70 por cento, seguido por duas lavagens com cinco mililitros de PBS. Em seguida, adicione cinco mililitros de PBS no topo da coluna para uma lavagem final.E equilibre a coluna com dois mililitros de BSS à temperatura ambiente. Em seguida, a coluna pode ser carregada com a população celular experimental. Para marcar as células B purificadas com CFSE, lave as células duas vezes com solução de marcação recém-preparada em um tubo cônico de 15 mililitros.Re-suspendendo o segundo pellet numa concentração de duas vezes 10 elevado à sétima células por mililitro em solução de marcação fresca a 37 graus celsius. Em cada etapa, centrifugar as amostras, remover o sobrenadante e agitar suavemente os tubos. Em seguida, marcar as células numa proporção de uma parte de suspensão celular para uma parte de solução fresca de CFSE 10 micromolar, em ambiente escuro, durante 10 minutos a 37 graus celsius.Inverta o tubo a cada dois minutos para garantir uma distribuição uniforme do corante. Deve-se ter cuidado para assegurar que o pellet celular esteja completamente suspenso na solução de marcação. Aglomerados celulares podem afetar a homogeneidade da marcação com CFSE.No final da incubação, adicione meio RPMI para inativar o CFSE e lave as células duas vezes em vários volumes de meio RPMI completo gelado. Se as células foram marcadas com sucesso, o pellet será amarelo. Em seguida, lave duas vezes uma placa de 96 poços com fundo plano revestida com o estímulo apropriado em PBS.Para linfócitos B marcados com CFSE, re-suspenda em meio RPMI completo a uma concentração de três vezes 10 à sexta potência de linfócitos B por mililitro e semeie 100 microlitros de linfócitos B por poço em placa revestida, em triplicata, por 72 horas. Por este método de esgotamento, a pureza dos linfócitos T OT1-CD8 isolados com microesferas pode ser aumentada de 72,8 por cento para 94,2 por cento. As células podem então ser marcadas com CFSE conforme demonstrado anteriormente e transferidas adotivamente para animais receptores para análise de sua proliferação in vivo.Além disso, a marcação com anticorpo anti-CD45.1 pode ser usada para confirmar ainda mais a identidade das células que expressam CFSE como linfócitos T CD8 OT1 doadores, positivos para CD45.1, transferidos adotivamente nos órgãos linfoides de camundongos receptores. Alternativamente, os linfócitos T purificados podem ser estimulados in vitro e sua proliferação pode ser avaliada pela incorporação de timidina tritiada. Um aumento significativo na pureza das células B esplênicas também é obtido por este método.Facilitar oportunidades semelhantes para análises funcionais subsequentes das células B purificadas. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em duas horas. Ao realizar este procedimento, é importante manter sua suspensão de CI sempre em gelo, exceto durante a purificação e a marcação com CFSE.Linócitos purificados também podem ser utilizados em outros ensaios funcionais, como imunomarkação, para avaliar a capacidade de sinalização do terminal de linfócitos modificados geneticamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma ideia mais clara de como purificar células B e T e como utilizar essas células em diversos ensaios funcionais in vitro e in vivo.

isolation-and-activation-of-murine-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Isolamento de linfócitos usando a Miltenyi MACs kit é uma maneira confiável para purificar as células de todo homogeneizados de tecido linfóide. Células purificadas usando o sistema Miltenyi são tipicamente ≥ 96% pura. Aqui, nós demonstrar as medidas tomadas para isolar células CD4 + T, um dos muitos kits oferecidos pela Miltenyi.

Isolamento de células T CD4 + a partir dos nós linfáticos rato Usando Miltenyi Purificação MACS

Neste vídeo, demonstramos o procedimento de ativação CD40-e expansão de células B murino de esplenócitos de camundongos C57BL / 6, que pode ser usado como um modelo de células apresentadoras de antígenos (APC) para estudar a indução de imunidade.

Modelo murino de CD40-ativação de células B

Nós apresentamos um protocolo para a produção de antígenos específicos do mouse células T usando transdução...

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

Uma maneira eficiente de isolar linfócitos a partir do tracto genital rato é descrito. Este método tira vantagem da digestão enzimática e separação por gradiente de Percoll para permitir o isolamento eficaz. Esta técnica é também adaptável para utilização em espécies de...

O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

Existe um interesse crescente na compreensão das funções imunológicas de subpopulações específicas de células em placas de Peyer (PP), os locais primários indutivos de tecidos linfóide associado ao intestino. Aqui destacamos protocolos paralelos para preparar PP preparações de células individuais para análise por citometria de fluxo e criosseções PP para imunocoloração.

Isolar e imunocoloração linfócitos e células dendríticas a partir de placas de Peyer Murino

Descrevemos aqui um método eficaz para o isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo do rato (TEC). O protocolo pode ser utilizada para estudos da função do timo para o desenvolvimento normal das células T, disfunção do timo, e a reconstituição de células T.

Isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo murino

O isolamento de células estromais de linfonodos é um procedimento de várias etapas, incluindo digestão enzimática e desagregação mecânica para obter células reticulares fibroblásticas, células linfáticas e endoteliais sanguíneas. No procedimento descrito, uma digestão curta é combinada com desagregação mecânica automatizada para minimizar a degradação do marcador de superfície das células estromais viáveis dos linfonodos.

Isolamento de Murino Linfonodo células estromais

Derivados de monócitos DC (MoDC) podem sentir pequenas quantidades de moléculas associadas a perigo e facilmente, portanto, estão prontos. Nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de MoDC do sangue, tumores e sua ativação com complexos imunes ao destacar as principais precauções que devem ser consideradas para evitar sua ativação prematura.

Protocolo de isolamento de células dendríticas derivadas de monócitos de rato e sua ativação subsequente em Vitro com Tumor de imunocomplexos

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de linfócitos de sites indutivos incluindo o tecido linfoide associado intestino de Peyer e os drenagem linfonodos mesentéricos e os sites de efetor incluindo a propria do lamina e o epitélio intestinal do sistema imunitário intestinal pequeno.

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

Este artigo descreve um método para isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais murinas de capilares linfáticos dérmicos. As células endoteliais linfáticas isoladas podem ser usadas para experimentos in vitro a jusante e análise de expressão de proteínas.

Isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

O presente estudo apresenta protocolos para avaliar o compromisso de destino precoce de células TFH específicas do vírus e manipular a expressão gênica nessas células.

Acesso à diferenciação precoce de células T CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo

Aprenda a purificar linfócitos murinos com microesferas magnéticas anti-CD43 para estudos de imunologia e biologia molecular. Este método permite análises funcionais in vitro e in vivo com mínimo estresse celular.

Isolamento e Activação de Linfócitos murinos

Explorar mais vídeos