Isolamento e Activação de Linfócitos murinos
30 de outubro de 2016
Os linfócitos são os principais atores nas respostas imunes adaptativas. Aqui, apresentamos um protocolo de purificação de linfócitos para determinar as funções fisiológicas das moléculas desejadas na ativação de linfócitos in vitro e in vivo. Os procedimentos experimentais descritos são adequados para comparar as capacidades funcionais entre linfócitos controle e geneticamente modificados.
O objetivo geral deste experimento é estudar as capacidades funcionais de linfócitos murinos purificados usando vários ensaios funcionais in vitro e in vivo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nas áreas de Imunologia e Biologia Molecular. Como investigar a função de uma proteína de interesse em linfócitos deficientes em genes.
A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de purificar rapidamente os linfócitos com o mínimo de manipulação e estresse ambiental. Para purificar as células B, ressuspenda até uma vez dez elevado ao oitavo glóbulo vermelho, células inteiras do baço em 300 microlitros de solução salina balanceada ou BSS suplementada com FBS. Em seguida, adicione 50 microlitros de microesferas magnéticas anti-CD43.
Para remover as células mortas, adicione 30 microlitros de anexina cinco esferas magnéticas por 30 minutos a quatro graus Celsius. Agite a suspensão da célula em intervalos de 15 minutos para garantir uma rotulagem uniforme das células. No final da incubação estavam as células marcadas com B com 14 mililitros de BSS suplementadas com FBS.
Após a centrifugação, remova o sobrenadante, sacuda o tubo e ressuspenda o pellet em um a três mililitros de BSS à temperatura ambiente suplementado com FBS. Durante a centrifugação, carregue uma coluna de separação em um rack magnético e conecte uma agulha estéril de calibre 21 na ponta da coluna para reduzir a taxa de fluxo. Equilibre a coluna com dois mililitros de BSS à temperatura ambiente.
Depois de ressuspender o pellet em um a três mililitros de temperatura ambiente, o BSS coloca o tubo de coleta sob a agulha e carrega as células marcadas com B na coluna equilibrada. Colete o fluxo em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, enxágue a coluna com um mililitro de BSS fresco suplementado com FBS.
Agrupando a lavagem com as células-alvo coletadas, recarregue a coluna com a célula-alvo contendo aluet, coletando o fluxo no mesmo tubo de 15 militeres. E lave a coluna três vezes com um mililitro de BSS suplementado com FBS, continuando a agrupar as lavagens com uma suspensão de células-alvo. Após a terceira lavagem, remova a coluna do ímã e carregue-a com cinco mililitros de BSS suplementado com FBS.
Usando o êmbolo de coluna para lavar as células não-alvo marcadas magneticamente em um novo tubo de 15 mililitros. Em seguida, verifique a pureza das células separadas por citometria de fluxo. Para reutilizar uma coluna de separação, após lavar as células rotuladas com esferas magnéticas, lave a coluna três vezes a partir do topo com cinco mililitros de PBS por lavagem e três vezes com cinco mililitros de água destilada por lavagem.
Em seguida, lave a coluna com cinco mililitros de etanol a 70% da mesma maneira e use uma torneira de ar para secar completamente a coluna antes do armazenamento. Para reutilizar a coluna em um novo experimento de purificação, lave novamente a coluna de baixo para cima com cinco mililitros de etanol a 70%, seguidos por duas lavagens de PBS de cinco mililitros. Em seguida, carregue o topo da coluna com cinco mililitros de PBS para uma lavagem final.
E equilibre a coluna com dois mililitros de BSS à temperatura ambiente. A coluna pode então ser carregada com a população de células experimentais. Para rotular as células purificadas B com CFSE, lave as células duas vezes com uma solução de marcação recém-preparada em um tubo cônico de 15 mililitros.
Ressuspendendo o segundo pellet em duas vezes 10 elevado à sétima concentração de células por mililitro em solução de marcação fresca de 37 graus Celsius. Centrifugar as amostras, retirar o sobrenadante e sacudir os tubos. Em seguida, rotule as células em uma parte de suspensão celular para uma parte de solução CFSE de 10 micromolares recém-preparada no escuro por 10 minutos a 37 graus Celsius.
Inverter o tubo a cada dois minutos para garantir uma distribuição uniforme do corante. Deve-se tomar cuidado para garantir que o pellet celular esteja completamente suspenso em uma solução de rotulagem. Os aglomerados celulares podem afetar a homogeneidade da marcação do CFSE.
No final da incubação, adicione o meio RPMI para extinguir o CFSE e lave as células duas vezes em vários volumes de meio RPMI completo gelado. Se as células foram rotuladas com sucesso, o pellet será de cor amarela. Em seguida, lave uma placa de fundo plano de 96 poços revestida com o estímulo apropriado duas vezes em PBS.
Para células B marcadas com CFSE, ressuspenda para três vezes 10 as sextas células B por mililitro e complete o meio RPMI e semeie 100 microlitros de células B por poço na placa revestida em triplicado por 72 horas. Por este método de depleção, a pureza das células T OT1-CD8 isoladas em esferas pode ser aumentada de 72,8% para 94,2%. As células podem então ser marcadas com CFSE como recém-demonstrado e transferidas adotivamente para animais receptores para análise de sua proliferação in vivo.
Além disso, a marcação de anticorpos anti-CD45.1 pode ser usada para confirmar ainda mais a identidade das células que expressam CFSE como as células T OT1-CD8 positivas para CD-45.1 do doador transferidas adotivamente nos órgãos linfóides de camundongos receptores. Alternativamente, as células T purificadas podem ser estimuladas in vitro e sua proliferação pode ser avaliada pela incorporação de timidina tritiada. Um aumento significativo na pureza das células B esplênicas também é alcançado por este método.
Facilitar oportunidades semelhantes para análise funcional a jusante das células B purificadas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em duas horas. Ao realizar este procedimento, é importante manter sua suspensão de CI congelada o tempo todo, exceto durante a purificação e a rotulagem CFSE.
Os linfócitos purificados também podem ser usados em outros ensaios funcionais, como immunoblotting para a capacidade de sinalização terminal de linfócitos geneticamente modificados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma ideia melhor de como purificar as células B e T e como usar as células para vários ensaios funcionais in vitro e in vivo.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo de purificação de linfócitos destinado ao estudo das funções fisiológicas dos linfócitos em ambientes in vitro e in vivo. O método permite a comparação das capacidades funcionais entre linfócitos controle e linfócitos geneticamente modificados.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Biologia Molecular
Contexto
- Os linfócitos são cruciais para as respostas imunes adaptativas.
- Compreender a função dos linfócitos é essencial para o avanço da pesquisa imunológica.
- As técnicas de purificação podem minimizar a manipulação e o estresse sobre as células.
Objetivo do Estudo
- Investigar as capacidades funcionais de linfócitos murinos purificados.
- Explorar o papel de proteínas específicas em linfócitos deficientes em genes.
- Ampliar a compreensão dos mecanismos de ativação de linfócitos.
Métodos Utilizados
- Purificação de células B a partir de células esplênicas totais utilizando microesferas magnéticas.
- Ressuspendimento de células esplênicas em solução salina balanceada suplementada com soro bovino fetal (FBS).
- Aplicação de microesferas magnéticas anti-CD43 para o isolamento de linfócitos.
- Realização de diversos ensaios funcionais in vitro e in vivo.
Principais Resultados
- Purificação bem-sucedida de linfócitos com estresse ambiental mínimo.
- Capacidade de comparar as capacidades funcionais de diferentes populações de linfócitos.
- Conhecimentos sobre os papéis fisiológicos de moléculas específicas na ativação de linfócitos.
Conclusões
- O protocolo de purificação é eficaz para o estudo das funções dos linfócitos.
- Este método pode facilitar pesquisas sobre linfócitos geneticamente modificados.
- Estudos adicionais podem aprimorar nossa compreensão das respostas imunes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento e ativação rápidos de linfócitos murinos permitem uma investigação funcional precisa de populações de células imunes, apoiando a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta de fármacos com foco em imunologia. A capacidade do protocolo de gerar linfócitos B e T altamente purificados com manipulação mínima facilita a avaliação reprodutível e quantitativa da sinalização imune e da proliferação. Essa capacidade é fundamental para a triagem de portfólios e o avanço de modelos geneticamente modificados em fluxos pré-clínicos de imunologia.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a comparação direta de linfócitos controle e deficientes em gene para validação funcional do alvo.
- Auxilia na redução de riscos mecanicistas ao isolar o impacto de modificações genéticas específicas na função das células imunes.
- Facilita a investigação orientada por hipóteses das vias de sinalização imune em sistemas relevantes para a doença.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Fornece populações altamente purificadas de linfócitos para ensaios funcionais padronizados in vitro e in vivo.
- Permite a medição reprodutível de proliferação e sinais de ativação utilizando marcação com CFSE e imunoblotagem.
- Permite a escalabilidade do ensaio e a reutilização da plataforma para triagem de compostos e estudos de modulação imunológica.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com estratégias translacionais de biomarcadores ao permitir a avaliação funcional de respostas imunes em modelos geneticamente modificados.
- Garante continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, apoiando transferência adotiva in vivo e rastreamento de proliferação.
- Reduz o risco biológico ao fornecer dados quantitativos e reprodutíveis sobre a função de células imunes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao fornecer populações validadas de células imunes para estudos mecanicistas, de triagem e translacionais subsequentes.
- Biologia Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias por meio de ensaios funcionais com linfócitos purificados.
- Triagem: Fornece populações celulares prontas para ensaio e reproduzíveis para avaliação quantitativa de respostas imunes.
- Análises: Permite a medição de proliferação e sinais celulares para comparação entre condições genéticas ou tratamentos.
- Pesquisa Translacional: Facilita o rastreamento in vivo e a avaliação funcional de linfócitos transferidos adotivamente.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado para o isolamento de células imunes aplicável em múltiplos programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos imunológicos e reduz a ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Permite a purificação rápida, padronizada e reprodutível de linfócitos para estudos de alto rendimento.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção de projetos e a eficiência do capital ao possibilitar ensaios funcionais robustos.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco de ativos em imunologia por meio de dados quantitativos e comparativos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manuseio de células imunológicas e na citometria de fluxo para avaliação da pureza.
- Necessita de acesso a instrumentação de separação magnética de células e plataformas analíticas para ensaios funcionais.
- Exige padronização entre equipes nos protocolos de marcação celular e ensaios para garantir reprodutibilidade.
- Adaptável a diversos modelos murinos e fundos genéticos mediante otimização do protocolo.
- Depende de manuseio cuidadoso para minimizar o estresse celular e manter a integridade funcional.
