Caracterização fenotípica dos macrófagos a partir de rim de rato por Citometria de Fluxo
18 de outubro de 2016
Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para fenotípica e análise quantitativa de macrófagos residentes de rins de ratos por citometria de fluxo. As células marcadas resultantes podem também ser utilizados para outras aplicações, incluindo a separação de células, a análise da expressão do gene ou estudos funcionais, aumentando, assim, a informação obtida no modelo experimental.
O objetivo geral deste procedimento é quantificar e caracterizar macrófagos residentes de rins de ratos por citometria de fluxo. Este método pode ter resposta a perguntas-chave na fluidez, como qual é a contribuição de cada macráfago do tipo na lesão renal. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a cateterização renal de diferentes marcadores proteicos. Assim, limitando o de integridade celular de Demonstrando o procedimento estarão Elena Olivares, A.P.A.S.D.estudante da Universidade Complutense e Melania Guerrero, A.P.A.S.D.estudante de Para perfusão e extração renal, comece beliscando uma pequena dobra de pele para confirmar que o rato atingiu o nível adequado de sedação. E cubra os olhos com pomada veterinária. Coloque o animal em uma mesa cirúrgica em decúbito dorsal. E molhe o abdômen com 70% de etanol. Em seguida, faça uma incisão central através da pele abdominal e do peritônio do púbis até a caixa torácica para expor as cavidades pleural e abdominal. Use o sistema de perfusão para injetar solução salina a 0,9% na aorta abdominal para lavar os rins. Cortar a aorta no abdômen para ajudar a liberar o sangue. Quando todo o sangue tiver sido removido dos rins, corte o hilo renal. Em seguida, pressione a borda de cada rim para desencapsular cuidadosamente os órgãos. E transfira os rins extraídos para H.B.S.S.To fresca gere uma única suspensão de células renais, use uma tesoura para cortar metade de um rim em pequenos fragmentos. Transfira os pedaços de tecido para um tubo de 1,5 mL e adicione 1 mL de colagenase recém-preparada ao tubo para uma incubação de 30 minutos a 37
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Visão Geral
Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para análise fenotípica e quantitativa de macrófagos residentes de rins de rato por citometria de fluxo. As células coradas resultantes podem ser utilizadas para diversas aplicações, ampliando as informações obtidas no modelo experimental.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Imunologia
- Biologia Celular
Antecedentes
- Os macrófagos desempenham um papel crucial na saúde e na doença renal.
- A citometria de fluxo permite uma análise detalhada das populações celulares.
- Compreender o comportamento dos macrófagos pode orientar estratégias terapêuticas.
- Modelos com ratos são comumente utilizados para estudar as funções renais.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para o isolamento e análise de macrófagos renais.
- Facilitar pesquisas futuras sobre as funções dos macrófagos em contextos renais.
- Fornecer um recurso para pesquisadores em áreas relacionadas.
Métodos Utilizados
- Citometria de fluxo para análise celular.
- Técnicas de coloração para identificação de macrófagos.
- Protocolos para separação celular e análise de expressão gênica.
- Estudos funcionais para avaliar a atividade de macrófagos.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de macrófagos residentes dos rins de ratos.
- Caracterização detalhada dos fenótipos de macrófagos.
- Aplicações potenciais em estudos de expressão gênica e funcionais.
- Melhor compreensão dos papéis dos macrófagos na saúde renal.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para análise de macrófagos.
- Os resultados podem orientar futuros estudos sobre doenças renais.
- A pesquisa pode ser expandida para outras aplicações além da citometria de fluxo.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A caracterização fenotípica precisa de subpopulações de macrófagos em modelos de doenças renais é fundamental para reduzir os riscos na validação de alvos em patologias renais impulsionadas pela inflamação. Este protocolo de citometria de fluxo permite a discriminação quantitativa de fenótipos de macrófagos pró-inflamatórios (M1) e imunorregulatórios (M2) em rins de ratos, contribuindo para o entendimento mecanicista da fibrose e da modulação imune. Ao fornecer um método confiável para avaliar a participação dos macrófagos na lesão renal, esta abordagem reforça a confiabilidade preditiva na seleção pré-clínica de alvos e na investigação de vias moleculares.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação das proporções de macrófagos M1/M2 em modelos de lesão renal.
- Valor Operacional: Utiliza o direcionamento duplo por CD45/CD68 com coloração de superfície para CD86/CD163 para definir fenótipos de macrófagos com alta especificidade.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos em alvos terapêuticos ao associar estados de polarização de macrófagos a vias de fibrose e imunorregulação.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para ensaio: Gera saídas padronizadas e quantitativas de citometria de fluxo para frequência de macrófagos e expressão de marcadores.
- Reprodutibilidade: Demonstra baixa mortalidade celular e integridade preservada, permitindo leituras fenotípicas consistentes entre experimentos.
- Utilidade para análises complementares: Macrófagos isolados permanecem viáveis para separação celular, análise de mRNA e proteínas, permitindo acompanhamento com abordagens multi-ômicas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Aplicável diretamente a modelos de doenças renais inflamatórias em que fenótipos de macrófagos impulsionam a patogênese.
- Continuidade Translacional: Dados fenotípicos de macrófagos classificados podem orientar a descoberta de biomarcadores e a validação funcional em estudos pré-clínicos.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Permite avaliação objetiva dos efeitos de compostos imunomoduladores na polarização de macrófagos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a avaliação pré-clínica, fornecendo leituras imunológicas que orientam a otimização do fármaco líder e estudos sobre o mecanismo de ação em modelos de doenças renais.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses sobre vias mediadas por macrófagos na lesão renal por meio da quantificação fenotípica.
- Triagem: Fornece dados quantitativos reprodutíveis sobre macrófagos, adequados para validação de ensaios e campanhas de triagem de compostos.
- Análises: Fornece leituras multiparamétricas de citometria de fluxo (CD45+/CD68+/CD86+ para M1; CD45+/CD68+/CD163+ para M2), permitindo análise comparativa entre grupos.
- Pesquisa Translacional: Conecta o fenotipamento de macrófagos a ensaios funcionais subsequentes e ao perfil de expressão gênica em sistemas relevantes para a doença.
- Reutilização Corporativa: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado de imunofenotipagem aplicável a múltiplos modelos de doenças renais e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista nas lesões renais mediadas por macrófagos ao permitir uma discriminação fenotípica precisa.
- Valor Operacional: Oferece isolamento e coloração padronizados de macrófagos, com baixa variabilidade, compatíveis com instalações centrais de citometria de fluxo.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou não ao vincular a modulação do alvo a mudanças mensuráveis na polarização de macrófagos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos imunomoduladores com base na modulação do fenótipo de macrófagos em modelos pré-clínicos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em compensação de citometria de fluxo, estratégia de seleção de eventos (gating) e validação de marcadores de macrófagos.
- Depende do acesso a equipamentos para digestão com colagenase e infraestrutura estéril para processamento celular.
- Necessita padronização de painéis de anticorpos e controles de fluorescência entre diferentes locais para quantificação reprodutível de M1/M2.
- A adaptação a outros tecidos pode exigir otimização de enzimas de dissociação e painéis de marcadores.
- Limitado pela disponibilidade de marcadores de macrófagos específicos para ratos (CD86, CD163), em comparação com os repertórios murinos mais extensos.
