Subcelulares Gravações patch-clamp do domínio somatodendrítico da substância negra dopamina Neurônios

Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurobiologia, como como os canais iônicos dependentes de voltagem individuais contribuem para as funções de um neurônio específico. A principal vantagem desta técnica é que ela permite que a função dos canais iônicos seja mapeada no nível subcelular nos neurônios. Comece este procedimento colocando o cérebro em uma placa de Petri de 9 centímetros com o fundo coberto com uma camada de SiliGuard.

Em seguida, envolva o cérebro com sacarose gelada-ACSF. Para preparar fatias coronais, faça dois cortes para remover o cerebelo e a parte rostral do cérebro. Em seguida, aplique cola de cianoacrilato na bandeja da amostra e cole o bloco cerebral na bandeja de forma que a parte rostral fique voltada para o estágio de fatiamento.

Em seguida, aplique algumas gotas de sacarose-ACSF no cérebro e mergulhe lentamente a bandeja na câmara de corte. Depois, ajuste a lâmina de barbear em um ângulo de 15 graus em relação ao plano horizontal. Corte fatias de cérebro coronal de cerca de 500 micrômetros na direção nasal do coto antes de atingir a substância negra.

Em seguida, ajuste a espessura para cortar fatias de 300 micrômetros contendo a região de interesse. Separe as fatias do bloco de tecido com uma agulha de profusão muito fina presa a uma seringa paralela à borda da lâmina de barbear. Em seguida, transfira as fatias para a câmara de reserva a 34 graus Celsius por uma hora.

Neste procedimento, transfira uma fatia de cérebro para a câmara de gravação. Fixe a fatia na parte inferior da câmara de gravação com um anel de platina e certifique-se de que a fatia seja de boa qualidade com uma superfície lisa e uniforme. Em seguida, selecione um neurônio com um dendrito que se estende por uma longa distância no mesmo plano e certifique-se de que o dendrito de interesse possa ser seguido até um soma bem definido.

Em seguida, encha a pipeta de remendo com solução de eletrodo. Para remendar o dendrito no modo ligado à célula, identifique e concentre-se em uma parte do dendrito. Aplique pressão positiva na pipeta e abaixe-a usando o micro manipulador.

Em seguida, posicione a pipeta perto da membrana e ajuste a pressão para criar uma pequena covinha. Em seguida, libere a pressão na ponta da pipeta e remende o dendrito, enquanto controla a resistência da pipeta. Tente obter uma resistência de vedação maior que um gigaohm, na melhor das hipóteses entre três e dez gigaohms, para gravações conectadas a células.

Depois, retraia a pipeta para longe da membrana, por alguns micrômetros, para evitar a deformação do dendrito. As correntes de ação vistas aqui representam os potenciais de ação espontânea dos neurônios nigrais. Para suprimir as correntes de ação, aplique bloqueadores dos canais de cálcio e sódio na ACSF.

Em seguida, aplique um passo de tensão de 90 milivolts, a partir de um potencial de retenção de zero milivolts, para evocar a corrente catiônica ativada por hiperpolarização. No final da gravação, rompa o patch para obter o modo de célula inteira. Depois disso, retire lenta e suavemente a pipeta dendrítica da membrana neuronal para obter um remendo de fora para fora.

Para registrar a partir do soma correspondente no modo de célula inteira, localize o soma correspondente do dendrito. Abaixe uma pipeta com resistência entre cinco a dez megaohms com uma solução intracelular à base de potássio para o corpo celular. Em seguida, aplique uma breve pressão negativa na ponta da pipeta para romper a membrana a fim de obter o modo de célula inteira.

Verifique a identidade do neurônio no modo de pinça de corrente aplicando longas etapas de corrente hiper e despolarizante e permita que a biocitina da pipeta se difunda ao longo dos dendritos. Após 10 minutos, retire a pipeta para obter um adesivo de fora para fora. Use uma sequência de movimentos laterais curtos para cima para favorecer o fechamento adequado da membrana celular, uma vez que a pipeta esteja acima da fatia, para sair completamente da câmara de registro.

Manter a fatia na câmara de registo durante mais 15 minutos em ACSF padrão para permitir o equilíbrio da biocitina e do neurónio registado. Em seguida, transfira suavemente a fatia para um frasco de vidro âmbar de 25 mililitros contendo ACSF padrão para histologia. Neste procedimento, localize aproximadamente o neurônio marcado com fluorescência na fatia com epifluorescência.

Examine brevemente a árvore dendrítica dos neurônios e localize o axônio e a bolha axonal usando uma objetiva de 10X. Em seguida, mude para o microscópio confocal e selecione o diodo laser de 488 nanômetros para excitar o neurônio marcado. Siga a extensão do axônio e dos dendritos no eixo Z e registre imagens sucessivas para obter uma pilha Z para toda a célula.

Ajuste a resolução do eixo Z e colete as imagens confocais da célula em uma ampliação baixa e alta. No final, abra o arquivo de imagem do neurônio com um software de imagem. Compare a imagem de projeção Z com uma imagem IR-DGC a olho nu para localizar a posição precisa da pipeta de adesivo durante o registro eletrofisiológico.

Aqui é mostrada a imagem IR-DGC de um neurônio dopaminérgico e uma pipeta no dendrito proximal. O traço de corrente mostra a capacidade das correntes de fuga EN em resposta a um comando de tensão de cinco milivolts, na configuração conectada à célula, com a resistência de vedação de cinco gigaohms. O passo de tensão hiperpolarizante, a partir de um potencial de membrana de zero milivolts, induziu uma corrente catiônica ativada por hiperpolarização de ativação lenta.

O traço de corrente foi invertido e ajustado com uma única função exponencial, dando uma constante de tempo de 632 milissegundos. Aqui estão as respostas de voltagem de toda a célula registrada soma a pulsos de corrente hiper e despolarizantes de um segundo na presença de bloqueadores de corrente de sódio e cálcio dependentes de voltagem para remover potenciais de ação durante a gravação anexada à célula. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em um dia, se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de obter tecido saudável e condições de registro estáveis. Após esse procedimento, outros métodos, como a imuno-histoquímica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a identidade do neurônio registrado. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurofisiologia explorarem a função das propriedades e o papel dos canais iônicos dependentes de voltagem em células excitáveis.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como registrar e examinar a distribuição de correntes que fluem através de canais iônicos dependentes de voltagem em dendritos.