Name: Subcelulares Gravações patch-clamp do domínio somatodendrítico da substância negra dopamina Neurônios (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprenda gravações patch-clamp subcelulares em dendritos de neurônios dopaminérgicos da substância negra. Este método permite mapear a função de canais iônicos em nível subcelular para estudar sinalização neuronal.

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Agradeço ao Dr. Vincent Seutin por seu apoio constante, Christelle Gillissen e Laurent Massotte para excelente assistência técnica, Drs Jean Defourny e Sandra Ormenese para conselhos com o microscópio confocal, Dr Jacques destinar para o dom do segundo amplificador Axopatch 200B, o GIGA-Imaging plataforma para compartilhar o microscópio confocal e software Imaris e Dr. Stephen Freeman pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por subsídios da FRS belgas - FNRS (U.N002.13 e T.N0015.13) e publicado com o apoio da Fundação Universidade belga (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique).

O autor declara que ele não tem interesses financeiros concorrentes.

Este relatório descreve um protocolo passo-a-passo para implementar gravações de célula inteira somatodendríticos duplas e gravações dendríticas locais. É útil para a determinação da influência de canais iónicos (isto é, I h) sobre o decurso de tempo de potenciais pós-sinápticos e mapeamento da distribuição do canal de iões (I h) ao longo do domínio somatodendrítico de neurónios da substância negra de DA, respectivamente. Resultantes medidas eletrofisiológicas são combinados para deixar histoquímica hoc para recuperar a morfologia das células. O procedimento foi utilizado para investigar neurónios DA localizados na substantia nigra, mas podem ser generalizados para os neurónios da substância negra vizinhos GABA, área tegmental ventral neurónios DA ou outros neurónios do mesencéfalo. Todas as etapas também podem ser seguidas para examinar outros canais iônicos expressos em dendrites dos neurónios da substância negra, sem modificações importantes. Visualização post hoc é particularmente pertinente para os neurônios com axônio-bearingdendrites, como neurônios da substância negra 25,26, hipocampo interneurônios Oriens-alveus 21 ou alguns neurônios piramidais CA1 67. Curiosamente, os neurônios que partilham esta característica parece ser mais comum do que geralmente se pensa 67. A análise morfológica revela também a posição precisa dos eletrodos e axônio. A detecção do último pode ser otimizado pela rotulagem de proteínas expressas no segmento axônio inicial (canais de Na + dependentes de voltagem ou Ankyrin G) usando imunohistoquímica 68,69. A fiabilidade dos dados recolhidos com as gravações dendríticas e rotulagem neuronal subsequente, invariavelmente, depende da qualidade fatia. Esforço máximo deve, pois, ser aplicado para preservar a viabilidade das células no tecido. Isto é conseguido com a manipulação suave de animais saudáveis, ferramentas de alta qualidade e reagentes, oxigenação suficiente das temperaturas de tecidos e geladas ao longo da preparação de fatias. condições de gravação estáveis ​​contam com a seleção de neurônios saudáveis. No modo de célula inteira, resistência em série inicialmente deverá ser tão baixo quanto possível e mantida constante ao longo da experiência. A estabilidade das gravações é mais dependente manipuladores de alta qualidade desprovidas de deriva e vibrações. Estas perturbações podem ser reduzidas através da optimização da estabilidade pipeta: verificar a ligação ao suporte da pipeta e a headstage, controlar que os cabos são micromaniplador folga, evitando alterações bruscas de temperatura ou o movimento fase e verificar o mecanismo do manipulador. Para as gravações dupla, metilsulfato 13,15,21 foi incluído na solução intracelular, mas gluconato 9,14,25 pode ser alternativamente empregue. No entanto, o principal anião podem alterar o potencial de membrana 70,71 e algumas correntes dependentes de voltagem 72. solução intracelular pode ser suplementado com ATP, GTP e fosfocreatina para preservar a physiolofunções gicos dos neurônios. Além disso, a adição de um corante fluorescente na solução de pipeta (por exemplo, Alexa 594 ou Sulforodamina 101 41) para visualizar os dendritos durante uma gravação somática pode ser útil, por exemplo para colocar um pedido de pressão (Figura 7 em Ref. 41) ou um estimulante eléctricos pipeta. A solução de pipeta para gravações ligado à célula contém uma alta concentração de K + e nenhum Na + para gravar grande I h. Digno de nota a proporção da concentração de Na + / K + influencia a amplitude da corrente 10, o potencial de inversão da corrente 11 e a propagação de h I 73. Como alternativa, eu h também podem ser gravados utilizando fora-outs 10. Nesta configuração de gravação no entanto, o meio intracelular na proximidade dos canais pode ser perturbado. Por conseguinte, as diferenças na activação dependente de voltagem de I &lt;sub&gt; h é observado quando as correntes comparando obtidos utilizando manchas ligado à célula e fora-outs 10. Inchaço dos neurônios é ocasionalmente encontrada durante a gravação de patch-clamp, e muitas vezes surge de causas distintas, tais como a baixa qualidade da água, forte desequilíbrio da osmolaridade ou pH entre a soluções de 39 ou erros intra e extracelular na composição de soluções. A qualidade dos registos electrofisiolicos tem uma incidência directa sobre a qualidade da morfologia de neurónios recuperados. Alta resistência pipetas somáticas são utilizados para gravações duplas (6 - 10 mohms, como nas refs 6,11.) E para gravações somáticos simples após gravações ligado de células para minimizar a diluição do meio intracelular 14. A gravação somática de célula completa após a gravação ligado de células é, portanto, mantido curto (&lt;10 min). patches de fora para fora de ambos os somáticas e dendríticas pipetas são essenciais para o fecho do cmembrana ell e subsequente recuperação da morfologia celular. Além disso a estrutura da célula, o conteúdo neuroquímica pode ser determinado para os neurónios gravados 59,74. Por exemplo, a proteína intracelular tirosina-hidroxilase pode ser immunolabeled para a identificação inequívoca dos neurónios DA 13. Neurónios DA concentram-se principalmente no SN pars compacta, com uma densidade muito mais baixa presentes no SN pars reticulata, onde eles são misturados com um maior número de neurónios GABA 75. Enquanto o corpo da célula dos neurónios DA é muitas vezes maior do que a de neurónios GABA, a identificação visual destas células com IR-videomicroscopia é incerto e parcialmente impedida pela opacidade da pars compacta. Para ultrapassar estas limitações, a pré-selecção de neurónios DA pode ser facilitada pela utilização de ratos transgénicos que expressam um marcador fluorescente, numa população específica de neurónios (TH 65 ou DAT para neurónios DA, GADpara os neurônios GABA) e iluminação de epifluorescência. Alternativamente, um corante fluorescente pode ser incluída na solução do eléctrodo somática para facilitar a visualização dos dendritos. O aumento da resolução da célula fluorescente é trazida por Nipkow confocal disco giratório 14,22,30 ou microscopia de dois fótons 7 combinados para IR-DGC 6. Várias vantagens estão relacionadas com DGC em comparação com DIC. Em primeiro lugar, na forma de prismas DIC não são requeridos, a imagem IR-DGC pode ser coberto com uma 49,52,53,76 imagem de fluorescência. Em segundo lugar, a DGC pode ser combinado com fotoestimulação e Optogenetics 77. Uma desvantagem de preparação fatia é a preservação da integridade dos neurónios. Neurónios DA alargar as suas dendrites nos três planos do espaço e, portanto, 78,79 truncamento do compartimento dendríticas não pode ser completamente evitada em fatias 80. A escolha da orientação de fatias (coronal, horizontal ou para-sagital) é um trade-off. A origem da inervação eo delineamento experimental devem ser considerados para selecionar a orientação da direita de fatias. patching dendrítica directa é a técnica utilizada para mapear a distribuição de canais de iões funcionais nos diferentes compartimentos das células. Além disso, esta técnica oferece para determinar a variabilidade nas propriedades funcionais dos canais 20. Como complemento a localização e densidade de canais de iões pode ser verificado usando imuno-histoquímica para a luz e microscopia eletrônica níveis 17,23. Essa abordagem também oferece a possibilidade de determinar a densidade de canais em estruturas de pequeno calibre que são inacessíveis para pipetas de patch. No entanto, estes canais pode estar em um estado funcional distinta 24 ou mesmo inativa em comparação com os registados utilizando técnicas de patch-clamp. Ambas as técnicas são, portanto, necessário para obter uma imagem completa da localização e propriedades decanais iônicos em uma região celular específica 17. Com o desenvolvimento de corantes sensíveis à voltagem, imagiologia de tensão foi usado para examinar a propagação de EPSPs de APs e em neurónios em vários locais 81. Como uma alternativa a dupla gravações de patch-clamp, esta abordagem pode ainda ser implementado por dendrites finas que não são acessíveis para pipetas patch, mas exigem uma calibração precisa do sinal e média. Enquanto neurónios DA na SN e área tegmental ventral são amplamente investigada por meio de gravações somáticas no contexto fisiológico e fisiopatológico, as propriedades funcionais das suas dendrites permanece largamente desconhecido em ambas as condições. Aplicação de patches de dendrites foi implementado para os neurónios dopaminérgicos da substância negra por vários grupos com sucesso 13,25,26 e continua a ser o método de escolha para dissecar propriedades excitáveis destas estruturas subcelulares finas 8. gravações dendríticas proporcionar uma maior opportuComunidade de fiscalizar a eficiência ea plasticidade da transmissão sináptica e da plasticidade da excitabilidade dendrítica 82,83.

Os neurónios receber informações sináptica predominantemente nas suas dendrites. Excitatórios e sinais inibitórios sinápticas espalhados do seu local de produção para o local de integração onde potenciais de acção (APs) são evocadas como o sinal de saída. Em seu caminho, potenciais sinápticos são influenciados tanto pela estrutura dos dendritos e da interação entre propriedades da membrana passivos e ativos. A combinação destes parâmetros altamente variáveis aumenta o poder computacional de neurónios 1,2. No entanto, o pequeno diâmetro de dendritos dificulta no entanto, o estudo das suas propriedades eléctricas. O contínuo desenvolvimento da técnica de patch-clamp 3, a óptica 4 e aperfeiçoamento de métodos para a preparação fatia 5 durante as últimas décadas têm permitido gravações de muito fina (0,7-3 mm Ø) dendrites 6,7. Estes métodos eram, e são, em grande parte, ainda usado para examinar a excitabilidade dos dendritos em uma varieneurônios F 8. Gravações dendríticas diretos são essenciais para determinar a distribuição 9-19 e as diferenças nas propriedades funcionais 20-22 de canais iônicos em compartimentos neuronais distintas. Estes dados são o complemento necessário das distribuições de canais de iões detectados com imunohistoquímica combinada à luz e microscopia eletrônica 23,24. Gravações somatodendríticos dupla têm sido implementadas para explorar a propagação dos potenciais de ação 9,13-15,21,22,25-27 e disseminação de potenciais sinápticos 13,16,18 ao longo do domínio somatodendrítico de neurônios, obtenção de modelos de cabos passivos detalhados 28- 30 e investigar a resolução temporal de integração neuronal 31. A substância negra (SN) é uma região localizada no meio do cérebro envolvida em várias funções, tais como o controlo do movimento, a codificação de recompensa e comportamentos habituais. A diminuição de dopamina devido à específicaperda de dopaminérgicos (DA) neurónios no SN está associado com os distúrbios motores observadas em pacientes que sofrem de doença de Parkinson 32. O circuito nigral é composto por dois tipos de células principais: dopaminérgicos e GABAérgicos neurónios. Curiosamente, esses neurônios têm várias características específicas que os distinguem de outros neurônios. O axônio de uma grande proporção de neurônios DA e alguns neurônios GABA origina de um site dendrítica, indicando que o mandril dendrítica é heterogênea (axônio-rolamento e dendrites-falta axônio) 25,26,33. A morfologia desses neurônios contrasta, por conseguinte, com a organização típica de neurônios em que a transferência de informações segue a lei da polarização dinâmica emitida por Cajal: a partir de dendrites, a soma e, finalmente, para axônio 34. Neurónios DA também são conhecidos para a libertação de dopamina a partir de suas dendrites 35, gerar actividade de rotura 36 e 37 plasticidade NMDA-receptor. a dissecçãoção desses fenômenos é evasivo, sem gravações directos a partir do local onde eles são iniciados. Para obter conhecimentos sobre a relação entre a localização precisa e propriedades funcionais dos canais de iões e o seu papel na excitabilidade e informações dendrítica transferência em neurónios da substância negra, gravações dendríticas directos são o método de escolha. Este relatório descreve um procedimento detalhado que pode ser usado para obter gravações de patch-clamp simples e dupla de dendrites dos neurónios da substância negra eo hoc biocitina rotulagem lugar correspondente. Os princípios básicos para remendar o somático e da membrana dendrítica são muito semelhantes. Praticamente no entanto, as gravações de sites dendríticas requerem otimização específica em comparação com gravações somáticas. gravações dendríticas sucedidas dependem da qualidade das fatias, ajuste ideal da óptica, abordagem suave da pipeta patch e estabilidade das gravações.

<table><tbody><tr><td>Água duplamente destilada</td><td>Millipore</td><td>Super Q</td><td>Resistivity >14 M&Omega; cm, ideal 18.2 M&Omega; cm a 25&nbsp; &deg; C, filtrado (0,22 &micro; m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td></tr><tr><td>Velas de microfiltro</td><td>Robu</td><td>Porosidade 3, 6 mm ou 13 mm de diâmetro</td><td></td></tr><tr><td>Fatiador de tecidos com vibrosonda</td> Parâmetros de corte <td>Leica</td><td>VT1200</td><td>: velocidade 0,07, amplitude 1,40</td></tr><tr><td>Fatiador de tecidos</td><td>Dosaka</td><td>DTK-1000</td><td>parâmetros de corte: velocidade 4, frequência 7</td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td>Gilette</td><td>Super Silver</td><td></td></tr><tr><td>Ferramentas de dissecação</td><td>Braun, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara</td><td></td><td></td> de reserva <td>Beckers PP feitos sob medida</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>213-1725</td><td>400 ml</td></tr><tr><td>Filtro de seringa</td><td>Merk Millipore</td><td>Millex - GV 0.22 &micro; m</td><td></td></tr><tr><td>Cola de cianoacrilato&nbsp;</td>Câmara de gravação de <td>cola líquida</td> <td>"Sekunden Kleber"</td> <td>UHU</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Luigs & Extrator</td> de pipetas <td>horizontais Neumann Slice mini câmara</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instruments</td><td>Brown-Flaming P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Hilgenberg</td><td>1807524</td><td>2 mm o.d./1 mm i.d. vidro capilaries, extremidades polidas a fogo, lavadas</td><td></td></tr><tr><td>Cera dental</td><td>Colt&egrave; Tiras</td> de <td>cera ortodônticas para bandejas</td>ne/Whaledent <td></td></tr><tr><td>Grade</td><td></td><td></td> de platina <td>para ancorar fatias na câmara de gravação, feitas sob medida com um disco de platina</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>para polir pontas de pipeta</td></tr><tr><td>de polimento de fogo Metil sulfato de potássio</td><td>MP Biomedicals</td><td>215481</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sondas moleculares</td><td>B1592</td><td></td></tr><tr><td>Manômetro</td><td>GREISINGER eletrônico</td><td>GDH 13 AN</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Zeiss</td><td>FS</td><td></td></tr><tr><td>Dodt Gradiente Contraste</td><td>Luigs & Manipuladores Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Luigs & Neumann</td><td>LN Mini 25</td><td></td></tr><tr><td>Frame grabber</td><td>The Imaging Source</td><td>DFG/USB2pro</td><td></td></tr><tr><td>Câmera</td><td>DAGE-MTI</td><td>NC-70</td><td></td></tr><tr><td>Condensador</td><td>Zeiss</td><td></td><td>condensador de alta abertura numérica trabalhando com óleo</td></tr><tr><td>Objetiva</td><td>Zeiss</td><td>W Plan Apocromat 441470-9900 VIS-IR</td><td>63X ampliação, longa distância, alta abertura numérica 1.0 imersão em água objetivo</td></tr><tr><td>Quádruplo</td><td>Luigs & amp Neumann</td><td></td><td>entre a câmera e o microscópio</td></tr><tr><td>Monitor de vídeo preto e branco</td><td>Sony</td><td>SSM-175CE</td><td>16 polegadas, 850 linhas de TV,</td></tr><tr><td>frascos de amostra analógicos, vidro âmbar, com tampa</td><td>VWR</td><td>215-2409</td><td>para transferir fatias da configuração para a sala de histologia</td></tr><tr><td>O Guia Axon</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Book</td></tr><tr><td>Stimfit</td><td>https://github.com/neurodroid/stimfit</td><td></td><td>Análise de dados eletrofisiológicos</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>consulte a FICHA DE DADOS DE SEGURANÇA e a Diretiva de Substâncias Perigosas (UE) antes do uso</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de poço</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662160</td><td>para a coloração de fatias fixas</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merk</td><td>108643</td><td>consulte a FICHA DE DADOS DE SEGURANÇA e a Diretiva de Substâncias Perigosas (UE) antes do uso</td></tr><tr><td>anti-TH monoclonal primário de camundongo</td><td>Immunostar</td><td>22941</td><td>concentração de trabalho: 1/1.000</td></tr><tr><td>anticorpo secundário anti-camundongo de cabra - Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11031</td><td>concentração de trabalho: 1/500</td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade</td><td>Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td> confocal Olympus FV1000 <td></td> ImageJ do laboratório A-2011 <td></td>do vetor da DCS da DCS da fluoresceína</tr><tr><td></td><td></td> http://imagej.nih.gov/ij/ <td></td><td></td></tr><tr><td>NeuronJ</td><td>http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td><td></td> <td>plugin para a</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> reconstrução do http://www.bitplane.com de ImageJ Imaris de neurônios enchidos biocytin <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neuromantic</td><td>http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td><td></td> <td>Reconstrução de neurônios preenchidos com biocitina</td></tr><tr><td>WinWCP</td><td>http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td><td>Análise de dados eletrofisiológicos</td></tr></tbody></table>

subcelulares gravações patch-clamp do domínio somatodendrítico da substância negra dopamina neurônios

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites dos neurónios dopaminérgicos receber e transmitir entrada sináptica, suporte potencial de ação back-propagação e liberação de neurotransmissores. Entender essas funções fundamentais irá lançar luz sobre a transferência de informações nestes neurônios. Dendríticas gravações de patch-clamp prevê a possibilidade de examinar diretamente as propriedades elétricas dos dendritos e canais de iões dependentes da voltagem subjacentes. No entanto, estas estruturas finas não são facilmente acessíveis para pipetas de patch por causa do seu pequeno diâmetro. Este relatório descreve um procedimento passo-a-passo para recolher gravações estáveis ​​e fiáveis ​​a partir dos dendritos de neurônios dopaminérgicos em fatias aguda. Medidas eletrofisiológicas são combinados com a recuperação post hoc da morfologia celular. experiências bem sucedidas dependem melhorado de preparação de fatias, soluções e pipetas, um ajuste adequado da óptica e estabilidade da pipeta em contacto com a estrutura gravada. princípios padrão de somatic gravação de patch-clamp são aplicados aos dendritos, mas com uma abordagem mais suave da pipeta. Estas técnicas versáteis podem ser implementadas para abordar várias questões relativas às propriedades excitáveis ​​de dendrites.

O protocolo descrito acima tem a intenção de facilitar a recolha de dados através de gravações de patch-clamp dendríticas. Esta técnica, combinada com histoquímica post hoc, ajuda a obter insights sobre os mecanismos de muitos sinais elétricos originários ou espalhamento em dendrites. Acesso directo à dendrites com pipetas de patch é difícil, mas especial atenção a vários aspectos metodológicos irá melhorar a taxa de sucesso das gravações. Um experimentador suficientemente experientes em gravação somática estável pode esperar obter selos de alta resistência (GÊ) e experiências completas sobre a maioria das tentativas. Uma a duas gravações dendríticas de alta qualidade podem ser recolhidos por dissecção. A disponibilidade de fatias de cérebro de alta qualidade contendo somata saudável e dendrites é um pré-requisito para acesso a essas estruturas finas (Figura 1). o criteriuma para selecionar esses neurônios são uma superfície lisa e homogênea em todo o celular e um soma e dendritos de baixo contraste, quando observada com óptimas ajustado óptica (Figura 1A e 1B). Seleção de neurônios muito fortemente contrastada geralmente leva a gravações instáveis (Figura 1C e 1c). Por conseguinte, tais neurónios deve ser evitada. Em comparação com outros neurônios, os neurônios da substância negra DA exibir características morfológicas e eletrofisiológicas específicos. Estas características geralmente avaliadas com uma única pipeta somática também pode ser observada em dupla somática (Figura 2) e gravações de somatodendríticos (Figura 3). Longos injeções atuais hiperpolarizantes induzir uma rectificação potencial de membrana chamada &quot;sag&quot; (Figuras 2B e 5D). O axónio origina, na maioria dos casos, num sítio dendrítica tal como identificadousando critérios complementares 13,25,26, indicando que o compartimento dendrítica nestes neurónios é heterogénea (Figura 3A - 3B). Como consequência, o compartimento onde o AP é observado em primeiro lugar corresponde ao compartimento no qual o axónio emerge (Figura 3C - 3D) 13,25,26. O axónio é geralmente terminada por uma bolha axonal causado por um corte do axónio durante corte 64, mas esta estrutura não é sistematicamente detectado. A retracção pronunciada observada em neurónios da substância negra consecutivo para a activação da I h sugere uma elevada expressão de subunidades de HCN. Para determinar a influência da I h na integração de sinais sinápticos, correntes (EPSC) formas de onda sinápticas-like foram gerados e injetado através do eletrodo de registro dendríticas durante as gravações dupla somatodendríticos 55 (&lt;forte&gt; Figura 4). A cinética destas EPSCS simulados foram baseadas em ascensão e tempo de decaimento constantes de EPSCS espontâneas reais. O aEPSP resultante foi gravado com o eletrodo somática. Aplicação no banho do I h bloqueador ZD 7288 aumentou a duração da aEPSP, indicando a contribuição de I h para o curso de tempo dos sinais sinápticas (Figura 4B). ZD 7288 aboliu também a membrana rectificação potencial confirmando que os resultados SAG da activação da I h (Figura 4C). Os resultados obtidos com os EPSPs simuladas pode ser correlacionada com experiências que utilizam EPSPs evocados electricamente 65. Para mapear a distribuição precisa do canal no domínio somatodendrítico de neurónios DA, gravações ligado de células foram executadas (Figura 5). A selagem de alta resistência (&gt;&gt; 1 GÊ) é uma necessidade absoluta para as gravações ligado de células (Figura 5B </strong&gt;). Em dendrites dos neurónios DA, Eu h activa lentamente com degraus de tensão hiperpolarizantes de comprimento e o estado de equilíbrio de corrente é atingido após centenas de ms (Figura 5C), como mostrado anteriormente 66. Esta observação indica que os canais HCN expressos em dendrites dos neurónios DA possuem diferentes subunidades em comparação com aqueles em neurónios piramidais ou de outros tipos de células 10,16,66. À medida que a distribuição do canal pode ser não homogénea no compartimento dendrítica e como o compartimento dendrítica é em si heterogéneos, a identidade do dendrito (axónio-rolamento ou dendrito nonaxon-rolamento) é revelada por comparação da imagem IR-DGC com a imagem confocal após coloração biocitina (Figura 3A e B). Recuperação da morfologia das células é, portanto, necessário para ambas as gravações de somatodendríticos dupla e para gravações ligado à célula por meio de gravações de células somáticas toda subsequentes. Figura 1. Visualizando o Soma e proximal dendrites dos neurônios dopaminérgicos da substância negra usar o infravermelho Videomicroscopia. (A) IR-DGC imagem de um neurônio DA nigral mostrando a soma e dendritos proximais e duas pipetas somáticas e dendríticas. Uma gravação somatodendrítico dupla foi realizada com sucesso neste neurônio saudável. Observar o baixo contraste e a superfície lisa em todo o domínio somatodendrítico da célula. (B) Um outro exemplo de um neurónio DA saudável. (C) DA neurónio com uma superfície mais áspera e desigual e um contraste forte. Embora tenha sido obtida uma gravação dupla, a estabilidade foi abaixo do ideal, e a duração da gravação foi curto (~ 15 min) devido a um aumento gradual da resistência acesso em ambas as pipetas. (D) segundo exemplo de um neurônio DA mostrando uma fortemente contrastada soma e dendritos proximal. Neste caso, um forte aumento da resistência acesso foi observada pouco depois da pausa no modo de célula inteira. Uma tentativa de diminuir a resistência acesso por pressão negativa não teve sucesso. Neurónios no painel C e D podem ter sido danificados durante o procedimento de corte e deve ser evitado para experiências. (E) simultânea dupla gravação somática num neurónio DA saudável no início da gravação. (F) O mesmo neurónio como no painel E com um corpo da célula inchada depois de ~ 17 min. Note a ausência completa de contraste, a aparência bola-like da soma e a presença do grande núcleo que não é aparente em neurônios saudáveis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig2.jpg" /> Figura 2. </strong&gt; simultânea Duplo Somatic gravação de uma DA Neuron. (A) IR-DGC imagem durante a gravação de dupla somática a partir de um neurônio DA. (B) hiperpolarizando e despolarização 1 s injeções de corrente longa (-160 a 80 pA, incremento de 80 pA) e variações de tensão correspondentes gravados simultaneamente com as duas pipetas de patch. Note a presença do afundamento no rastreio de tensão com a etapa atual de hiperpolarização longa e grande pós-hiperpolarização após a AP durante o pulso de corrente de despolarização. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig3.jpg" /> Figura 3. dupla S Gravação omatodendritic num DA Neuron. (A) imagem IR-DGC de um neurônio DA. A distância entre a dendrítica e somapipeta tique é 29 uM imagem. (B) z-confocal projecção do neurónio no painel A marcado com avidina conjugada com isotiocianato de fluoresceína (FITC). O neurônio foi preenchido com biocitina durante a gravação. O axônio originado de um dendrito proximal perto da soma, tal como indicado pela seta. (C) a gravação de tensão de célula inteira somatodendrítico dupla simultânea do neurônio no painel A. AP registrado na soma (vestígios de tensão preto) e dendritos (tensão vermelho traços) em resposta a um 1 s passo de injecção de corrente longa via somática (da esquerda; traçado atual preto) e pipeta alternativamente dendríticas (direita; traço corrente vermelha) (D) somática e AP dendrítica mostradas na escala de tempo expandido.. Com qualquer somática ou injeção de corrente dendrítica, a AP somáticas (preto) precedeu a AP dendríticas (vermelho). O atraso entre APs neste neurônio foi de 120 ms e 210 mS com somático e injeção de corrente dendrítica, respectivamente. atrasosforam medidos no AP amplitude semi-máxima durante a fase de subida do AP. A AP é observada pela primeira vez no compartimento próximo ao qual o axônio emerge, confirmando observações anteriores 25,26. Neste caso, a gravação dendrítica é feita a partir de uma dendrite-falta axónio. Um exemplo de uma gravação de uma dendrite axônio de rolamento está em Ref. 13 (na sua Fig. 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig4.jpg" /> Figura 4. Propagação da EPSPs artificiais ao longo do somatodendrítico Axis of DA neurônios. (A) imagem IR-DGC de um neurônio DA. A distância entre a pipeta e dendrítica somática é de 45 uM. Ambas as pipetas de patch está no modo de célula inteira de gravação actual-clamp. (B) Correntegravado com a pipeta dendrítica na corrente de grampo e usado para gerar o EPSP artificial (topo). A corrente é obtida pela injecção de uma forma de onda semelhante EPSC (t rise = 0,6 ms; τ decaimento = 3 ms de amplitude = 100 Pa) através do dendrítica pipeta de gravação 55. Na parte inferior, aEPSPs registados no soma em condições de controle (preto) propagado e depois da aplicação do banho do ZD7288 I h bloqueador (30 mM; traço vermelho). Cada traço de tensão é a média de 40 varreduras individuais. Observar o grande aumento da duração do EPSP na presença de ZD7288 indicando a contribuição de I h para o curso de tempo de EPSP. (C) Tensão vestígios gravados a partir do soma, em condições de controlo (preto) e após a aplicação de 30 | iM ZD 7288 ( vermelho) em resposta a uma longa (30 pa; 1 s) passo actual hiperpolarizante. Note-se a ausência do potencial de membrana de rectificação (SAG), após o bloqueio de I &lt;sub&gt; h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig5.jpg" /> Figura 5. Presença de I h em dendritos das DA Neuron. (A) IR-DGC imagem de um neurônio DA e pipeta sobre dendrito proximal. (B) capacitivo e de vazamento de correntes durante um comando de tensão 5 mV na configuração anexado à célula. A resistência de selagem foi GÊ 5, neste exemplo, o passo (C) tensão de hiperpolarização. (90 mV; parte superior) a partir de um potencial de membrana 0 mV induzida uma activação lentamente I h. O rastreio da corrente foi invertida e equipada com uma única função exponencial dá uma constante de tempo de t = 632 ms. (D) Tensãorespostas da soma registrada de células inteiras (painel A) a 1 s hiper e despolarizantes pulsos de corrente (-160 a 120 Pa, 40 pA de incremento). A gravação de célula inteira somáticas foi realizado após a gravação ligado à célula. Note-se a ausência de APs devido à aplicação extracelular da TTX e Cd 2+ suprime a ativação espontânea durante a gravação ligado à célula. Estes voltagem dependentes de Na + e Ca 2+ bloqueadores atuais foram adicionados a suprimir as correntes de ação. Os painéis A - D, são do mesmo neurónio (E) imagem IR-DIC de outro neurónio DA e uma pipeta dendrítica correntes (F) de tensão-dependentes activados por um pulso de teste de 0 mV a partir de um pré-pulso de 50 ms a -120 mV.. em um patch de fora para fora excisada do dendrito proximal do neurônio no painel E. Segurar potencial de -80 mV. Note-se a inativação dependente do tempo da corrente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma maior</a>versão desta figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substância </td><td> g / mol </td><td> Concentração </td><td> para 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,443 </td><td> 125 mM </td><td> 7.305 g </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2.100 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,551 </td><td> 2,5 mm </td><td> 0,186 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137.99 </td><td> 1,25 mM </td><td> 0,172 g </td></tr><tr><td> glicose </td><td> 198,17 </td><td> 25 mM </td><td> 4,95 g </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 M (solução) </td><td> 1 mM </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1 M (solução) </td><td> 2 mM </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaridade: ~ 310 mOsmol / L (intervalo ideal: 314-325 mOsmol / L), pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: fluido cerebrospinal artificial (ACSF). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substância </td><td> g / mol </td><td> Concentração </td><td> para 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,443 </td><td> 87 mM </td><td> 5.084 g </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2,1001 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 7,551 </td><td> 2,5 mm </td><td> 0,18637 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137.99 </td><td> 1,25 mM </td><td> 0,17248 g </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 M (solução) </td><td> 7 mM </td><td> 7 mL </td></tr><tr><td> glicose </td><td> 198,17 </td><td> 10 mM </td><td> 1,9817 g &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> sacarose </td><td> 342,29 </td><td> 75 mM </td><td> 25,672 g </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1 M (solução) </td><td> 0,5 mM </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaridade: ~ 326 mOsmol / l, pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabela 2: sacarose-ACSF para preparar fatias. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substância </td><td> g / mol </td><td> Concentração </td><td> para 100 ml </td></tr><tr><td> KMeSO 4 </td><td> 150,2 </td><td> 120 mM </td><td> 1,8024 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 20 mM </td><td> 0,14912 g </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 M (solução) </td><td> 2 mM </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> Na 2 ATP </td><td> 551,1 </td><td> 2 mM </td><td> 0,1102 g </td></tr><tr><td> Na 2 GTP </td><td> 523,2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 0,02661 g </td></tr><tr><td> Na 2 -Phosphocreatine </td><td> 255,1 </td><td> 5 mM </td><td> 0,1275 g </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 380,4 </td><td> 0,1 mM </td><td> 3.803 mg </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23831 g </td></tr><tr><td> biocitina </td><td> 1 mg / mL </td><td></td><td> 0,1 g </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaridade: ~ 302 mOsmol / l, pH = 7,2 ajustado com KOH </td></tr></tbody></table> Tabela 3: solução intracelular para gravações dupla. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substância </td><td> g / mol </td><td> Concentração </td><td> para 100mL </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 120 mM </td><td> 0,8947 g </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1 M (solução) </td><td> 2 mM </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 M (solução) </td><td> 1 mM </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23831 </td></tr><tr><td> TEA-Cl </td><td> 165,7 </td><td> 20 mM </td><td> 0,3314 g </td></tr><tr><td> 4-AP </td><td> 94,11 </td><td> 5 mM </td><td> 0,04705 g </td></tr><tr><td> BaCl2 </td><td> 244,26 </td><td> 1 mM </td><td> 0,02443 g </td></tr><tr><td> CdCl2 </td><td> 183,32 </td><td> 0,02 mm </td><td> 0.3666 mg </td></tr><tr><td> TTX </td><td> 1 mM </td><td> 200 nM </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaridade: ~ 290 mOsmol / L, ajustado com D-glicose (Ref. 16); pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabela 4: Solução de eletrodo para gravações ligado por células.

As gravações de patch-clamp subcelulares oferecem a possibilidade de investigar as propriedades funcionais dos dendritos. No entanto, essas estruturas finas não são facilmente acessíveis devido ao seu pequeno diâmetro. O protocolo aqui descrito visa facilitar a coleta de gravações estáveis e confiáveis dos dendritos dos neurônios dopaminérgicos em fatias in vitro.

Subcelulares Gravações patch-clamp do domínio somatodendrítico da substância negra dopamina Neurônios

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da neurobiologia, como a forma como canais iônicos dependentes de voltagem individuais contribuem para as funções de um neurônio específico. A principal vantagem desta técnica é que ela permite mapear a função dos canais iônicos em nível subcelular nos neurônios. Inicie este procedimento colocando o cérebro em uma placa de Petri de 9 centímetros com o fundo coberto por uma camada de SiliGuard.Em seguida, envolva o cérebro com ACSF gelado contendo sacarose. Para preparar fatias coronais, faça dois cortes para remover o cerebelo e a parte rostral do cérebro. Em seguida, aplique cola de cianoacrilato na bandeja do espécime e fixe o bloco cerebral na bandeja de modo que a parte rostral fique voltada para o estágio de corte.Posteriormente, aplique algumas gotas de ACSF com sacarose sobre o cérebro e submerja lentamente a bandeja na câmara de corte. Em seguida, ajuste a lâmina em um ângulo de 15 graus em relação ao plano horizontal. Corte fatias coronais do cérebro de aproximadamente 500 micrômetros no sentido nasal cottle antes de atingir a substância negra.Em seguida, ajuste a espessura para cortar fatias de 300 micrômetros contendo a região de interesse. Separe as fatias do bloco de tecido com uma agulha de perfusão muito fina acoplada a uma seringa, paralela à borda da lâmina de barbear. Após isso, transfira as fatias para a câmara de reserva a 34 graus Celsius por uma hora.Neste procedimento, transfira uma fatia de cérebro para a câmara de registro. Fixe a fatia na base da câmara de registro com um anel de platina e certifique-se de que a fatia apresente boa qualidade, com uma superfície lisa e uniforme. Em seguida, selecione um neurônio com um dendrito que se estenda por uma longa distância no mesmo plano e verifique se o dendrito de interesse pode ser seguido até um soma bem definido.Em seguida, encha a pipeta de grampo com solução eletrolítica. Para realizar o grampo em um dendrito no modo acoplado à célula, identifique e foque uma porção do dendrito. Aplique pressão positiva à pipeta e abaixe-a utilizando o micromanipulador.Em seguida, posicione a pipeta próxima à membrana e ajuste a pressão para criar uma pequena reentrância. Posteriormente, libere a pressão na ponta da pipeta e realize o selamento no dendrito, controlando a resistência da pipeta. Tente obter uma resistência de selamento maior que um gigaohm, idealmente entre três e dez gigaohms, para gravações em configuração cell-attached.Em seguida, retire a pipeta da membrana, em alguns micrômetros, para evitar a deformação do dendrito. As correntes de ação observadas aqui representam os potenciais de ação espontâneos de neurônios nigrais. Para suprimir as correntes de ação, aplique bloqueadores dos canais de cálcio e sódio ao ACSF.Em seguida, aplique um degrau de tensão de 90 milivolts, a partir de um potencial de retenção de zero milivolts, para evocar a corrente catiônica ativada por hiperpolarização. Ao final da gravação, rompa o retículo para alcançar o modo de célula inteira. Depois disso, retire lentamente e suavemente a pipeta dendrítica da membrana neuronal para obter um retículo fora-da-célula.Para realizar a gravação do soma correspondente no modo de célula inteira, localize o soma correspondente ao dendrito. Abaixe uma pipeta com resistência entre cinco e dez megaohms contendo uma solução intracelular à base de potássio até o corpo celular. Em seguida, aplique uma pressão negativa breve à ponta da pipeta para romper a membrana e assim obter o modo de célula inteira.Verifique a identidade do neurônio no modo de fixação de corrente aplicando longos pulsos de corrente hiperpolarizantes e despolarizantes, e permita que a biocitina do interior da pipeta difunda-se ao longo das dendrites. Após 10 minutos, retire a pipeta para obter um selo outside-out. Utilize uma sequência de movimentos curtos, laterais e ascendentes para favorecer o fechamento adequado da membrana celular, uma vez que a pipeta esteja acima do corte, a fim de sair completamente da câmara de registro.Mantenha o corte na câmara de gravação por mais 15 minutos em ACSF padrão para permitir a equilibração da biocitina e do neurônio gravado. Em seguida, transfira suavemente o corte para um frasco de vidro âmbar de 25 mililitros contendo ACSF padrão para histologia. Neste procedimento, localize aproximadamente o neurônio marcado com fluorescência no corte utilizando epifluorescência.Examine brevemente a arborização dendrítica dos neurônios e localize o axônio e o botão axonal utilizando uma objetiva de 10X. Em seguida, mude para o microscópio confocal e selecione o laser de diodo de 488 nanômetros para excitar o neurônio marcado. Siga a extensão do axônio e dos dendritos ao longo do eixo Z e registre imagens sucessivas para obter uma pilha Z (Z stack) de toda a célula.Ajuste a resolução do eixo Z e adquira as imagens confocais da célula em baixa e alta ampliação. Ao final, abra o arquivo de imagem do neurônio com um software de imagem. Compare a imagem da projeção Z com uma imagem de IR-DGC a olho nu para localizar a posição exata da pipeta de gravação durante o registro eletrofisiológico.É mostrada aqui a imagem de IR-DGC de um neurônio dopaminérgico e uma pipeta na dendrite proximal. O traçado da corrente mostra a capacidade das correntes de vazamento do EN em resposta a um comando de voltagem de cinco milivolts, em configuração de célula ligada, com resistência de selamento de cinco gigaohms. Um degrau de voltagem hiperpolarizante, a partir de um potencial de membrana de zero milivolts, induziu uma corrente catiônica ativada por hiperpolarização com ativação lenta.O traço da corrente foi invertido e ajustado com uma função exponencial simples, resultando em uma constante de tempo de 632 milissegundos. Abaixo estão as respostas de tensão do soma gravado na célula inteira a pulsos de corrente hiperpolarizantes e despolarizantes de um segundo, na presença de bloqueadores das correntes de sódio e cálcio dependentes de voltagem, para eliminar potenciais de ação durante a gravação em configuração de célula ligada. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em um dia, se for executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de obter tecido saudável e condições estáveis de gravação. Após este procedimento, outros métodos, como a imunohistoquímica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a identidade do neurônio gravado. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de neurofisiologia explorarem a função, propriedades e o papel dos canais iônicos ativados por voltagem em células excitáveis.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como registrar e examinar a distribuição de correntes que fluem através de canais iônicos ativados por voltagem em dendritos.

subcellular-patch-clamp-recordings-from-somatodendritic-domain-nigral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neste vídeo, demonstramos como aplicar uma condutância em um neurônio dopaminérgico gravada na configuração da célula inteira em fatias de cérebro de rato. Esta técnica é chamada a braçadeira dinâmico.

Aplicação de uma condutância do receptor NMDA em neurônios dopaminérgicos Rat Midbrain Usando a Técnica Clamp dinâmico

A técnica amperométrica mede a libertação de dopamina a partir de uma única célula, detectando a corrente de oxidante produzido pela oxidação da dopamina espontânea. Braçadeira de tensão simultânea e metodologia amperometria revelar a relação mecanicista entre a "atividade" geral do transportador de dopamina eo papel regulador da atividade no transporte reverso da dopamina.

Medição única célula de liberação de dopamina com simultânea de tensão-clamp e amperometria

Este vídeo demonstra uma técnica para gravação de patch-clamp da superfície da membrana dendrítica. Isso ajuda a examinar diretamente as propriedades elétricas dos dendritos e dos canais iônicos dependentes de voltagem subjacentes em neurônios dopaminérgicos.

Gravações de Patch-Clamp do Dendrito de um Neurônio Dopaminérgico em uma Fatia de Cérebro

Este vídeo demonstra o procedimento para realizar registros eletrofisiológicos em neurônios da substância gelatinosa (SG) de fatias da medula espinhal, usando técnicas de patch-clamp de células inteiras para analisar os padrões de disparo dos neurônios. Este método permite o estudo das respostas neurais a estímulos em neurônios SG da medula espinhal.

Registro de grampo de remendo de célula inteira em um neurônio da substância gelatinosa de uma fatia da medula espinhal

Este vídeo demonstra o exame da excitabilidade dos neurônios sensoriais nos gânglios da raiz dorsal usando a técnica de patch clamp para medir o potencial reobase e de membrana, analisando as respostas dos neurônios a injeções de corrente incremental.

Gravações de grampo de remendo de células inteiras em gânglios intactos da raiz dorsal de ratos

Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Este protocolo descreve passos processuais básicas para a realização de célula inteira gravações de patch-clamp. Esta técnica permite o estudo do comportamento eléctrico de neurónios, e quando realizados em fatias do cérebro, permite a avaliação de várias funções neuronais a partir de neurónios que ainda estão integrados nos circuitos do cérebro relativamente bem conservadas.

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Este manuscrito descreve como preparar gânglios da raiz dorsal intactos para gravações de patch clamp. Esta preparação mantém o microambiente para neurônios e células gliais satélites, evitando assim as alterações fenotípicas e funcionais observadas usando neurônios DRG dissociados.

Remendo Recordings Grampo na Intact gânglios das raízes dorsais de ratos adultos

Este protocolo demonstra como executar de células inteiras de gravação patch-clamp em neurônios da retina a partir de uma preparação flat-mount.

Patch-clamp gravação de células Starburst Amácrinas em um monte de Luxo Preparação de Deafferentated mouse Retina

Este protocolo descreve os passos críticos e as precauções necessárias para executar a única célula multiplex transcrição reversa reação em cadeia da polimerase após remendo-braçadeira. Esta técnica é um método simples e eficaz para analisar o perfil de expressão de um conjunto predeterminado de genes de uma única célula caracterizada por gravações de remendo-braçadeira.

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Aprenda gravações patch-clamp subcelulares em dendritos de neurônios dopaminérgicos da substância negra. Este método permite mapear a função de canais iônicos em nível subcelular para estudar sinalização neuronal.

Subcelulares Gravações patch-clamp do domínio somatodendrítico da substância negra dopamina Neurônios

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