Usando Eletroforese Capilar para quantificar ácidos orgânicos a partir de tecido da planta: um caso de teste de exame

O objetivo geral deste procedimento é quantificar os níveis de ácidos orgânicos presentes em tecidos vegetais. Este método pode ser utilizado para responder perguntas em bioquímica e fisiologia vegetal, como o impacto de estímulos ambientais no crescimento radicular, no desenvolvimento de culturas e na qualidade de alimentos ou bebidas. As principais vantagens deste método são a preparação mínima das amostras, o alto rendimento e o fato de a eletroforese capilar ser mais econômica do que a espectrometria de massas.

Embora este método seja usado para elucidar respostas fisiológicas de plantas, ele também pode ser aplicado à ciência dos alimentos e à qualidade alimentar, onde os ácidos orgânicos impactam criticamente o sabor, a segurança e a estabilidade. Para começar, prepare amostras para extração de ácidos carboxílicos de cadeia curta, ou SCCA. Prepare um grama de semente de café por vez para garantir que reste amostra suficiente após o processamento.

Para obter um tamanho uniforme de partículas e máxima eficiência na extração de SCCA, primeiro pré-resfrie um almofariz e um pistilo com nitrogênio líquido. Adicione a amostra a um pequeno volume de nitrogênio líquido no almofariz. Usando uma concha, adicione nitrogênio líquido suficiente ao almofariz para submergir completamente a amostra.

Adicione amostras difíceis de moer, como sementes de café cru, ao nitrogênio líquido. Deixe-as congelar por 10 a 30 segundos antes da moagem. Quebre o tecido em fragmentos menores usando um movimento vertical de esmagamento.

Em seguida, finalize a moagem do tecido utilizando um movimento circular de moagem. Repita os passos de congelamento e moagem mais duas vezes, de modo que as amostras sejam moídas um total de três vezes. Normalmente, três rodadas sucessivas de moagem reduzirão as amostras a um pó com consistência semelhante à de farinha.

Transfira o pó para frascos de vidro ou tubos microcentrífugos de 1,5 ml. Inicie imediatamente o processamento posterior após a moagem ou armazene as amostras a -80 graus Celsius até que estejam prontas para extração. Monte padrões autênticos para os SCCAs de interesse para criar soluções padrão externas e internas para uso na determinação das concentrações de SCCA.

Para amostras de café, inclua ácido cítrico, málico, acético e lático como ácidos de interesse, e ácido adípico como padrão interno. Prepare uma solução estoque de 10 miligramas por mililitro adicionando 100 miligramas do padrão a um balão volumétrico de 10 mililitros. Complete o balão volumétrico até a marca de 10 mililitros com água ultra pura para dissolver o ácido.

Transfira cada solução estoque para um tubo de vidro limpo de 15 mililitros, com tampa revestida de politetrafluoretileno, e feche com filme de parafina plástica. As soluções estoque podem ser armazenadas em tubos fechados a quatro graus Celsius por uma semana. Prepare 50 mililitros da solução de extração SCCA diluindo a solução estoque do padrão interno para 0,05 miligramas por mililitro em água ultrapura.

Faça isso adicionando 250 microlitros da solução estoque do padrão interno a 49,75 mililitros de água. Em seguida, prepare amostras para a curva padrão dos SCCAs de interesse. Utilize um mínimo de cinco pontos com concentrações dentro da faixa de resposta linear que abranja as concentrações esperadas de SCCA nas amostras.

Dilua cada SCCA até a concentração determinada em novos tubos de microcentrífuga usando água ultrapura até um volume de um mililitro. Certifique-se de que cada ponto de concentração contenha os quatro padrões ácidos e o padrão interno na concentração correta. Retire as amostras a serem extraídas do armazenamento e coloque-as sobre gelo.

Pese 100 miligramas de amostra para a extração de SCCA. Meça uma quantidade de amostra o mais próxima possível da massa-alvo, para reduzir a variabilidade. Após pesar cada amostra, transfira o tecido para um tubo microcentrífuga limpo de 1,5 mililitro.

Registre a massa de cada amostra pesada, pois as quantidades de SCCAs detectadas serão normalizadas com base na massa da amostra. Após pesar todas as amostras, adicione um mililitro da solução de extração a cada tubo de amostra. Mantenha a proporção de solução de extração em relação à massa do tecido constante em todas as extrações.

Agite bem em vórtex por 10 segundos. Deixe as amostras em repouso à temperatura ambiente por uma hora. Durante essa hora, agite cada tubo a cada 15 minutos em vórtex por 10 segundos.

Após uma hora de extração, misture as amostras uma última vez e transfira os tubos de amostra para uma microcentrífuga. Centrifugue as amostras a quatro graus Celsius, 10.000 vezes G, durante 10 minutos, para precipitar o material sólido. Para filtrar as amostras, prepare filtros de disco acoplados a seringas, garantindo que cada filtro esteja corretamente fixado à seringa.

Prepare uma seringa equipada com um filtro em disco para cada amostra a ser analisada, incluindo as amostras da curva padrão. Filtre os sobrenadantes diretamente em um tubo de microcentrífuga limpo. Após a filtração, feche o tubo contendo o filtrado e descarte o conjunto de filtração com seringa.

Transfira um mililitro da amostra para cada vial de eletroforese capilar, ou CE, tomando cuidado para evitar salpicar a amostra no gargalo do vial. Após a transferência da amostra, coloque uma tampa de CE em cada vial. Configure a corrida de detecção SCCA conforme descrito no protocolo textual.

Carregue os frascos contendo os pontos da curva padrão e os frascos contendo as amostras a serem analisadas na bandeja de entrada de amostras, conforme descrito nas instruções do fabricante. Anote a posição de cada frasco para a programação do autoamostrador. Após a condicionagem descrita no protocolo textual, inicie a separação das amostras abrindo o menu Controle no software e selecionando Executar Sequência.

Monitore o arranjo de fotodiodos, ou bandejas PDA, para garantir uma separação adequada. Observe o primeiro traçado e certifique-se de que ele apresenta uma linha de base plana e resolve claramente os picos individuais de ácidos. Para integrar os picos da amostra, abra o primeiro arquivo e defina as etapas de integração automática para excluir os primeiros três minutos da corrida.

No mesmo menu, defina os critérios de seleção de picos com largura mínima de 50 unidades e área do pico de 100 unidades, para fornecer um nível moderadamente alto de seletividade, separando os picos de ácido do ruído de fundo no traçado. Realize a análise de dados conforme descrito no protocolo textual. É mostrada aqui uma comparação de traçados de DAD destacando uma amostra sobrecarregada.

À medida que a concentração do analito aumenta, a geometria individual dos picos pode começar a se tornar assimétrica. Em 0,05 miligramas por mililitro, o ácido acético apresenta um pico bem definido e simétrico bilateralmente. À medida que a concentração do ácido acético aumenta para 0,07 ou 0,10 miligramas por mililitro, o pico torna-se assimétrico e forma-se um alargamento na cauda do pico.

Esse alargamento da cauda do pico é um bom indicativo de que a amostra está sobrecarregada. São exibidos aqui traçados de DPA exemplares mostrando ácidos orgânicos em amostras de café verde. As amostras de café verde foram diluídas na proporção de 1:10 antes de serem carregadas nos frascos de CE.

Os ácidos de interesse incluem ácido acético, ácido cítrico, ácido lático, ácido málico e o padrão interno, ácido adípico. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de moer as amostras até obter uma consistência uniforme e pipetar as amostras com cuidado, para maximizar a reprodutibilidade e minimizar os erros experimentais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como quantificar ácidos orgânicos provenientes de amostras vegetais utilizando eletroforese capilar, ou CE. Você deverá ser capaz de moer amostras vegetais, extrair ácidos orgânicos e preparar extratos vegetais para análises subseqüentes por CE.