Definindo substrato Especificidades para a lipase e fosfolipase candidatos

O objetivo geral deste procedimento é acelerar a detecção de substratos fisiológicos para potenciais lipases e fosofolipases. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da Entomologia, como como as fosfolipases contribuem para a remodelação lipídica em membranas biológicas. A principal vantagem dessa técnica é que a otimização da atividade enzimática e a busca do substrato natural para a enzima podem ser realizadas de forma independente.

Embora este método possa fornecer informações sobre a especificidade do substrato de lipases e fosfolipases bacterianas, ele também pode ser modificado para estudar hidrolases de quaisquer outros organismos modelo. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando procuramos uma atividade enzimática que pudesse degradar a fosfatidilcolina lipídica intrínseca da membrana inorhizobium meliloti. Para preparar extratos de proteínas livres de células, descongele as suspensões de células bacterianas e armazene-as no gelo.

Em seguida, passe as suspensões de células três vezes por uma célula de pressão fria a 20.000 libras por polegada quadrada. Remover as células intactas e os detritos celulares por centrifugação a 5.000 vezes g durante 30 minutos, a quatro graus Celsius. Após centrifugação, preparar alíquotas de 100 e 500 microlitros do sobrenadante para análise posterior.

Configure o ensaio enzimático previamente otimizado usando os esquemas de pipetagem tabulados no protocolo de texto. Para uma cobertura inicial de atividades enzimáticas distintas, use substratos artificiais que produzam um produto colorido após a hidrólise, como para-nitrofenol ou derivados de PNP. Siga o curso do tempo para um aumento de absorbância em 405 nanômetros, devido à formação de PNP em um espectrofotômetro a 30 graus Celsius durante um período de cinco minutos.

Por fim, execute os cálculos conforme descrito no protocolo de texto. Para a marcação radioativa de lipídios, prepare uma pré-cultura noturna de um organismo de interesse em cinco mililitros do meio de cultura desejado e cresça a 30 graus Celsius. A partir da pré-cultura, inocular em 20 milímetros de meio fresco em um frasco de cultura de 100 milímetros, para obter uma densidade óptica inicial de 620 nanômetros de 0,3 para a cultura.

Em seguida, transfira uma alíquota de um mililitro da cultura para um tubo de fundo redondo de poliestireno estéril de 14 mililitros em condições estéreis. Adicionar um microcurie de acetato de 114 c à cultura de um mililitro. Em seguida, incubar a cultura líquida sob agitação a 30 graus Celsius por um período de 24 horas.

No final do período de incubação, transferir a cultura para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros e centrifugar a 12 000 vezes g à temperatura ambiente durante cinco minutos. Ressuspenda o pellet em 100 microlitros de água. Neste ponto, armazene a suspensão celular a menos 20 graus Celsius ou continue imediatamente com a extração de lipídios polares.

Para realizar a extração de lipídios polares, adicione 375 microlitros de uma solução de metanol dois a um à solução de clorofórmio aos 100 microlitros de suspensão de células aquosas. Vortex a amostra por 30 segundos antes de incubar por cinco minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, centrifugar durante cinco minutos a 12 000 vezes g à temperatura ambiente.

Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 125 microlitros de clorofórmio e 125 microlitros de água ao sobrenadante. Após vórtice por 30 segundos, centrifugue a amostra por um minuto a 12.000 vezes g à temperatura ambiente.

Transfira a fase inferior do clorofórmio para um novo tubo. Em seguida, seque a solução com uma corrente de gás nitrogênio. Dissolva os lipídios secos em 100 microlitros de solução de clorofórmio em metanol.

Para separação de lipídios polares neutros por cromatografia em camada fina, aplicar alíquotas de três microlitros das amostras lipídicas, em uma folha de alumínio de sílica gel de cromatografia em camada fina de alta eficiência, a partir de dois centímetros das bordas da placa. Se várias amostras forem analisadas em cromatografia unidimensional, mantenha uma distância de pelo menos 1,5 centímetros entre os diferentes pontos de aplicação da amostra. Transferir a fase móvel para uma câmara de revelação de TLC, revestida internamente com papel de cromatografia.

Cubra com uma placa de vidro para deixar a câmara saturar por 30 minutos. Transfira a folha de alumínio de sílica gel HPTLC com as amostras de lipídios secos para a câmara. Deixe a placa se desenvolver por 30 minutos em uma câmara fechada antes de removê-la.

Em seguida, deixe os solventes secarem em uma capela de fluxo por duas horas. Assim que a folha de TLC revelada estiver seca, incube-a com uma tela de luminescência fotoestimulável em um fechado por três dias. Em seguida, exponha a tela incubada a um scanner PSL e adquira uma imagem virtual dos lipídios marcados com rádio separados.

Para determinar a atividade da diacilglicerol, ou DAG, lipase, primeiro adicione 5.000 CPM de DAG marcado com 14 C a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Além disso, adicione uma solução de Triton X-100 ao tubo e misture por vórtice. Secar a solução sob uma corrente de azoto.

Para um ensaio final de 100 microlitros, adicione tampão Tris-HCl, uma solução de cloreto de sódio e água bidestilada Vórtice por cinco segundos. Inicie a reação adicionando cinco microlitros de enzima à solução.

Incubar a solução a 30 graus Celsius durante quatro horas. Pare a reação adicionando 250 microlitros de metanol e 125 microlitros de clorofórmio, antes de extrair os lipídios, conforme descrito anteriormente neste vídeo. Prossiga para analisar lipídios polares neutros por 1DTLC e subsequente imagem PSL como antes.

Embora a fosofolipase prevista SMc01003 mostre atividade com ésteres para-nitrofenol acila artificiais, a atividade é apenas o dobro ou o triplo da atividade de fundo presente em extratos livres de células de Escherichia coli, nos quais nenhum gene estranho foi expresso. Isso indica que os ésteres para-nitrofenil acilo não parecem ser bons substratos para SMc01003. Enquanto os extratos livres de células de E.Coli não podem degradar o diacilglicerol, os extratos de cepas nas quais a fosfolipase prevista, SMc01003, foi expressa, causaram uma degradação do diacilglicerol.

Embora SMc01003 tenha sido previsto como uma fosfolipase, na verdade é uma diacilglicerol lipase que degrada diacilglicerol em monoacilglicerol e um ácido graxo. Em seguida, degrada o monoacilglicerol em glicerol e outro ácido graxo. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em algumas semanas se for executada corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como otimizar as atividades enzimáticas das lipases e fosfolipases e como continuar com a busca por seus substratos fisiológicos. Uma vantagem crucial desse procedimento é que a otimização da atividade enzimática pode ser separada da busca pelo substrato enzimático natural. Não se esqueça de que trabalhar com solventes orgânicos ou substâncias radioativas pode ser extremamente perigoso e as precauções necessárias devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.