Name: Definindo substrato Especificidades para a lipase e fosfolipase candidatos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprenda a otimizar atividades de lipases e fosfolipases usando extratos proteicos livres de células. Este método computacional acelera a detecção de substratos fisiológicos naturais em sistemas biológicos.

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Este trabalho foi financiado por doações do Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-México (CONACyT-México) (82614, 153998, 253549 e 178359 em Investigación Científica Básica, bem como 118 em Investigación en Fronteras de la Ciencia) e da Dirección General de Asuntos de pessoal Académico-Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM DGAPA-; PAPIIT IN202616, IN203612).

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Os autores não têm nada para revelar.

Nos últimos 20 anos, os genomas de muitos organismos já foram seqüenciados e, apesar de uma riqueza de dados seqüência do genoma foi gerado, interpretação funcional está ficando para trás e, portanto, dificulta a nossa compreensão da função do genoma. funções dos genes em genomas são frequentemente atribuídos com base na similaridade com genes de função ou a ocorrência de motivos conservados conhecido. No entanto, a função exacta de um determinado gene, muitas vezes não é conhecido. Especialmente, previu genes estrutura...

Lípidos à base de glicerol como triglicerídeos e fosfolipídios (glicero) constituem importante e, provavelmente, as classes de lípidos mais conhecidos 1. Triacilgliceróis (tags) são as gorduras e óleos, que normalmente funcionam como lipídios de armazenamento e, portanto, como potenciais fontes de energia e de carbono. As tags podem ser degradados por lipases, que são frequentemente segregadas pelo organismo produtor de digerir TAGs externas e torná-los disponíveis como fontes de carbono. Além disso, lipases têm sido amplamente estudados ao longo dos anos devido às suas importantes aplicações biotecnológicas 2. Devido à sua natureza anfifílica e sua forma quase cilíndrica, propriedades de formação de membrana (glicero) fosfolipídios de exposição e normalmente constituem os principais componentes lipídicos de uma membrana de bicamada 3. Em microorganismos simples, tais como a bactéria Escherichia coli, apenas três variantes principais grupo de cabeça, fosfatidilglicerol (PG), a cardiolipina (CL), e phosphatidylethanolamine (PE) são encontrados, embora se deva ter presente que cada um deles pode ser substituído com um número considerável de diferentes cadeias de acilo gordo na posição sn-1 ou sn posição -2 dando origem a um grande número de diferentes espécies moleculares 4 . Outras bactérias pode ter outros fosfolipídios em adição ou em vez disso. Por exemplo, Sinorhizobium meliloti, uma bactéria do solo, que é capaz de formar uma simbiose nódulo da raiz de fixação de azoto, com a alfafa de leguminosas (Medicago sativa), contém, além de um segundo fosfolípido PE zwitteriónico, fosfatidilcolina (PC) 5. Além disso, os lipídios não contendo fósforo ou glicerol pode ser anfifílico e fazem parte da membrana celular. Por exemplo, em condições de crescimento limitativos de fósforo, em S. meliloti, (glicero) fosfolípidos são em grande parte substituído por lípidos da membrana que não contêm fósforo, ou seja, os sulfolípidos, lípidos ornitina, e diacylglyceryl trimethylhomoserine (DGTS) 6. Em bactérias, DGTS é formado a partir de diacilglicerol (DAG) em uma via de duas etapas 7, mas a fonte para geração de DAG não foi claro. Experimentos pulse-chase sugeriu que o PC pode ser um precursor para DGTS 8 e utilizando a metodologia descrita neste manuscrito foi possível identificar uma fosfolipase C (PLCP, SMc00171) que é formado sob condições limitantes de fósforo e que pode converter PC em DAG e fosfocolina 8. Em um estudo separado, descobrimos que uma sintetase de acil-CoA (FADD) -deficient mutante de S. meliloti ou de Escherichia coli acumulada ácidos graxos livres ao entrar em fase estacionária de crescimento de 9. Embora estes ácidos gordos pareceu ser derivados de lípidos da membrana, a origem exacta para os ácidos gordos livres ou a enzima (s) libertando-os não eram conhecidos. Mais uma vez, empregando a estratégia delineada neste manuscrito, dois 10 (fosfo) lipases patatina-like (SMc00930 e SMc01003) que contribuiu para a formação de ácidos gordos livres em S. meliloti 11 foram previstos. Surpreendentemente, SMc01003 DAG utilizado como substrato para convertê-lo e, finalmente, monoacilglicerol glicerol e ácidos gordos livres 11. Por conseguinte, é uma lipase SMc01003 DAG (DGLA). Embora um número de algoritmos de previsão do potencial existe (fosfo) lipases 12,13, a sua função precisa e papel fisiológico normalmente não é conhecido. Aqui destacamos um protocolo, clonar e sobre-expressar lipases (fosfo) previstos ou potenciais. Este manuscrito explica como ensaios de enzimas pode ser desenvolvido e optimizado para o (fosfo) lipase sobre-expresso utilizando substratos cromogénicos artificiais. Nós fornecemos exemplos como com um ensaio enzimático otimizado do real (fosfo) lipase substrato podem ser encontradas e como estas descobertas podem enriquecer a nossa compreensão da fisiologia microbiana.

<table><tbody><tr><td>Clorofórmio</td><td>JT Baker</td><td>9180-03</td><td>Análise e análise TLC Extração lipídica</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>JT Baker</td><td>9070-03</td><td>Análise de TLC & Extração de lipídios</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>JT Baker</td><td>9507-05</td><td>Análise de TLC e Extração de lipídios</td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>JT Baker</td><td>9309-02</td><td>Análise de TLC e Extração lipídica</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Sigma</td><td>32203</td><td>Ensaios enzimáticos</td></tr><tr><td>água bidestilada</td><td> QUALQUER&</td><td>nbsp; NA</td><td>Ensaios enzimáticos</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>T-1503</td><td>Ensaios enzimáticos</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Baker</td><td>9535-02</td><td>Ensaios enzimáticos</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Baker</td><td>3624-01</td><td>Ensaios enzimáticos</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td>Ensaios enzimáticos</td></tr><tr><td>LB caldo</td><td>QUALQUER</td><td>NA</td><td>Crescimento bacteriano, 10 g de triptona + 5 g de extrato de levedura + 10 g de NaCl por litro de triptona de água bidestilada</td></tr><tr><td></td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>211705</td> Extrato de levedura <td>de crescimento bacteriano</td></tr><tr><td></td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>212750</td><td>Crescimento bacteriano</td></tr><tr><td>Caldo TY ANY</td><td></td><td>NA</td><td>Crescimento bacteriano, 8 g de triptona + 3 g de extrato de levedura + 66 mg CaCl2&#183; 2H2O por litro de água bidestilada</td></tr><tr><td>CaCl2&#183; 2H2O</td><td>Baker</td><td>1332-01</td><td>Ensaios enzimáticos</td></tr><tr><td>isopropil-&beta;-D-tiogalactosídeo (IPTG)</td><td>Invitrogen</td><td>15529-019</td><td>Crescimento bacteriano</td></tr><tr><td>Dietanolamina</td><td>Sigma</td><td>D-8885</td><td>Ensaios enzimáticos</td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td>221279</td><td>Ensaios enzimáticos</td></tr><tr><td>Fosfolipase A2 cobra veneno</td><td>Sigma</td><td>P0790</td><td>Ensaios enzimáticos</td></tr><tr><td>Fosfolipase C Clostridium perfringens</td><td>Sigma</td><td>P7633</td><td>Ensaios enzimáticos</td></tr><tr><td>Bis-p-fosfato de nitrofenil</td><td>Sigma</td><td>07422AH</td><td>Ensaios enzimáticos</td></tr><tr><td>p-nitrofenil estearato</td><td>Sigma</td><td>N3627</td><td>Ensaios enzimáticos</td></tr><tr><td>p</ dodecanoato de em>-nitrofenilo</td><td>Sigma</td><td>61716</td><td>Ensaios enzimáticos</td></tr><tr><td>p-decanoato de nitrofenilo</td><td>Sigma</td><td>N0252</td><td>Ensaios enzimáticos</td></tr><tr><td>p-nitrofenil palmitato</td><td>Sigma</td><td>N2752</td><td>Ensaios enzimáticos</td></tr><tr><td>p-butirato de nitrofenilo</td><td>Sigma</td><td>N9876</td><td>Ensaios enzimáticos</td></tr><tr><td>p-nitrofenil octanoato</td><td>Sigma</td><td>21742</td><td>Ensaios enzimáticos</td></tr><tr><td>Ácido acético, sal de sódio [1-14C]</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEC084</td> Dimetilsulfóxido de <td>crescimento bacteriano</td></tr><tr><td>(DMSO)</td><td>JT Baker</td><td>9224-01</td><td>Ensaios enzimáticos</td></tr><tr><td>Gel de sílica HPTLC de alumínio 60 placas. Placas de HPTLC de sílica gel tamanho 20 x 20 cm, 25 folhas.</td><td>Análise e</td> TLC da Merck <td>105547</td><td> Espectrômetro de extração de lipídios</td></tr><tr><td>UV/VIS Lambda 35</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>Ensaios enzimáticos</td></tr><tr><td>Storm 820 Phosphorimager</td><td>Molecular Dynamics</td><td>NA</td><td>Scanner de luminescência fotoestimulável&nbsp;</td></tr><tr><td>Contador de Cintilação Multifuncional</td><td>Beckman Coulter</td><td>NA</td><td>Quantificação de Radioatividade</td></tr><tr><td>Célula de Pressão Francesa</td><td>ThermoSpectronic</td><td>NA&nbsp;</td><td>Quebra de células</td></tr><tr><td>papel de cromatografia 3MM Chr</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>análise TLC</td></tr><tr><td>Sinorhizobium meliloti 1021nossa</td><td>referência 11</td><td></td><td>cepa estudada</td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Células competentes</td><td>Novagen</td><td>69451</td><td>cepa de expressão de proteína</td></tr><tr><td>pET9a vetor Novagen</td><td></td><td>69431</td><td>vetor de expressão de proteína</td></tr><tr><td>vetor pET17b</td><td>Novagen</td><td>69663</td><td>vetor de expressão de proteína</td></tr><tr><td>tubo de fundo redondo de poliestireno estéril (14 ml) Falcon</td><td>Becton Dickinson</td><td>352057</td><td>radiomarcação de culturas bacterianas</td></tr><tr><td>tubos de microcentrífuga de polipropileno (1,5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>30125.15</td><td>Ensaios enzimáticos</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicerol</td><td>Sigma</td><td>D9135</td><td>padrão lipídico</td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilcolina, dipalmitoíla</td><td>Sigma</td><td>P6267</td><td>padrão lipídico</td></tr><tr><td>DL-&alfa;-monopalmitina Sigma</td><td></td><td>M1640</td><td>padrão lipídico</td></tr><tr><td>ácido palmítico</td><td>Sigma</td><td>P0500</td><td>padrão lipídico</td></tr></tbody></table>

definindo substrato especificidades para a lipase e fosfolipase candidatos

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Microorganismos produzem um largo espectro de lipases (fosfo) que são secretadas, a fim de fazer substratos externos disponível para o organismo. Alternativamente, outros (fosfo) lipase pode ser fisicamente associado com o organismo produtor causando uma rotação de lípidos intrínsecas e frequentemente dando origem a uma remodelação das membranas celulares. Embora potenciais (fosfo) lipase pode ser previsto com um certo número de algoritmos quando a sequência do gene / proteína está disponível, não tem frequentemente sido obtida prova experimental das actividades enzimáticas, especificidades de substrato, e funções fisiológicas potenciais. Este manuscrito descreve a optimização das condições de ensaio para a (fosfo) lipase prospectivos com especificidades de substrato desconhecidos e como empregar estas condições optimizadas na pesquisa para o substrato natural de um respectivo (fosfo) lipase. Usando substratos cromogénicos artificiais, tais como derivados de p-nitrofenilo, pode ajudar a detectar uma menoractividade enzimática para um (fosfo) lipase previsto, sob condições padrão. Tendo encontrado uma actividade enzimática, tais menor, os parâmetros distintos de um ensaio de enzima podem ser variados de modo a obter uma hidrólise mais eficiente do substrato artificial. Depois de ter determinado as condições sob as quais uma enzima funciona bem, uma variedade de substratos naturais potenciais devem ser ensaiadas quanto à sua degradação, um processo que pode ser seguido utilizando métodos cromatográficos diferentes. A definição das especificidades de substrato para enzimas novas, frequentemente fornece hipóteses para um potencial papel fisiológico destas enzimas, que podem então ser testados experimentalmente. Seguindo essas orientações, fomos capazes de identificar uma fosfolipase C (SMc00171) que degrada fosfatidilcolina para fosfocolina e diacilglicerol, em um passo crucial para a remodelação das membranas na bactéria Sinorhizobium meliloti das condições de limitação de fósforo de crescimento. Para duas previu patatin-como fosfolipases (SMc00930 e SMc01003) do mesmo organismo, que poderia redefinir suas especificidades de substrato e esclarecer que SMc01003 é uma lipase diacilglicerol.

Actividade de Fosfolipase específico para PC C SMc00171 com bis-p-nitrofenil fosfato Extractos isentos de células obtidos a partir de E. coli BL21 (DE3) pLysS x, que tinha smc00171 expressa, foram estudados quanto à sua capacidade para hidrolisar ésteres de fosfato de bis-p-nitrofenilo, utilizando um ensaio espectrofotométri...

Muitas (fosfo)lipases previstas são mal caracterizadas em relação às suas especificidades de substrato e funções fisiológicas. Aqui fornecemos um protocolo para otimizar as atividades enzimáticas, procurar substratos naturais e propor funções fisiológicas para essas enzimas.

Definindo substrato Especificidades para a lipase e fosfolipase candidatos

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

O objetivo geral deste procedimento é acelerar a detecção de substratos fisiológicos para lipases e fosfolipases potenciais. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de Entomologia, como a forma pela qual as fosfolipases contribuem para a remodelação de lipídios em membranas biológicas. A principal vantagem desta técnica é que a otimização da atividade enzimática e a busca pelo substrato natural da enzima podem ser realizadas de maneira independente.Embora este método possa fornecer informações sobre a especificidade de substrato de lipases e fosfolipases bacterianas, ele também pode ser modificado para estudar hidrolases de quaisquer outros organismos modelo. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao procurar uma atividade enzimática capaz de degradar o lipídio intrínseco da membrana fosfatidilcolina em *Sinorhizobium meliloti*. Para preparar extratos proteicos livres de células, descongele as suspensões bacterianas e armazene-as em gelo.Em seguida, passe as suspensões celulares três vezes através de uma célula de pressão fria a 20.000 libras por polegada quadrada. Remova as células intactas e os detritos celulares por centrifugação a 5.000 × g du

defining-substrate-specificities-for-lipase-phospholipase

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

A fosforilação de proteínas é uma característica central de como as células interpretam e respondem às informações em seu meio extracelular. Aqui, apresentamos um protocolo de triagem de alto rendimento usando quinases purificadas de células de mamíferos para identificar rapidamente quinases que fosforilam um (s) substrato (s) de interesse.

Identificação de pares Kinase-substrato utilizando High Throughput Screening

Descrevemos um ensaio baseado em fluorescência para medir o embaralhamento de fosfolipídios em grandes lipossomas unilamelares reconstituídos com opsina.

Um ensaio baseado em fluorescência de Fosfolípido scramblase Atividade

Aqui, apresentamos uma bicamada lipídica suportada no contexto de uma plataforma microfluídica para estudar as interações proteína-fosfoinositide usando um método livre de rótulas baseado na modulação do pH.

PIP-on-a-chip: um estudo livre de rótulos de Interações Proteína-fosfoinositide

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a especificidade da protease no tecido cru rato extratos usando espectrometria de MALDI-TOF.

A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade

Apresentamos aqui um ensaio de fluorescência sensível para monitorar a atividade da apolipoproteína N-aciltransferase usando peptídeo diacilglicerilo e alquino-fosfolipídios como substratos com click-química.

Ensaio fluorométrico baseado em química de cliques para apolipoproteína N-aciltransferase da caracterização enzimática à triagem de alto rendimento

Aqui, descrevemos protocolos usando sensores lipídicos fluorescentes e lipossomos para determinar se uma proteína extrai e transporta fosfatidylserina ou fosfattidylinositol 4-fosfato in vitro.

Medidas baseadas em fluorescência de fosfatidaserina/fosfattidylinositol 4-fosfato troca entre membranas

Este protocolo utiliza o inchaço de agarose como uma técnica poderosa e generalizável para incorporar proteínas de membrana integral (IMPs) em vesículas lipídicas unilamellar gigantes (GUVs), como descrito aqui para a reconstituição da proteína humana receptora de serotonina 1A (5-HT1AR), uma das classes de receptores farmacofarologicamente importantes acoplados à proteína G.

Construção de membranas lipídicas modelo incorporando receptores acoplados de proteína G (GPCRs)

Um balanço de filme de superfície de gota pendente implementado com uma troca multi-subfase, apelidada de OCTOPUS, permite imitar condições digestivas pela troca subfásica sequencial da solução a granel original com fluidos gastrointestinais simulados. A digestão in vitro simulada é monitorada registrando in situ a tensão interfacial da camada interfacial digerida.

In vitro Digestão de emulsões em uma única gotícula via troca multifásica de fluidos gastrointestinais simulados

Este método descreve um ensaio de sedimentação in vitro baseado em lectina para quantificar a afinidade de ligação da fosfatase glucana e amilopectina. Este ensaio de co-sedimentação é confiável para medir a ligação do substrato glucana fosfatase e pode ser aplicado a vários substratos glucanos solubilizados.

Ensaio de Sedimentação à Base de Concanavalina A para Medir a Ligação ao Substrato de Fosfatases Glucanas

Apresentamos um método econômico para avaliar a permeabilidade da membrana lipossomal com sensibilidade e resolução superiores às técnicas convencionais. Usando uma nova reação de substituição de ligante encapsulada, esta técnica detecta alterações induzidas pela fosfolipase A2 nas membranas do modelo. Facilmente integrada com análises padrão, essa abordagem acessível melhora a resolução para estudar a biofísica da membrana e as interações de toxinas.

Um ensaio de permeabilidade de membrana lipossomal para investigar os efeitos dos grupos fosfato de fosfatidilinositol na ação membranotrópica do veneno PLA2

Aprenda a otimizar atividades de lipases e fosfolipases usando extratos proteicos livres de células. Este método computacional acelera a detecção de substratos fisiológicos naturais em sistemas biológicos.

Definindo substrato Especificidades para a lipase e fosfolipase candidatos

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