Name: Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprenda a monitorar funções das células NK por citometria de fluxo, incluindo degranulação e produção de citocinas. Este método otimizado para amostras pequenas é ideal para pacientes pediátricos e imunodeficientes.

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Os autores foram apoiados pelo German Cancer Aid (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe; EU), o Centro LOEWE de Terapia Celular e Genética de Frankfurt (EU, ST) financiado pelo Ministério do Ensino Superior, Pesquisa e Artes de Hesse, Alemanha (III L 4-518/17.004) e pela "Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung", Frankfurt, Alemanha (UE). BJ foi financiado por uma bolsa de pós-doutorado Mildred Scheel da Fundação Dr. Mildred Scheel para Pesquisa do Câncer. A ST foi fundada por uma bolsa de pós-doutorado GO-IN (PCOFUND-GA-2011-291776). Os autores agradecem a Becton Dickinson (BD) por fornecer os analisadores de citometria de fluxo FACSCanto II e Canto10c usados neste estudo.

<ol><li>Watzl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+trigger+a+killer%3A+modulation+of+natural+killer+cell+reactivity+on+many+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Immunol%22%5BJournal%5D)">How to trigger a killer: modulation of natural killer cell reactivity on many levels.</a> Adv Immunol. 124, 137-170 (2014).</li>
<li>Khaznadar, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+NK+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia+Patients+at+Diagnosis+Are+Associated+with+Blast+Transcriptional+Signatures+of+Immune+Evasion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Defective NK Cells in Acute Myeloid Leukemia Patients at Diagnosis Are Associated with Blast Transcriptional Signatures of Immune Evasion.</a> J Immunol. 195 (6), 2580-2590 (2015).</li>
<li>Pical-Izard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+natural+killer+cells+in+HLA-matched+HSCT+after+reduced-intensity+conditioning%3A+impact+on+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of natural killer cells in HLA-matched HSCT after reduced-intensity conditioning: impact on clinical outcome.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 21 (3), 429-439 (2015).</li>
<li>Ahlenstiel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+changes+in+natural+killer+cell+function+indicate+virologic+response+to+interferon+therapy+for+hepatitis+C%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Early changes in natural killer cell function indicate virologic response to interferon therapy for hepatitis C.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1231-1239 (2011).</li>
<li>Porrata, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+lymphocyte+recovery+predicts+superior+survival+after+autologous+stem+cell+transplantation+in+non-Hodgkin+lymphoma%3A+a+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Early lymphocyte recovery predicts superior survival after autologous stem cell transplantation in non-Hodgkin lymphoma: a prospective study.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 14 (7), 807-816 (2008).</li>
<li>Silva, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+NK-cell+exhaustion+in+advanced+melanoma+by+Tim-3+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">Reversal of NK-cell exhaustion in advanced melanoma by Tim-3 blockade.</a> Cancer Immunol Res. 2 (5), 410-422 (2014).</li>
<li>Kiessling, R., Klein, E., Wigzell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Natural%22+killer+cells+in+the+mouse.+I.+Cytotoxic+cells+with+specificity+for+mouse+Moloney+leukemia+cells.+Specificity+and+distribution+according+to+genotype%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">"Natural" killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype.</a> Eur J Immunol. 5 (2), 112-117 (1975).</li>
<li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion%2C+purification%2C+and+functional+assessment+of+human+peripheral+blood+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Mariani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+production+by+natural+killer+cells+from+nonagenarians%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemokine production by natural killer cells from nonagenarians.</a> Eur J Immunol. 32 (6), 1524-1529 (2002).</li>
<li>Reefman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+secretion+is+distinct+from+secretion+of+cytotoxic+granules+in+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytokine secretion is distinct from secretion of cytotoxic granules in NK cells.</a> J Immunol. 184 (9), 4852-4862 (2010).</li>
<li>Jacobs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+Cell+Subgroups%2C+Phenotype%2C+and+Functions+After+Autologous+Stem+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK Cell Subgroups, Phenotype, and Functions After Autologous Stem Cell Transplantation.</a> Front. Immunol. 6, 583(2015).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).</li>
<li>Theorell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+viable+quantification+of+inside-out+signals+for+LFA-1+activation+in+human+cytotoxic+lymphocytes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Sensitive and viable quantification of inside-out signals for LFA-1 activation in human cytotoxic lymphocytes by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 366 (1-2), 106-118 (2011).</li>
<li>Brander, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+human+NK+cell-mediated+cytotoxicity+by+exposure+to+ammonium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Inhibition of human NK cell-mediated cytotoxicity by exposure to ammonium chloride.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 1-14 (2001).</li>
<li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+NK+cells+from+human+blood+with+the+RosetteSep+kit+from+StemCell+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Enrichment of NK cells from human blood with the RosetteSep kit from StemCell technologies.</a> J Vis Exp. (8), e326(2007).</li>
<li>Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+cytokine+optimization+and+standard+operating+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1507-1516 (2006).</li>
<li>Baginska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B+degradation+by+autophagy+decreases+tumor+cell+susceptibility+to+natural+killer-mediated+lysis+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Granzyme B degradation by autophagy decreases tumor cell susceptibility to natural killer-mediated lysis under hypoxia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17450-17455 (2013).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+flow+cytometry-based+cytotoxic+T-lymphocyte+assay+through+detection+of+cleaved+caspase+3+in+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells.</a> J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).</li>
<li>Sutton, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serglycin+determines+secretory+granule+repertoire+and+regulates+NK+cell+and+CTL+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Serglycin determines secretory granule repertoire and regulates NK cell and CTL cytotoxicity.</a> FEBS J. 283 (5), 947-961 (2016).</li>
<li>Schönberg, K., Hejazi, M., Uhrberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+clonal+analysis+of+NK+cell+effector+functions+by+multi-parameter+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Protocol for the clonal analysis of NK cell effector functions by multi-parameter flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 903, 381-392 (2012).</li>
<li>Björkström, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+NKG2A%2C+KIR%2C+and+CD57+define+a+process+of+CD56dim+NK-cell+differentiation+uncoupled+from+NK-cell+education%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education.</a> Blood. 116 (19), 3853-3864 (2010).</li>
<li>Bryceson, Y. T., Ljunggren, H. G., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+requirement+for+induction+of+natural+cytotoxicity+and+intersection+of+activation+signals+by+inhibitory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Minimal requirement for induction of natural cytotoxicity and intersection of activation signals by inhibitory receptors.</a> Blood. 114 (13), 2657-2666 (2009).</li>
<li>Cooper, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+natural+killer+cells%3A+a+unique+innate+immunoregulatory+role+for+the+CD56%28bright%29+subset%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset.</a> Blood. 97 (10), 3146-3151 (2001).</li>
<li>Fauriat, C., Long, E. O., Ljunggren, H. G., Bryceson, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+NK-cell+cytokine+and+chemokine+production+by+target+cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regulation of human NK-cell cytokine and chemokine production by target cell recognition.</a> Blood. 115 (11), 2167-2176 (2010).</li>
<li>Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+Checkpoint+Blockade+in+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy.</a> J Clin Oncol. 33 (17), 1974-1982 (2015).</li>
<li>Glienke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+applications+of+CAR-expressing+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells.</a> Front Pharmacol. 6, 21(2015).</li>
<li>Curran, K. J., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for cancer immunotherapy.</a> J Clin Oncol. 33 (15), 1703-1706 (2015).</li>
<li>Zappasodi, R., de Braud, F., Di Nicola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoma+Immunotherapy%3A+Current+Status%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphoma Immunotherapy: Current Status.</a> Front. Immunol. 6, 448(2015).</li>
<li>Laprevotte, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+IL-8+acts+as+a+CD16+co-activator+for+natural+killer-mediated+anti-CD20+B+cell+depletion+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk+Res%22%5BJournal%5D)">Endogenous IL-8 acts as a CD16 co-activator for natural killer-mediated anti-CD20 B cell depletion in chronic lymphocytic leukemia.</a> Leuk Res. 37 (4), 440-446 (2013).</li>
<li>Maloney, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDEC-C2B8+%28Rituximab%29+anti-CD20+monoclonal+antibody+therapy+in+patients+with+relapsed+low-grade+non-Hodgkin%27s+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IDEC-C2B8 (Rituximab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-Hodgkin's lymphoma.</a> Blood. 90 (6), 2188-2195 (1997).</li>
<li>Salles, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+1+study+results+of+the+type+II+glycoengineered+humanized+anti-CD20+monoclonal+antibody+obinutuzumab+%28GA101%29+in+B-cell+lymphoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Phase 1 study results of the type II glycoengineered humanized anti-CD20 monoclonal antibody obinutuzumab (GA101) in B-cell lymphoma patients.</a> Blood. 119 (22), 5126-5132 (2012).</li>
<li>Terszowski, G., Klein, C., Stern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR%2FHLA+interactions+negatively+affect+rituximab-+but+not+GA101+%28obinutuzumab%29-induced+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">KIR/HLA interactions negatively affect rituximab- but not GA101 (obinutuzumab)-induced antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> J Immunol. 192 (12), 5618-5624 (2014).</li>
<li>Hsu, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunostimulatory+effect+of+lenalidomide+on+NK-cell+function+is+profoundly+inhibited+by+concurrent+dexamethasone+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The immunostimulatory effect of lenalidomide on NK-cell function is profoundly inhibited by concurrent dexamethasone therapy.</a> Blood. 117 (5), 1605-1613 (2011).</li>
<li>Salih, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BCR%2FABL-inhibitors+imatinib%2C+nilotinib+and+dasatinib+differentially+affect+NK+cell+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">The BCR/ABL-inhibitors imatinib, nilotinib and dasatinib differentially affect NK cell reactivity.</a> Int J Cancer. 127 (9), 2119-2128 (2010).</li>
<li>Benson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+1+trial+of+the+anti-KIR+antibody+IPH2101+in+patients+with+relapsed%2Frefractory+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A phase 1 trial of the anti-KIR antibody IPH2101 in patients with relapsed/refractory multiple myeloma.</a> Blood. 120 (22), 4324-4333 (2012).</li>
<li>Vey, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+1+trial+of+the+anti-inhibitory+KIR+mAb+IPH2101+for+AML+in+complete+remission%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission.</a> Blood. 120 (22), 4317-4323 (2012).</li>
<li>Terme, M., Ullrich, E., Delahaye, N. F., Chaput, N., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell-directed+therapies%3A+moving+from+unexpected+results+to+successful+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell-directed therapies: moving from unexpected results to successful strategies.</a> Nat Immunol. 9 (5), 486-494 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O método descrito é um método fácil, rápido e fiável para estudar as funções das células NK, a partir de amostras de sangue completo de dadores saudáveis ​​ou de pacientes. Este método oferece a grande vantagem de purificar as células NK directamente a partir de sangue total, evitando o demorado centrifugação em gradiente de densidade, que é obrigatória em muitos outros métodos de purificação 15. Além disso, requer um menor tamanho da amostra em relação ao &quot;clássico&quot; de isolamento de células NK / mé...

Como parte do sistema natural killer imune inata (NK) contribuir para a primeira linha de defesa contra as células infectadas com vírus ou transformadas de forma maligna. Um sistema de receptores inibidores e activadores lhes permite distinguir entre células transformadas e saudáveis ​​sem escorva antigénio antes em contraste com as células T. No momento do encontro célula alvo células NK liberar o conteúdo de seus grânulos citotóxicos (por exemplo, perforina, Granzimas) na sinapse imunológico para matar seu alvo. Além disso, as células NK produzem e segregam diferentes tipos de citocinas (por exemplo, interferão-y: IFN-γ; Factor de Necrose Tumoral-α: TNF-α) e quimiocinas (por exemplo, proteína inflamatória de macrófagos-1β: MIP-1b) sobre células alvo interacção citocina ou uma estimulação. Suficientes funções das células NK, tais como citotoxicidade, quimiocinas e produção de citocinas têm um impacto importante sobre o destino de diversas disfacilita. Pacientes com leucemia mostram taxas de recaída aumenta se eles apresentam um perfil de célula NK com defeito no momento do diagnóstico consiste em produção de IFN-γ reduzida e redução da expressão de ativação de receptores 2 células NK. Uma recuperação rápida do número de células NK e do funcionamento, incluindo a produção de citoquinas após interacção célula alvo está associada com uma recaída reduzida e uma melhor taxa de sobrevivência em doentes que receberam transplante de células estaminais alogénicas 3. Além disso, no início da terapêutica interferon em pacientes infectados pelo vírus da hepatite C a capacidade desgranulação das células NK periféricas é mais forte nos primeiros respondedores do que em não-respondedores 4. O número de células NK (&gt; 80 / l) no dia 15 após o transplante de células-tronco autólogas (autoSCT) em pacientes que sofrem de linfoma ou mieloma múltiplo são preditivos de uma melhor progressão livre e de sobrevida global 5. Em pacientes com melanoma, a expressão de a-célula T immunoglobulin- e mucina-domínio-contendg molécula-3 (TIM-3), uma proteína imuno-reguladora das células NK, correlaciona-se com a fase da doença e o prognóstico 6. Os cientistas têm monitorado as funções das células NK ao longo das últimas décadas. A análise inicial da citotoxicidade das células NK contra células tumorais sem escorva antes foi abordada utilizando um ensaio de libertação de 51Cr-7. Mais recentemente, os cientistas desenvolveram um método não-radioactivos para avaliar a citotoxicidade das células NK expandidos 8. Citocina e quimiocina produção tem sido frequentemente avaliado utilizando um ensaio de imunossorvente ligado técnicas a enzima (ELISA) 9,10. Durante as últimas décadas, estes métodos têm sido completada pelo fluxo de ensaios baseados em citometria. A utilização de inibidores de proteína de transporte (por exemplo, brefeldina A e monensina) e métodos de permeabilização celular em combinação com protocolos de coloração de superfície convencionais, permitiram aos cientistas estudar quimiocina e a produção de citocinas em diferentes linfa específicasubconjuntos ocyte (por exemplo, T, B ou células NK) 11. Além disso, ensaios baseados em citometria de fluxo diferentes têm sido desenvolvidos para monitorizar a citotoxicidade das células T e NK. Em 2004 Alter et ai. Descreveu a expressão de superfície da proteína associada ao lisossoma CD107a (LAMP1) em células NK mediante encontro de células alvo como um marcador para a desgranulação dos grânulos citotóxicos 12. Uma vez que uma ampla gama de diferentes fluorocromos e citómetros de fluxo multi-canal estão disponíveis nos nossos dias, tornou-se possível monitorizar simultaneamente diversas funções das células NK (citotoxicidade, produção de citoquinas e de quimioquinas) em diferentes subpopulações de células NK. Isto torna-se especialmente importante em situações em que o tamanho da amostra é limitado, por exemplo, em biopsias ou amostras de sangue de pacientes que sofrem de leucopenia. Para testar as funções das células NK globais, os ensaios baseados em citometria de fluxo diferente pode ser eficientemente combinada. Theorell et al. Células NK estimuladas de headoadores imunda com a linha de células tumorais K562 e analisados a desgranulação das células, o sinal de dentro para fora e de quimiocina produção NK através de citometria de fluxo 13. Recentemente subgrupos de células NK, fenótipos e funções em pacientes com tumor durante autoSCT foram analisados ​​por meio de fluxo ensaios baseados em citometria. Demonstrou-se que as células NK foram capazes de produzir desgranulam e citocinas / quimiocinas sobre o reconhecimento de células de tumor em tempos precoces depois autoSCT 11. Aqui é descrito um protocolo para avaliar as funções das células NK após interacção com células tumorais, incluindo a capacidade de desgranulação, produção de quimioquina e citoquina utilizando um fluxo de ensaio à base de citometria que faz com que seja possível controlar as funções das células NK em subconjuntos diferentes simultaneamente.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 + glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>6187-044</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Round Bottom Tube</td><td>BD</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>soro fetal de bezerro</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td>calor inativado antes do uso</td></tr><tr><td>Frasco em T</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690195</td><td></td></tr><tr><td>tumor K562 linha celular</td><td>DSMZ GmbH</td><td>ACC 10</td><td></td></tr><tr><td>tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK)</td><td>fabricado internamente</td><td>/</td><td>os componentes estão listados no texto</td></tr><tr><td>Água destilada: Ampuwa Sp&uuml; ll&ouml; sung 1.000 ml Plastipur</td><td>Fresenius Kabi</td><td>1088813</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 40R Centrífuga</td><td>Heraeus</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>EDTA tubos coletores de sangue</td><td>Sarstedt</td><td>386453</td><td>S-Monovette 7,5 ml, K3EDTA</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Meios hematopoiéticos (XVIVO)</td><td>Lonza Group Ltd</td><td>BE04-743Q</td><td></td></tr><tr><td>soro humano</td><td>DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M&nbsp;</td><td>/</td><td>doadores saudáveis com tipo sanguíneo AB; calor inativado antes do uso</td></tr><tr><td>Câmara de contagem melhorada por Neubauer, linha brilhante</td><td>Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd.</td><td>0640030/ 1110000</td><td></td></tr><tr><td>solução de azul de tripano (0,4%)</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>ácido acético a 3% com azul de metileno</td><td>Stemcell Technologies&nbsp;</td><td>07060</td><td></td></tr><tr><td>Microplacas tratadas com TC de 96 Poços Corning 96 Clear V-Bottom</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3894</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 96 Fundo Redondo Não Tratado Microplacas</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>351177</tr><tr><td>DPBS (Ca2+- e Mg2+-free)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>08591-1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>524400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>ionomicina&nbsp;</td><td>PromoKine</td><td>PK-CA577-1566-5</td><td></td></tr><tr><td>interleucina 15 (IL-15)</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>Proleucina S (IL-2)&nbsp;</td><td>Novartis Pharma</td><td>730523</td><td></td></tr><tr><td>Golgi Stop, Inibidor de Transporte de Proteínas (contendo Monensina)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td>Este produto pode ser usado em combinação ou em vez do Golgi Plug. A melhor combinação para o cenário experimental desejado deve ser testada.</td></tr><tr><td>Golgi Plug, Inibidor de Transporte de Proteínas (contendo Brefeldin A)</td> <td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeído</td><td>AppliChem</td><td>UN2209</td><td></td></tr><tr><td>saponina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>citômetro de fluxo: Canto10C</td><td>BD Biosciences</td> <td>/</td><td></td></tr> <tr><td>FlowJo</td><td>TreeStar Inc.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Graph Pad</td><td>Graph Pad Inc.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Separador MACSxpress</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-098-308</td><td></td></tr><tr><td>Kit de isolamento MACSxpress NK</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-098-185</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Depleção de Eritrócitos MACSxpress, humano</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-098-196</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de Tubo MACSmix&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD3 APC</td><td>Biolegend</td><td>300412</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD3 V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560366</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD14 PerCP</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-094-969</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD14 V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560349</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD16 PE</td><td>Biolegend</td><td>302008</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD16 PerCP</td><td>Biolegend</td><td>302029</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD19 PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>302216</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD19 V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560353</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD45 BV510</td><td>BD Biosciences</td><td>563204</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD56 FITC</td><td>Biolegend</td><td>345811</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD107a PE</td><td>Biolegend</td><td>328608</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano IFN-&gama; AF-647</td><td>BD Biosciences</td><td>557729</td><td></td></tr><tr><td>MIP-1 anti-humano&beta; APC-H7</td><td>BD Biosciences</td><td>561280</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Biolegend</td><td>422801</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Violet Kit de Viabilidade Fixável</td><td>Biolegend</td><td>423113</td><td>marcador de células mortas corrigível</td></tr></tbody></table>

ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células nk

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

As células natural killer (NK) são uma parte importante do sistema de vigilância imunológica do tumor humano. As células NK são capazes de distinguir entre células saudáveis e infectadas por vírus ou malignamente transformadas devido a um conjunto de receptores inibitórios e ativadores codificados na linha germinativa. Após o reconhecimento de vírus ou células tumorais, uma variedade de diferentes funções das células NK é iniciada, incluindo citotoxicidade contra a célula-alvo, bem como produção de citocinas e quimiocinas, levando à ativação de outras células imunes. Foi demonstrado que as funções precisas das células NK são cruciais para o resultado do tratamento de diferentes infecções virais e doenças malignas. Aqui, um método simples e confiável é descrito para analisar diferentes funções de células NK usando um ensaio baseado em citometria de fluxo. As funções das células NK podem ser avaliadas não apenas para toda a população de células NK, mas também para diferentes subconjuntos de células NK. Essa técnica permite que os cientistas estudem facilmente as funções das células NK em doadores ou pacientes saudáveis, a fim de revelar seu impacto em diferentes malignidades e descobrir novas estratégias terapêuticas.

<html> A estratégia de propagação para analisar a desgranulação, produção de citoquinas e de quimioquinas de toda a população de células NK e três subconjuntos de células NK diferentes estão ilustradas na Figura 1. Os resultados representativos de um dador saudável estão ilustrados na Figura 2. As células NK sem qualquer estímulo produzido nem IFN-γ nem MIP-1β e não manifestou CD107a na sua sup...

Um método simples e de confiança é descrito aqui para analisar um conjunto de funções das células NK, tais como desgranulação, produção de citocina e quimiocina dentro de diferentes subconjuntos de células NK.

Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

O objetivo geral deste procedimento é monitorar as funções das células NK utilizando um ensaio baseado em citometria de fluxo. As células natural killer são cruciais para o desfecho de diversas infecções virais e doenças malignas. Para monitorar melhor as funções das células NK, nosso laboratório aprimorou um ensaio baseado em citometria de fluxo que pode ser utilizado tanto em pesquisas científicas quanto em avaliações clínicas.Otimizamos o protocolo para permitir a análise de pequenas quantidades de células NK, o que é essencial para seu uso em pediatria e para pacientes imunodeficientes. Uma vantagem adicional dessa técnica é a possibilidade de medir as funções das células NK não apenas na população total de células NK, mas também em diferentes subpopulações de células NK. Para isolar as células NK, comece misturando o volume apropriado da solução do coquetel de isolamento de células NK com seis a 10 mililitros de sangue periférico total com EDTA de um paciente por meio de várias inversões.Em seguida, homogeneíze ainda mais a amostra em um rotador de tubos durante cinco minutos à temperatura ambiente. Depois, coloque o tubo em um separador magnético por 15 minutos em condições e

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra a atividade lítica das células natural killer contra as células-alvo coradas com fluorescência. O método permite a medição da citotoxicidade induzida por células NK colorindo células mortas e usando um citômetro de fluxo para quantificar células-alvo vivas e mortas.

Preparação de amostra de ensaio de citotoxicidade mediada por células natural killer para análise de citometria de fluxo

Este vídeo demonstra uma técnica baseada em citometria de fluxo usando dois fluorocromos para identificar células T CD4+ e CD8+, células T γδ, células B, células natural killer (NK) e monócitos em células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs). Ao incubar as células com anticorpos conjugados com fluorocromo contra os marcadores de superfície, os subconjuntos de células são identificados usando uma estratégia ideal de controle citométrico de fluxo.

Um ensaio de citometria de fluxo para identificar subconjuntos de células imunes em células mononucleares do sangue periférico

Este protocolo descreve um ensaio de citotoxicidade sensível baseado em células. Ao enumerar a diminuição na frequência de células T CD4+ alvo vivas na presença de um número crescente de células T CD8+ efetoras, este ensaio permite a avaliação direta da atividade citolítica de células T CD8+ específicas do antígeno.

Baseada em células de Citometria de Fluxo Ensaio medir citotóxicos Atividade

Este trabalho descreve um fluxo de trabalho avançado para a determinação precisa e rápida da contagem de células NK (Natural Killer) e citotoxicidade de células NK em amostras de sangue humano.

Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

Um método baseado em citometria de fluxo para determinar quantitativamente a atividade citotóxica de células humanas de assassino natural é mostrado aqui.

Um ensaio de citotoxicidade baseados em citometria de fluxo para a avaliação da atividade das células NK humana

Aqui, apresentamos um protocolo de fluxo cytometric para identificar CD4+ e CD8+ T células, as células γδ T, células B, células NK e monócitos no sangue periférico humano usando apenas dois fluorochromes em vez de sete. Com esta abordagem, cinco marcadores adicionais podem ser gravadas na maioria dos citômetros.

Discriminação de sete subconjuntos de células imunes por dois-fluorocromo citometria de fluxo

A erradicação mediada por células por células cancerígenas é importante para a iniciação e progressão do câncer. Aqui, apresentamos dois protocolos não baseados em radioatividade para avaliar a citotoxicidade mediada por célulank em relação às células tumorais hepáticas. Além disso, um terceiro protocolo é apresentado para analisar a migração de células NK.

Medição da Citotoxicidade e Migração Mediadas por Células Assassinas Naturais no Contexto das Células Tumorais Hepáticas

Um protocolo para estudar eventos orientados pela FcγRIIIa por anticorpos terapêuticos em células assassinas naturais humanas é descrito aqui. Esta plataforma de estimulação artificial permite o interrogatório de funções de efeitos a jusante, como degranulação, produção de quimiocina/citocina, e caminhos de sinalização mediados pelas porções fcγriiia e fc de anticorpos envolvidos na vinculação.

Avaliação de Eventos celulares assassinos naturais humanos impulsionados pelo engajamento da FcγRIIIa na presença de anticorpos terapêuticos

Apresentamos dois protocolos de coloração diferentes para detecção de ligantes NKG2D (NKG2DL) em amostras de leucemia mielóide aguda primária humana (LMA). A primeira abordagem é baseada em uma proteína de fusão, capaz de reconhecer todos os ligantes conhecidos e potencialmente ainda desconhecidos, enquanto o segundo protocolo conta com a adição de múltiplos anticorpos anti-NKG2DL.

Duas abordagens citométricas de fluxo de detecção de superfície de ligante NKG2D para distinguir células-tronco de subpopulações a granel em leucemia mielóide aguda

Este protocolo oferece um fluxo de trabalho padronizado in vitro. para medição consistente da citotoxicidade natural, mediada pelo receptor de antígeno quimérico e dependente de anticorpos de células humanas natural killer, utilizando imagens de células vivas e citometria de fluxo.

Quantificação da citotoxicidade de células NK potenciada por receptores de antígeno quiméricos e anticorpos terapêuticos usando imagem de células vivas e citometria de fluxo

Aprenda a monitorar funções das células NK por citometria de fluxo, incluindo degranulação e produção de citocinas. Este método otimizado para amostras pequenas é ideal para pacientes pediátricos e imunodeficientes.

Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK

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