Medindo Progressive Neurological Disability em um modelo de rato com esclerose múltipla
14 de novembro de 2016
Um protocolo de teste otimizado é apresentado neste artigo para o teste de desempenho Rotarod, usado para medir a incapacidade neurológica progressiva em camundongos infectados com TMEV.
O objetivo geral deste procedimento é avaliar o comprometimento neurológico progressivo em camundongos com doenças desmielinizantes crônicas. Conseguimos isso oferecendo recomendações de parâmetros de teste adequados para estudar a incapacidade neurológica de longo prazo no modelo de vírus Theilers de esclerose múltipla progressiva, usando o teste Rotarod. Este procedimento fornece uma linha de base para avaliar a relevância do modelo de camundongo para a desmielinização progressiva e sua utilidade para testar terapias destinadas a tratar condições neurológicas progressivas, como a esclerose múltipla.
A vantagem desse teste otimizado sobre o sistema de pontuação visual tradicional é que ele gera uma variável objetiva para quantificar o efeito a longo prazo de terapias e procedimentos experimentais nas funções motoras. Demonstrando este procedimento estará Darlene Royce, técnica do laboratório de neuroimunologia de Dartmouth. Para avaliar a coordenação do equilíbrio basal e o controle motor, inicie o protocolo de adaptação cinco dias antes da infecção por TMEV, permitindo primeiro que os camundongos se aclimatem à sala de testes por pelo menos 30 minutos.
Enquanto os mouses estão se aclimatando, predefina o Rotarod com os parâmetros de treinamento de menos cinco DPI. Em seguida, pegue um mouse pela cauda e coloque-o na haste de costas para o operador. Se o mouse cair ou pular, coloque-o de volta em sua pista no Rotarod até que todos os mouses estejam em posição.
Depois de carregar todos os quatro mouses, pressione o botão Enter para iniciar o experimento. Certifique-se de que os temporizadores iniciem automaticamente e observe as rotações por minuto em exibição para cada faixa. Então, à medida que cada animal cai da vara, registre a velocidade da vara no momento da queda, bem como a duração do tempo que o animal permaneceu na vara.
Depois que todos os ratos caírem, use um lenço de papel para remover qualquer boli fecal e urina da haste, pois a presença de urina e material fecal pode afetar a capacidade dos ratos de segurar adequadamente a haste. Após um descanso de três minutos, dê aos camundongos um segundo e depois um terceiro teste, no qual o tempo máximo por tentativa única é de 240 segundos. Administre um total de três tentativas durante cada dia de teste.
Finalmente, devolva os ratos à gaiola de casa. Nos dias menos quatro, menos três, menos dois e menos um PI, predefina o Rotarod com os parâmetros de protocolo de treinamento apropriados e repita o experimento Rotarod. Comece movendo gaiolas contendo camundongos SJL fêmeas de quatro a seis semanas do rack para um espaço de trabalho confortável.
Use punções de orelha para marcar os camundongos para permitir a avaliação individual da doença clínica e histológica. Em seguida, desenhe 30 microlitros de estoque infectante de TMEV em PBS em uma agulha de seringa de insulina de calibre 29. Prepare a máquina de gás anestésico garantindo a presença de quantidades adequadas de oxigênio e isoflurano durante o procedimento.
Coloque o animal na câmara de indução e sele a parte superior. Após alguns minutos, remova o animal da câmara e teste o mouse apertando a almofada do pé para garantir a anestesia adequada. Em seguida, limpe o local da injeção com álcool isopropílico a 70% e injete os 30 microlitros de material infectante TMEV no hemisfério cerebral direito por injeção à mão livre.
Por fim, retorne o mouse à gaiola de retenção quando estiver totalmente alerta e móvel. No sétimo dia após a infecção, predefina o Rotarod com os parâmetros experimentais apropriados e repita o exercício de treinamento completo do Rotarod com os parâmetros de protocolo experimental apropriados. Após o terceiro teste de cada dia, pesar cada camundongo e anotar o peso corporal na folha de dados.
Teste os ratos duas vezes por semana durante as seis semanas seguintes da mesma maneira. Após seis semanas, teste os camundongos uma vez por semana com o mesmo protocolo experimental por uma média de 150 dias experimentais. Em seguida, analise os dados brutos e expresse como um índice funcional neurológico, ou NFI.
Para determinar o valor individual do NFI, calcule o limite de desempenho basal de cada camundongo como a média de todos os tempos de execução de 15 a 45 dias após a infecção. Para permitir a avaliação do desempenho motor como resultado da desmielinização progressiva e excluir quaisquer déficits contribuintes devido à encefalite precoce. Em seguida, calcule o valor NFI como a média dos três tempos médios de execução mais recentes dividido pelo limite de desempenho de linha de base do mouse.
Por fim, calcule um NFI ajustado dividindo o valor do NFI pelo valor médio do NFI obtido pelo grupo tratado com simulação naquele dia específico. Esta figura mostra que os camundongos infectados com TMEV apresentam déficits neurológicos significativamente aumentados ao longo do tempo quando comparados aos camundongos controle. A infecção crônica com duas cepas diferentes de TMEV afetou negativamente os tempos de corrida dos camundongos.
Ambos os grupos de camundongos infectados com TMEV apresentaram valores de NFI significativamente mais baixos do que os de camundongos simulados. Além disso, não houve diferença comparando a progressão da incapacidade em camundongos infectados com a cepa BeAn e aqueles infectados com a cepa DA em todos os momentos. Seguindo este procedimento, os métodos tradicionais de pontuação visual, como o teste do reflexo de endireitamento, podem ser realizados para avaliar rapidamente a saúde geral em camundongos.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da esclerose múltipla e doenças neurodegenerativas testarem a eficácia de terapias e outras intervenções no retardo da incapacidade progressiva. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a incapacidade progressiva a longo prazo em camundongos. Este procedimento não é apenas útil na detecção da deficiência neurológica progressiva no modelo do vírus Theiler, mas também é útil na descoberta de deficiências em outros modelos de camundongos de doenças neurodegenerativas.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo de teste otimizado para o teste de desempenho no Rotarod, destinado a medir a deficiência neurológica progressiva em camundongos infectados com TMEV. O procedimento é projetado para avaliar o comprometimento neurológico de longo prazo associado a doenças desmielinizantes crônicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Neurologia
- Neuroimunologia
Antecedentes
- O teste Rotarod é utilizado para avaliar as funções motoras em camundongos.
- Doenças desmielinizantes crônicas, como a esclerose múltipla, afetam a coordenação motora.
- O modelo do vírus Theilers é relevante para o estudo de condições neurológicas progressivas.
- Sistemas tradicionais de pontuação carecem de objetividade na mensuração da função motora.
Objetivo do Estudo
- Oferecer um protocolo padronizado para avaliar o comprometimento neurológico em camundongos.
- Estabelecer uma linha de base para avaliar a eficácia de terapias.
- Aprimorar a objetividade das avaliações da função motora.
Métodos Utilizados
- Protocolo otimizado do teste de desempenho em Rotarod.
- Adaptação dos camundongos ao ambiente de teste antes da infecção por TMEV.
- Avaliação do equilíbrio, coordenação e controle motor.
- Comparação dos resultados com os métodos tradicionais de pontuação visual.
Resultados Principais
- O protocolo otimizado fornece uma medida confiável da função motora.
- Permite a quantificação objetiva dos efeitos de longo prazo dos tratamentos.
- Efetividade comprovada na avaliação da deterioração neurológica progressiva.
- Facilita uma melhor compreensão dos impactos terapêuticos sobre as funções motoras.
Conclusões
- O teste Rotarod otimizado é uma ferramenta valiosa para o estudo de deficiências neurológicas.
- Oferece uma abordagem mais objetiva em comparação com os métodos tradicionais.
- Este protocolo pode auxiliar no desenvolvimento de terapias para a esclerose múltipla.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação objetiva da deficiência neurológica progressiva é essencial para reduzir os riscos associados a candidatos terapêuticos em modelos pré-clínicos de EM. O teste de rotarod fornece um ponto final contínuo e mensurável que aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e apoia decisões de avanço ou interrupção em pipelines de descoberta. Parâmetros padronizados melhoram a reprodutibilidade entre laboratórios, permitindo um alinhamento confiável de biomarcadores translacionais e a triagem de portfólios.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação da diminuição da função motora como indicador funcional da desmielinização.
- Valor Operacional: Fornece dados objetivos e contínuos que reduzem a variabilidade entre avaliadores e apoiam a redução de riscos mecanicistas de alvos terapêuticos.
- Valor Preditivo: Apoia a seleção de modelos pré-clínicos ao demonstrar a progressão de déficits motores relevantes para a doença ao longo do tempo.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Parâmetros definidos de treinamento e teste garantem o estabelecimento reprodutível de uma linha de base antes da avaliação de compostos.
- Saída Quantitativa: Gera um índice funcional neurológico (NFI), permitindo análise de dose-resposta e mensuração do efeito terapêutico.
- Escalabilidade: O protocolo permite testes longitudinais por mais de 150 dias, facilitando estudos de administração crônica e avaliação da janela terapêutica.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Relevância para a Doença: Modela a desmielinização crônica e progressiva semelhante à esclerose múltipla humana, apoiando o alinhamento translacional de biomarcadores.
- Continuidade Pré-clínica: Permite o acompanhamento longitudinal da incapacidade desde a infecção inicial até as fases avançadas da doença.
- Progressão Ajustada ao Risco: A normalização do NFI em relação aos controles simulados permite comparação padronizada entre estudos e intervenções terapêuticas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio Rotarod insere-se na sequência de descobertas que vai da validação de alvos até a identificação de compostos líderes e a avaliação pré-clínica de eficácia, fornecendo uma conexão funcional entre mecanismos moleculares e resultados fenotípicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao associar intervenções genéticas ou farmacológicas a alterações mensuráveis no desempenho motor.
- Triagem: Permite a triagem padronizada e reprodutível de compostos com janelas temporais definidas para avaliação de efeitos agudos e crônicos.
- Análises: O cálculo do NFI fornece uma leitura normalizada e quantitativa para comparar a eficácia terapêutica entre diferentes pontos temporais e grupos de estudo.
- Pesquisa Translacional: Relaciona os resultados da função motora com a modelagem da progressão da doença, apoiando esforços de qualificação de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: O POP padronizado permite reutilização em diversas áreas terapêuticas que envolvem disfunção motora, incluindo modelos de ELA e lesão medular.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao fornecer dados objetivos e quantificáveis da função motora em modelos de doenças progressivas.
- Valor Operacional: Parâmetros padronizados aumentam a reprodutibilidade entre diferentes locais e reduzem a variabilidade em estudos longitudinais.
- Valor Estratégico: Melhora a confiança nas decisões de continuidade ou interrupção ao permitir a detecção precoce de efeitos terapêuticos sobre a deterioração funcional.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco por meio de métricas padronizadas de incapacidade que orientam os critérios de avanço pré-clínico.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em manejo de roedores, testes comportamentais e modelos de doenças neuroimunológicas.
- Depende de equipamento Rotarod calibrado, com controle preciso de velocidade e aceleração.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de treinamento, número de ensaios e procedimentos de processamento de dados.
- Considerações de adaptação incluem o ajuste do diâmetro da barra e da velocidade para diferentes linhagens de camundongos ou grupos etários.
- Limitações práticas incluem efeitos de confusão potenciais decorrentes de déficits não motores, como fadiga ou motivação, exigindo ensaios complementares.
