Medindo Progressive Neurological Disability em um modelo de rato com esclerose múltipla

O objetivo geral deste procedimento é avaliar o comprometimento neurológico progressivo em camundongos com doenças desmielinizantes crônicas. Conseguimos isso oferecendo recomendações de parâmetros de teste adequados para estudar a incapacidade neurológica de longo prazo no modelo de vírus Theilers de esclerose múltipla progressiva, usando o teste Rotarod. Este procedimento fornece uma linha de base para avaliar a relevância do modelo de camundongo para a desmielinização progressiva e sua utilidade para testar terapias destinadas a tratar condições neurológicas progressivas, como a esclerose múltipla.

A vantagem desse teste otimizado sobre o sistema de pontuação visual tradicional é que ele gera uma variável objetiva para quantificar o efeito a longo prazo de terapias e procedimentos experimentais nas funções motoras. Demonstrando este procedimento estará Darlene Royce, técnica do laboratório de neuroimunologia de Dartmouth. Para avaliar a coordenação do equilíbrio basal e o controle motor, inicie o protocolo de adaptação cinco dias antes da infecção por TMEV, permitindo primeiro que os camundongos se aclimatem à sala de testes por pelo menos 30 minutos.

Enquanto os mouses estão se aclimatando, predefina o Rotarod com os parâmetros de treinamento de menos cinco DPI. Em seguida, pegue um mouse pela cauda e coloque-o na haste de costas para o operador. Se o mouse cair ou pular, coloque-o de volta em sua pista no Rotarod até que todos os mouses estejam em posição.

Depois de carregar todos os quatro mouses, pressione o botão Enter para iniciar o experimento. Certifique-se de que os temporizadores iniciem automaticamente e observe as rotações por minuto em exibição para cada faixa. Então, à medida que cada animal cai da vara, registre a velocidade da vara no momento da queda, bem como a duração do tempo que o animal permaneceu na vara.

Depois que todos os ratos caírem, use um lenço de papel para remover qualquer boli fecal e urina da haste, pois a presença de urina e material fecal pode afetar a capacidade dos ratos de segurar adequadamente a haste. Após um descanso de três minutos, dê aos camundongos um segundo e depois um terceiro teste, no qual o tempo máximo por tentativa única é de 240 segundos. Administre um total de três tentativas durante cada dia de teste.

Finalmente, devolva os ratos à gaiola de casa. Nos dias menos quatro, menos três, menos dois e menos um PI, predefina o Rotarod com os parâmetros de protocolo de treinamento apropriados e repita o experimento Rotarod. Comece movendo gaiolas contendo camundongos SJL fêmeas de quatro a seis semanas do rack para um espaço de trabalho confortável.

Use punções de orelha para marcar os camundongos para permitir a avaliação individual da doença clínica e histológica. Em seguida, desenhe 30 microlitros de estoque infectante de TMEV em PBS em uma agulha de seringa de insulina de calibre 29. Prepare a máquina de gás anestésico garantindo a presença de quantidades adequadas de oxigênio e isoflurano durante o procedimento.

Coloque o animal na câmara de indução e sele a parte superior. Após alguns minutos, remova o animal da câmara e teste o mouse apertando a almofada do pé para garantir a anestesia adequada. Em seguida, limpe o local da injeção com álcool isopropílico a 70% e injete os 30 microlitros de material infectante TMEV no hemisfério cerebral direito por injeção à mão livre.

Por fim, retorne o mouse à gaiola de retenção quando estiver totalmente alerta e móvel. No sétimo dia após a infecção, predefina o Rotarod com os parâmetros experimentais apropriados e repita o exercício de treinamento completo do Rotarod com os parâmetros de protocolo experimental apropriados. Após o terceiro teste de cada dia, pesar cada camundongo e anotar o peso corporal na folha de dados.

Teste os ratos duas vezes por semana durante as seis semanas seguintes da mesma maneira. Após seis semanas, teste os camundongos uma vez por semana com o mesmo protocolo experimental por uma média de 150 dias experimentais. Em seguida, analise os dados brutos e expresse como um índice funcional neurológico, ou NFI.

Para determinar o valor individual do NFI, calcule o limite de desempenho basal de cada camundongo como a média de todos os tempos de execução de 15 a 45 dias após a infecção. Para permitir a avaliação do desempenho motor como resultado da desmielinização progressiva e excluir quaisquer déficits contribuintes devido à encefalite precoce. Em seguida, calcule o valor NFI como a média dos três tempos médios de execução mais recentes dividido pelo limite de desempenho de linha de base do mouse.

Por fim, calcule um NFI ajustado dividindo o valor do NFI pelo valor médio do NFI obtido pelo grupo tratado com simulação naquele dia específico. Esta figura mostra que os camundongos infectados com TMEV apresentam déficits neurológicos significativamente aumentados ao longo do tempo quando comparados aos camundongos controle. A infecção crônica com duas cepas diferentes de TMEV afetou negativamente os tempos de corrida dos camundongos.

Ambos os grupos de camundongos infectados com TMEV apresentaram valores de NFI significativamente mais baixos do que os de camundongos simulados. Além disso, não houve diferença comparando a progressão da incapacidade em camundongos infectados com a cepa BeAn e aqueles infectados com a cepa DA em todos os momentos. Seguindo este procedimento, os métodos tradicionais de pontuação visual, como o teste do reflexo de endireitamento, podem ser realizados para avaliar rapidamente a saúde geral em camundongos.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da esclerose múltipla e doenças neurodegenerativas testarem a eficácia de terapias e outras intervenções no retardo da incapacidade progressiva. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a incapacidade progressiva a longo prazo em camundongos. Este procedimento não é apenas útil na detecção da deficiência neurológica progressiva no modelo do vírus Theiler, mas também é útil na descoberta de deficiências em outros modelos de camundongos de doenças neurodegenerativas.