Name: Medindo Progressive Neurological Disability em um modelo de rato com esclerose múltipla (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Aprenda a medir deficiência neurológica progressiva em camundongos infectados com TMEV usando o teste de Rotarod otimizado. Este protocolo oferece avaliação objetiva de função motora para estudos de esclerose múltipla.

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Os autores agradecem à equipe do Centro de Medicina e Pesquisa Comparada (CCMR) em Dartmouth por seu cuidado especializado com os camundongos usados para esses estudos. Os autores também reconhecem Emily Clough por seu excelente suporte administrativo.

Todo o trabalho de animais utiliza protocolos revistos e aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) no Geisel Faculdade de Medicina de Dartmouth. 1. O Modelo rato <ol><li> A indução da doença desmielinizante TMEV Induzida <ol><li> Mover as gaiolas contendo SJL feminina ratos de 4 a 6 semanas de idade / jhan do rack para um espaço de trabalho confortável. Marque a ratos (por exemplo, com uma etiqueta de orelha ou punção da orelha) para permitir a avaliação individual de doença clínica e histológica. </li><li> Desenhar 30 ul de estoque TMEV infectando (unidades formadoras de 2 x 10 6 de placa; UFP) em PBS para uma seringa de insulina 29-gauge e agulha. </li><li> Prepare a máquina de gás de anestesia: verificar o sistema para garantir a presença de quantidades adequadas de oxigênio e isoflurano para a duração do procedimento. </li><li> Ligar o medidor de fluxo de 1 L / min. Colocar o animal na câmara de indução e selar o topo. Ligue o vaporizer para 3,5% e monitorar o animal até reclinada. </li><li> Remover o animal da câmara e testar o mouse por beliscar a pata para assegurar a anestesia adequada. A falta de resposta a um beliscão forte indica anestesia adequada. </li><li> Limpar o local de injecção com álcool isopropílico a 70%. </li><li> Injectar 30 ul de estoque infectar TMEV no hemisfério cerebral direito por injecção à mão livre (Figura 1). O local da injecção é de aproximadamente meio caminho entre a linha do olho e da orelha e apenas fora da linha média. </li><li> Devolver o mouse para sua gaiola de retenção, uma vez totalmente alerta e móveis (geralmente 3-5 min). </li><li> Eutanásia ratinhos por sangria ou perfusão cardíaca 3 a 6 meses após a infecção TMEV, dependendo da rapidez de desenvolvimento da doença. </li></ol></li></ol> 2. Análise Rotarod <ol><li> O Aparelho Rotarod <ol><li> ratinhos de teste antes da infecção TMEV a familiarizarem-se com omáquina e para avaliar o seu comando normal coordenação equilíbrio linha de base e motor. </li><li> Iniciar o protocolo de adaptação nos dias -5 infecção pós (dpi, ou seja, 5 dias antes da infecção TMEV). </li><li> Permitir que os ratinhos se adapte à sala de teste durante pelo menos 30 min antes do teste de rotarod, a fim de lhes permitir adaptar ao ambiente. </li><li> Certifique-se de que tanto a fonte Rotarod eo computador estão ligados e conectados entre si (Figura 2). </li><li> Pré-definir o rotarod com as -5 dpi parâmetros do protocolo de treinamento, conforme descrito na Tabela 1. </li><li> Salve o arquivo de trabalho com as informações de data e identificação. </li><li> Mover a gaiola contendo o time a ser testada a partir do rack para uma mesa ao lado do rotarod. Ratos são geralmente testados em esquadrões de 4. </li><li> Pegar um rato pela cauda e colocá-lo sobre a haste, de costas para o operador. Repita o procedimento para o segundo através da quarta mouse. Se um rato falls ou saltos, colocá-lo de volta em sua pista sobre o rotarod até que todos os ratos estão em posição. Ignorar se quaisquer camundongos virar-se para enfrentar o operador. </li><li> Depois de colocar todos os ratos, pressione o botão &quot;Enter&quot; para iniciar o experimento. Observe os temporizadores são iniciados automaticamente e as rotações por minuto (rpm) em exposição para cada pista. <ol><li> Como cada animal cai da haste, registar a velocidade da haste no momento da queda, bem como a duração do tempo que o animal permaneceu sobre a haste. A haste vai continuar a rodar até que o último animal caiu do conjunto da haste. </li></ol></li><li> Depois de todos os ratinhos tenham caído, usar um lenço de papel para remover qualquer boli fecais e de urina a partir da haste. A presença de urina e material fecal podem afectar a capacidade dos ratinhos para agarrar a haste. <ol><li> Depois de um descanso de 3 min, dar os ratos um segundo e depois um terceiro ensaio. O tempo máximo por único ensaio é de 240 segundos. Administrar um total de 3 ensaios durante cada dia de teste. </li></ol></li><li> Devolver os ratos para sua gaiola e devolvê-los de volta para o rack. No final da sessão experimental, limpar o Rotarod com sabão e água, para remover toda a matéria fecal para fora da máquina. </li><li> Limpe a placa de base com etanol 70%. Spray para baixo toda a máquina com dióxido de cloro para desinfectar. </li><li> No dia - 4, - 3, - 2, e - uma pi, pré-definir o Rotarod com os parâmetros do protocolo de formação adequadas, como descrito na Tabela 1, e repetir os passos 2.1.2 a 2.1.12. </li><li> Após a obtenção das medidas de linha de base, infectar os ratinhos com TMEV. Permitir um período de recuperação pi 6 dias. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Protocolo </td><td rowspan="2"> Dia Testing </td><td rowspan="2"> Freqüência </td><td rowspan="2"> Velocidade de partida (rpm) </td><td rowspan="2"> MaxSpeed ​​(rpm) </td><td> Aceleração </td><td> Ensaios </td><td> ITI </td></tr><tr><td> (rpm / seg) </td><td> (N x seg) </td><td> (min) </td></tr><tr><td rowspan="4"> Treinamento </td><td> - 5 dpi </td><td> 1 dia </td><td> 1 </td><td> 12 </td><td> 01/03 </td><td> 3x240 sec </td><td> 3 </td></tr><tr><td> - 4 dpi </td><td> 1 dia </td><td> 1 </td><td> 13 </td><td> 01/03 </td><td> 3x240 sec </td><td> 3 </td></tr><tr><td> - 3 dpi </td><td> 1 dia </td><td> 1 </td><td> 14 </td><td> 01/03 </td><td> 3x240 sec </td><td> 3 </td></tr><tr><td> - 2; - 1 dpi </td><td> 1 dia </td><td> 5 </td><td> 40 </td><td> 01/03 </td><td> 3x240 sec </td><td> 3 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Experimental </td><td> De 7-50 dpi </td><td> 2 / semana </td><td>5 </td><td> 40 </td><td> 30/5 </td><td> 3x240 sec </td><td> 3 </td></tr><tr><td> De 51-150 dpi </td><td> 1 / Semana </td><td> 5 </td><td> 40 </td><td> 30/5 </td><td> 3x240 sec </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Parâmetros rotarod em treinamento e protocolos experimentais. <ol start="2"><li> O protocolo experimental Rotarod <ol><li> Em 7 dpi, pré-definir o Rotarod com os parâmetros do protocolo experimentais adequadas, como descrito na Tabela 1. Repita os passos 2.1.2 a 2.1.10. </li><li> No final do julgamento # 3, pesar cada rato e fazer uma nota do peso do corpo na folha de dados. Limpar e desinfectar o rotarod como por etapas 2.1.11 e 2.1.12. </li><li> Testar os ratinhos duas vezes por semana durante as 6 semanas seguintes, como descrito acima. Após 6 semanas (em que os ratos propensos atingiram uma fase de planalto) 8,9, teste a ratos uma vez por semana com o mesmo experimental protocolo. O protocolo de teste real dura uma média de 150 dias, dependendo do curso da doença específica. </li></ol></li><li> Índice Funcional neurológica <ol><li> Exportar os dados brutos em um arquivo de planilha e analisar os resultados. </li><li> Dados expressos como tempo de execução (Figura 3A): este é o tempo de execução normal mais o tempo de rotação passiva menos o tempo de atraso de rotação (Tabela 2) 10. Calcula-se a média de tempo de execução os três ensaios por dia. </li><li> Expressar os dados como um índice funcional neurológica (IFN; Figura 3B). <ol><li> Calcule o limite de desempenho de linha de base de cada rato individual. O limiar de desempenho da linha de base é determinada como a média de todos os tempos de execução de dias + 15 e + 45 pi 6,7. </li><li> Calcula-se a IFN-se a média dos três tempos de execução médios mais recentes dividido pelo limiar de 6,7 de ratinho específico que o desempenho da linha de base &lt;/ Sup&gt;. NOTA: Se a tempos de execução testado para um rato no dia + 72, + 76 e + 79 pi são 55 seg, 45 seg e 50 seg, eo tempo de linha de base para o mesmo rato foi de 135 segundos, o NFI para esse rato no 79 dpi será [(45 + 50 + 55) / 3] / 135 ou 0,37. </li></ol></li><li> Expressar os dados como um NFI ajustado (adjNFI; Figura 3C): ajustar os dados NFI por um valor de população para o único experimento. <ol><li> Calcula-se a adjNFI pela divisão do valor da média IFN por IFN obtidos pelo grupo tratado com sham naquele dia específico. </li></ol></li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Prazo </td><td> Definição </td></tr><tr><td> tempo de funcionamento normal </td><td> O tempo total que o rato gasta funcionando ativamente sobre a haste rotativa, ou seja, a latência a cair. </td></tr><tr><td> tempo de rotação passiva </td><td> a ummontagem de tempo que o rato tem-se mantido na haste no modo de rotação passiva. </td></tr><tr><td> tempo de atraso Rotação </td><td> A quantidade de tempo que o rato permanece na vara durante o modo de rotação passiva </td></tr><tr><td> modo de rotação passiva </td><td> Quando o rato agarra a vara e roda sem ter de deambular. </td></tr><tr><td> O tempo total da sessão </td><td> A quantidade total de tempo que o rato permanece na haste rotativa durante a sessão. </td></tr><tr><td> desempenho da linha de base </td><td> desempenho motor pré-danos avaliados para determinar o limite mínimo de desempenho. </td></tr><tr><td> Índice função neurológica (NFI) </td><td> Índice clínico, o que compara cada desempenho motor do mouse, ou seja, tempo de execução, a qualquer momento para seu desempenho máximo. </td></tr><tr><td> Ajustado Índice de função neurológica (adjNFI) </td><td> Quando um processo de normalização é aplicado para ajustar os dados IFN por um valor da população paraa única experiência. </td></tr><tr><td> valor da população </td><td> valor médio IFN obtidos pelo grupo submetida a tratamento simulado a um dia específico. </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Definições de rotarod parâmetros adotados para quantificar Neurological Impairment.

<ol><li>Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theiler%27s+virus+infection+in+mice%3A+an+unusual+biphasic+disease+process+leading+to+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Theiler's virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination.</a> Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).</li>
<li>Pachner, A. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPachner%2C+AR+%22A+Primer+of+Neuroimmunological+Disease%22">A Primer of Neuroimmunological Disease</a>. , Springer. New York. (2012).</li>
<li>Rustay, N. R., Wahlsten, D., Crabbe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+genetic+susceptibility+to+ethanol+intoxication+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Assessment of genetic susceptibility to ethanol intoxication in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2917-2922 (2003).</li>
<li>McGavern, D. B., Zoecklein, L., Drescher, K. M., Rodriguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+neurologic+deficits+in+a+chronic+progressive+murine+model+of+CNS+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of neurologic deficits in a chronic progressive murine model of CNS demyelination.</a> Exp Neurol. 158, 171-181 (1999).</li>
<li>Zoecklein, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+demyelinating+disease+induced+by+the+Daniel%27s+strain+and+BeAn+strain+of+Theiler%27s+murine+encephalomyelitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of demyelinating disease induced by the Daniel's strain and BeAn strain of Theiler's murine encephalomyelitis virus.</a> Brain Pathol. 13, 291-308 (2003).</li>
<li>Gilli, F., Li, L., Campbell, S. J., Anthony, D. C., Pachner, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+B-cell+depletion+in+the+Theiler%27s+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">The effect of B-cell depletion in the Theiler's model of multiple sclerosis.</a> J Neurol Sci. 359, 40-47 (2015).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+FTY720+in+the+Theiler%27s+virus+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">The effect of FTY720 in the Theiler's virus model of multiple sclerosis.</a> J Neurol Sci. 308, 41-48 (2011).</li>
<li>Homanics, G. E., Quinlan, J. J., Firestone, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+and+behavioral+responses+of+inbred+C57BL%2F6J+and+strain+129%2FSvJ+mouse+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Be%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic and behavioral responses of inbred C57BL/6J and strain 129/SvJ mouse lines.</a> Pharmacol Biochem Be. 63, 21-26 (1999).</li>
<li>Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+post-stroke+behavior+in+mouse+models+of+focal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cerebr+Blood+F+Met%22%5BJournal%5D)">Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia.</a> J Cerebr Blood F Met. 33, 330-338 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Columbus+Instruments+Rotamex-5+Manual%22">Columbus Instruments Rotamex-5 Manual</a>. , 1-33 (2005).</li>
<li>Dunham, N. W., Miya, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+note+on+a+simple+apparatus+for+detecting+neurological+deficit+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Pharm+Ass%22%5BJournal%5D)">A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice.</a> J Am Pharm Ass. 46, 208-209 (1957).</li>
<li>Ulrich, R., Kalkuhl, A., Deschl, U., Baumgartner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+learning+approach+identifies+new+pathways+associated+with+demyelination+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Machine learning approach identifies new pathways associated with demyelination in a viral model of multiple sclerosis.</a> J Cell Mol Med. 14, 434-448 (2010).</li>
<li>Lynch, J. L., Gallus, N. J., Ericson, M. E., Beitz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nociception%2C+sex+and+peripheral+nerve+innervation+in+the+TMEV+animal+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Analysis of nociception, sex and peripheral nerve innervation in the TMEV animal model of multiple sclerosis.</a> Pain. 136, 293-304 (2008).</li>
<li>Pirko, I., Johnson, A. J., Lohrey, A. K., Chen, Y., Ying, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+gray+matter+T2+hypointensity+correlates+with+disability+in+a+murine+model+of+MS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Deep gray matter T2 hypointensity correlates with disability in a murine model of MS.</a> J Neurol Sci. 282, 34-38 (2009).</li>
<li>Oleszak, E. L., Chang, J. R., Friedman, H., Katsetos, C. D., Platsoucas, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theiler%27s+virus+infection%3A+a+model+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Theiler's virus infection: a model for multiple sclerosis.</a> Clin Microbiol Rev. 17, 174-207 (2004).</li>
<li>McCarthy, D. P., Richards, M. H., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+multiple+sclerosis%3A+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+Theiler%27s+virus-induced+demyelinating+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models of multiple sclerosis: experimental autoimmune encephalomyelitis and Theiler's virus-induced demyelinating disease.</a> Methods Mol Biol. 900, Clifton, N.J. 381-401 (2012).</li>
<li>International Mouse Phenotyping Resource of Standardised Screens. , Available from:
 Rotarod. https://www.mousephenotype.org/impress/protocol/158/12 (2016).</li>
<li>Bohlen, M., Cameron, A., Metten, P., Crabbe, J. C., Wahlsten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+rotational+acceleration+for+the+rotarod+test+of+rodent+motor+coordination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Calibration of rotational acceleration for the rotarod test of rodent motor coordination.</a> J Neurosci Methods. 178, 10-14 (2009).</li>
<li>Hopkins, M. E., Bucci, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+effects+of+exercise+on+fear+conditioning%3A+the+influence+of+time+of+day%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interpreting the effects of exercise on fear conditioning: the influence of time of day.</a> Behav Neurosci. 124, 868-872 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Apesar de algumas limitações, o teste de desempenho Rotarod representa uma importante ferramenta para avaliar a função motora e a disfunção no TMEV-IDD, bem como o efeito de intervenções farmacológicas na progressão da incapacidade em camundongos.
O teste Rotarod foi descrito pela primeira vez em 1957 como uma ferramenta para medir déficits neurológicos em roedores11. Os roedores têm que andar sobre uma haste giratória, com velocidade de rotação crescente, e tentar evitar cair no ch...

de Theiler murinos Vírus da Encefalomielite (TMEV) é um vírus de ARN de cadeia simples que neurotrópico persistentemente infecta o sistema nervoso central de murino (SNC). Em ratinhos susceptíveis, a infecção com TMEV provoca, uma doença desmielinizante imunomediada-progressiva crónica, conhecida como doença desmielinizante induzida por TMEV (TMEV-DDI). A infecção experimental de ratinhos leva um curso da doença que se assemelha observada em formas progressivas de esclerose múltipla (EM). TMEV-DID é caracterizada por duas fases distintas: a fase aguda e a fase crónica. A fase aguda é, normalmente um 1,2 encefalite subclínica leve. A segunda fase, crónica, começando cerca de um mês após a infecção, é composto por uma deficiência lentamente progressiva caracterizada por desmielinização, inflamação e axonal 1,2 danos. A fraqueza observada em ratos está associada a espasticidade e, ocasionalmente, graves espasmos tônico. Porque há atualmente nenhuma medications para melhorar a incapacidade progressiva em pacientes, os investigadores estão particularmente atraídos por TMEV-IDD, o que representa um modelo animal ideal para o acompanhamento do impacto das drogas modificadoras da doença na progressão da doença. No entanto, em ratinhos, bem como em pacientes com esclerose múltipla, a monitorização da progressão da incapacidade requer uma observação clínica contínua ao longo de períodos de tempo prolongados. Em camundongos, monitorização a longo prazo para a progressão de incapacidade pode ser realizado com o teste de desempenho rotarod. O teste de desempenho Rotarod é um teste comportamental padrão que avalia funções associadas ao motor, como coordenação, equilíbrio e fadiga em roedores. Os ratos têm a manter o equilíbrio em uma haste de giro, que é rotativa em aceleração contínua; latência do tempo de queda a partir dessa haste é gravado. Os animais com disfunção neurológica é incapaz de permanecer na haste rotativa desde que controles, e eles normalmente caem quando a velocidade de rotação é superior à suacapacidade motora. O comprometimento mais neurológica os animais têm, quanto mais cedo eles cair a vara, e quanto menor a latência é o tempo. A vantagem do teste de rotarod ao longo dos sistemas de pontuação visuais tradicionais é que ele gera um objetivo, mensurável variável o tempo de latência que pode finalmente ser utilizada para análises estatísticas para quantificar os efeitos das terapias e procedimentos experimentais 3. No Laboratório de Neuroimunologia (LONI) em Dartmouth, os ratos são submetidos a um protocolo de adaptação, onde são testados antes da infecção TMEV, a fim de familiarizá-los com a máquina e para avaliar a sua &quot;base&quot; a coordenação normal de equilíbrio e controle motor 4, 5. Uma vez que a linha de base é estabelecida e os ratinhos são infectados com TMEV, eles são testados uma vez ou duas vezes por semana ao longo de um período de vários meses. O protocolo de teste real dura uma média de 150 dias, permitindo assim uma avaliação dao declínio do equilíbrio, coordenação e controle motor durante todo o curso da doença desmielinizante. Várias centenas de TMEV-DDI e tratados de forma simulada os ratos foram testados até agora para disfunção neurológica em Dartmouth. Estes ratinhos tinham recebido vários imunomoduladores, mas nenhum agente farmacológico foi encontrado para ser eficaz no melhoramento da progressão da incapacidade 6,7. O presente artigo e o protocolo relacionado descrevem como caracterizar o comprometimento neurológico progressivo apresentado por ratos TMEV-DDI. Em particular, o protocolo oferece recomendações de parâmetros de teste específicos acredita-se ser geralmente adequados para estudar incapacidade neurológica em ratinhos TMEV-DID utilizando o teste de rotarod. Este procedimento fornece uma linha de base para avaliar (1) a relevância deste modelo de rato para progressiva MS e (2) a sua utilidade para testar terapias destinadas a tratar condições neurológicas progressivas, tais como MS. Claramente, oteste de desempenho Rotarod e a corrente de protocolo de parâmetros e de teste optimizados não só são úteis na detecção de incapacidade neurológica progressiva no modelo de ratinho TMEV-DID, mas são também úteis na detecção de deficiências em outros modelos de ratinho genética induzida por vírus e / ou de doenças neurodegenerativas.

<table><tbody><tr><td>Camundongos SJL / JCrHsd 4 a 6 semanas de idade</td><td>Envigo</td> <td># 052</td><td></td></tr><tr><td>TMEV estoque de</td><td></td><td></td><td></td>vírus</tr><tr><td>Vaporizador de isoflurano</td><td>Harvard Apparatus</td> <td># 340471</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de insulina U- 100 29 g x 0,5 cc</td><td>BD</td> <td># 328203</td><td></td></tr><tr><td>Rotamex-5 4 Lane Rota-Rod para camundongos com RS-232 e software</td><td>Columbus Instruments</td><td>#0890M</td><td></td></tr></tbody></table>

medindo progressive neurological disability em um modelo de rato com esclerose múltipla

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

Após infecção intracerebral pelo vírus da encefalomielite murina de Theiler (TMEV), camundongos SJL suscetíveis desenvolvem uma doença desmielinizante crônica-progressiva, com características clínicas semelhantes às formas progressivas de esclerose múltipla (EM). Os camundongos apresentam incapacidade progressiva com perda das funções motoras e sensoriais, que podem ser avaliadas com vários aparelhos e protocolos. Entre eles, o teste de desempenho Rotarod é um teste comportamental muito comum, com a vantagem de fornecer medições objetivas, mas muitas vezes é usado assumindo que é direto e simples. Em contraste com os sistemas de pontuação visual usados em alguns modelos de EM, que são altamente subjetivos, o teste Rotarod gera uma variável objetiva, mensurável e contínua (ou seja, período de tempo), permitindo concordâncias interavaliadores quase perfeitas. No entanto, a confiabilidade interlaboratorial só é alcançada se os vários parâmetros de teste forem replicados. Neste manuscrito, recomendações de parâmetros de teste específicos, como tamanho, velocidade e aceleração da haste; Quantidade de treinamento dado aos animais; e processamento de dados, são apresentados para o teste Rotarod.

O objectivo desta experiência representativa foi comparar a incapacidade neurológica induzida pela estirpe Daniels (DA) e tensão de feijão de TMEV. Para efeitos do presente estudo, um grupo de 32 ratinhos fêmea SJL foram infectados por via intracraniana com TMEV, quer da estirpe DA (n = 16) ou a estirpe de feijão (n = 16), e os seus sinais clínicos foram monitorizados ao longo do tempo. Um grupo adicional de 20 ratos foi tratado simulada (ou seja, solução salina foi injectado po...

Um protocolo de teste otimizado é apresentado neste artigo para o teste de desempenho Rotarod, usado para medir a incapacidade neurológica progressiva em camundongos infectados com TMEV.

Medindo Progressive Neurological Disability em um modelo de rato com esclerose múltipla

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a deficiência neurológica progressiva em camundongos com doenças desmielinizantes crônicas. Isso é alcançado por meio de recomendações de parâmetros de teste adequados para o estudo da incapacidade neurológica de longo prazo no modelo de esclerose múltipla progressiva induzida pelo vírus Theiler, utilizando o teste Rotarod. Este procedimento fornece uma linha de base para avaliar a relevância do modelo murino para desmielinização progressiva e sua utilidade para testar terapias direcionadas ao tratamento de condições neurológicas progressivas, como a esclerose múltipla.A vantagem deste teste otimizado em relação ao sistema tradicional de pontuação visual é que ele gera uma variável objetiva para quantificar o efeito a longo prazo de terapias e procedimentos experimentais sobre as funções motoras. A demonstração deste procedimento será feita por Darlene Royce, técnica do laboratório de neuroimunologia da Dartmouth. Para avaliar a coordenação de equilíbrio e o controle motor na linha de base, inicie o protocolo de adaptação cinco dias antes da infecção por TMEV, permitindo primeiro que os camundongos se aclimatizem à sala de testes por pelo menos 30 minutos.Enquanto os camundongos estão se aclimatando, configure previamente o Rotarod com os parâmetros de treinamento de menos cinco DPI. Em seguida, pegue um camundongo pela cauda e coloque-o sobre o cilindro com a cabeça voltada para longe do operador. Se o camundongo cair ou pular, coloque-o novamente em sua pista no Rotarod até que todos os camundongos estejam posicionados.Após carregar os quatro camundongos, pressione o botão enter para iniciar o experimento. Certifique-se de que os cronômetros iniciem automaticamente e observe as rotações por minuto exibidas para cada via. Em seguida, à medida que cada animal cair do bastão, registre a velocidade do bastão no momento da queda, bem como a duração do tempo em que o animal permaneceu sobre o bastão.Depois que todos os camundongos caírem, use um lenço de papel para remover quaisquer bolos fecais e urina da barra, pois a presença de urina e material fecal pode afetar a capacidade dos camundongos de segurar adequadamente a barra. Após um período de descanso de três minutos, realize um segundo e depois um terceiro ensaio, nos quais o tempo máximo por ensaio individual é de 240 segundos. Realize um total de três ensaios durante cada dia de teste.Por fim, devolva os camundongos às suas gaiolas de origem. Nos dias menos quatro, menos três, menos dois e menos um PI, configure o Rotarod com os parâmetros apropriados do protocolo de treinamento e repita o experimento no Rotarod. Comece movendo as gaiolas contendo camundongos fêmeas SJL com quatro a seis semanas de idade da estante para um espaço de trabalho confortável.Use furadores auriculares para marcar os camundongos, permitindo a avaliação individual da doença clínica e histológica. Em seguida, aspire 30 microlitros da solução estoque de TMEV em PBS para dentro de uma seringa de insulina com agulha de 29 graus. Prepare a máquina de anestesia com gás garantindo a presença de quantidades adequadas de oxigênio e isoflurano para toda a duração do procedimento.Coloque o animal na câmara de indução e feche a tampa. Após alguns minutos, retire o animal da câmara e teste o camundongo apertando a planta do pé para garantir uma anestesia adequada. Em seguida, limpe o local da injeção com álcool isopropílico a 70% e injete os 30 microlitros do inóculo de TMEV no hemisfério cerebral direito por injeção livre.Por fim, devolva o camundongo à sua gaiola de contenção assim que estiver totalmente alerta e móvel. No sétimo dia após a infecção, preajuste o Rotarod com os parâmetros experimentais apropriados e repita o exercício completo de treinamento no Rotarod com os parâmetros do protocolo experimental adequados. Após o terceiro ensaio em cada dia, pese cada camundongo e anote o peso corporal na planilha de dados.Teste os camundongos duas vezes por semana durante as próximas seis semanas da mesma maneira. Após seis semanas, teste os camundongos uma vez por semana com o mesmo protocolo experimental por um período médio de 150 dias experimentais. Em seguida, analise os dados brutos e expresse-os como um índice funcional neurológico, ou NFI.Para determinar o valor individual de NFI, calcule o limiar de desempenho basal de cada camundongo como a média de todos os tempos de corrida entre 15 e 45 dias após a infecção. Para permitir a avaliação do desempenho motor como resultado da desmielinização progressiva e excluir quaisquer déficits contribuintes devidos à encefalite precoce. Em seguida, calcule o valor de NFI como a média dos três tempos médios de corrida mais recentes dividida pelo limiar de desempenho basal do camundongo.Por fim, calcule um NFI ajustado dividindo o valor do NFI pelo valor médio do NFI obtido pelo grupo tratado com placebo naquele dia específico. Esta figura mostra que os camundongos infectados com TMEV exibem déficits neurológicos significativamente aumentados ao longo do tempo quando comparados aos camundongos controle. A infecção crônica com duas cepas diferentes de TMEV afetou negativamente os tempos de corrida dos camundongos.Ambos os grupos de camundongos infectados com TMEV apresentaram valores de NFI significativamente menores do que os de camundongos submetidos a procedimento simulado. Além disso, não houve diferença na comparação da progressão da incapacidade em camundongos infectados com a cepa BeAn e aqueles infectados com a cepa DA em todos os pontos temporais. Após este procedimento, podem ser realizados métodos visuais tradicionais de pontuação, como o teste do reflexo de endireitamento, para avaliar rapidamente a saúde geral em camundongos.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área da esclerose múltipla e doenças neurodegenerativas testarem a eficácia de terapias e outras intervenções no retardo da incapacidade progressiva. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar a incapacidade progressiva de longo prazo em camundongos. Este procedimento não é útil apenas na detecção da incapacidade neurológica progressiva no modelo do vírus de Theiler, mas também é útil para identificar prejuízos em outros modelos de camundongos de doenças neurodegenerativas.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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