Name: No estudo in vivo da Human Interaction Endotelial-pericyte usando o plug Ensaio Matrix Gel no mouse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprenda a estudar interações endotélio-perícito in vivo usando ensaio de plug de gel de matriz em camundongos. Este método permite investigar vias de sinalização na angiogênese e identificar genes associados a distúrbios vasculares.

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Dr. K. Yuan foi apoiado por um Subsídio de Desenvolvimento de Cientistas da American Heart Association (15SDG25710448) e pelo Prêmio de Prova de Conceito da Associação de Hipertensão Pulmonar (SPO121940). O Dr. V. de Jesus Perez foi apoiado por um prêmio de desenvolvimento de carreira da Fundação Robert Wood Johnson, um prêmio NIH K08 HL105884-01, um Prêmio da Associação de Hipertensão Pulmonar, um Prêmio de Pesquisa Biomédica da American Lung Association e um Prêmio de Pesquisa Translacional e Medicina Aplicada prêmio da Universidade de Stanford.

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use na Stanford University School of Medicine. NOTA: Os animais estão sob anestesia com 3% de isoflurano vaporizador e fornecimento 3% de O2 gás. O uso de pomada veterinário nos olhos pode ajudar a prevenir o ressecamento enquanto sob anestesia. 1. Preparação de células <ol><li> Crescer endoteliais e células pericyte culturas humanas em placas de 100 mm com 10 ml de a mídia apropriada. Substituir 10 ml de meio fresco a cada 2 - 3 dias até que as células atingir 80% de confluência. <ol><li> Cultura de células endoteliais (ECs) em meio completo de células endoteliais (ECM) suplementado com empresa fornecido 5% de soro fetal de bovino (FBS), 10% de penicilina / estreptomicina e suplemento de crescimento celular endotelial 10%. </li><li> pericitos cultura em meios pericyte completo (PM) suplementado com empresa forneceu 2% FBS, 10% de penicilina / estreptomicina e suplemento de crescimento pericyte 10%. </li&gt; </ol></li><li> Preparar misturas de células <ol><li> Calcula-se a quantidade necessária de células para os grupos experimentais e de controlo. NOTA: Cada plug no grupo experimental contém um milhão (1 x 10 6) ECs humana e duzentos mil (2 x 10 5) pericitos. Para o grupo controle, cada vela contém apenas 1,2 milhão de ECs humanos. O grupo de controlo negativo tem gel matriz única. Cada grupo deve incluir, pelo menos, quatro tomadas de corrente, o que exigiria dois ratos como tampões podem ser injectadas em cada lado de um rato parte inferior das costas. Três tampões serviria como triplicado para a experiência e o quarto pode ser utilizado no caso de uma falha. Preparar 25% de células adicionais para coincidir com o volume adicional de gel. </li><li> Recolher e contar as células de placas de cultura. <ol><li> Para retirar as células, remova a mídia e lavar uma vez com fosfato de 1x temperatura ambiente salino (PBS). Remover PBS, adicionar 1 ml de 0,25% EDTA de tripsina / 2,21 mM, e incubar durante 1 min. Lave as células fora da placa por adição de 2ml de meio e recolher num tubo de 15 ml. </li><li> A contagem de células utilizando um hemocitómetro de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Centrifuga-se o número adequado de células numa pelete a 400 xg durante 5 min. Para o grupo experimental, de centrifugação tanto ECs e pericitos para baixo junto em um pellet. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Preparação matriz de gel <ol><li> Descongelar completamente na matriz de gel a 4 ° C durante 4 horas ou durante a noite para se obter uma solução homogénea. Não é necessária mistura. </li><li> aliquota gel de matriz em tubos de 1,5 ml e armazenar a 4 ° C. </li><li> Pré-frio estéreis tubos de 1,5 ml e 28 g seringas de 1 cc de insulina, a 4 ° C. Cuidado: Mantenha gel matriz no gelo em todos os momentos. </li><li> Misturar na matriz de gel frio com bFGF a uma proporção em volume de 1: 100 (concentração final de bFGF = 0,5 ug / ml; bFGF solução estoque = 50 ug / ml) após reconstituição solução de gel matriz por pipetagem para cima e para baixo várias vezes, incubar em gelo por 30 - 60 min bntes de mistura com as células no passo 3.1. NOTA: Descongelar o estoque bFGF antes da mistura. Calcular o número de fichas necessárias para a injecção. Por exemplo, cada plug requer 200 gel matriz ul. Por conseguinte, preparar 25% de gel adicional. </li></ol> 3. Misturar matriz de gel com células <ol><li> Para cada grupo, ressuspender o sedimento de células (número de células contendo o caso) com o volume calculado de gel de matriz contendo bFGF. Misture com cuidado para evitar a formação de espuma e deixe no tubo de 15 ml em gelo até ratos são preparadas para injecção. </li></ol> 4. Rato Preparação <ol><li> 1 Anestesiar ratos SCID durante 5 minutos em 3% de isoflurano mais de O 2 a 3% em uma câmara de indução. Concentre-se em um grupo experimental, ratos ou 2, de cada vez. </li><li> Remover o rato da câmara de indução, lugar em um lado ventral almofada de aquecimento para baixo e rapidamente anexar um bocal focinho até o rosto do rato através de um sistema não-reinalação para fornecer anestesia em todo o injeprocedimento cção. Comutar o fluxo de gás a partir da câmara de indução para o sistema de reciclagem do ar e não diminuir a pressão do gás de 1,5% de isoflurano e 1,5% de O 2. </li><li> Remover pêlos de ambas as regiões traseiras laterais (cerca de 1 cm de diâmetro) com um creme da remoção da máquina de barbear ou cabelo. </li><li> Limpar a área da pele com uma compressa de álcool de 70%. </li><li> Devolver o mouse para a câmara de indução e repita os passos 4,2-4,4 com o segundo mouse. </li></ol> 5. Injecção matriz de gel <ol><li> Prepare um rato para injecção, anexando ao sistema não-reinalação e colocando no lado da almofada de aquecimento ventral para baixo. </li><li> Carregar o gel matriz para uma pré-arrefecida de 28 g de 1 cc de insulina seringa um rato de cada vez. <ol><li> Carregar o volume de 500 ul de gel de matriz completa em dois tampões (200 ul por encaixe e ainda 25% adicionais) para dentro da seringa. </li><li> Certifique-se para injectar o gel matriz para os ratos dentro de 3 min de carregar as células para dentro da seringa para impedir o cells se deposite no lado da seringa e para impedir a matriz de gel solidifique no interior da seringa. </li></ol></li><li> Levantar a pele volta para localizar espaço subcutâneo, em seguida, injectar 200 ul de gel matriz lentamente e uniformemente no espaço subcutâneo do posterior para trás da caixa torácica. </li><li> Remover a agulha de injecção lentamente, tendo o cuidado de evitar a matriz de gel de vazar para fora do local de injecção. Uma colisão vai formar no local da injecção. Limpe local da injecção com uma compressa embebida em álcool. </li><li> Repita os passos de injecção 5,2-5,5 no outro lado da parte traseira do rato, em seguida, deixar o mouse sobre as suas costas para 1 min para permitir a gelificação do gel matriz sobre a almofada de calor. </li><li> Delinear as duas colisões usando um marcador permanente para identificar a colisão após 14 dias. Depois de algum cabelo volta a crescer, será mais fácil encontrar a colisão. </li></ol> 6. Matrix Gel plug Isolamento: 14 dias após a injecção <ol><li> Eutanásia com humanidade os ratos por exposição do animals a&gt; 5 min de inalação de dióxido de carbono, seguido por deslocamento cervical para assegurar a morte. </li><li> Retire o bujão de gel matriz das costas do mouse. <ol><li> Remova cuidadosamente o cabelo de novo cultivadas em torno do local da injecção onde a ficha está localizado repetindo o passo 4.3. A linha de marcação indica o tamanho da colisão original sob a pele. </li><li> Excisar o encaixe juntamente com a pele e os músculos que rodeiam as camadas unidas nos lados superior e inferior do tampão, respectivamente. <ol><li> Usando finas tesouras cirúrgicas, fazer uma incisão na fronteira acentuada do tampão que é perpendicular à pele e cortar ao músculo debaixo do bujão. Em seguida, cuidadosamente cortada em torno da periferia do tampão ao longo da fronteira marcada. </li><li> Retirar a ficha, mantendo-ensanduichada entre as camadas de pele e músculo. lave imediatamente em um pequeno copo com 1x PBS para lavar o excesso de sangue. A ficha está agora pronto para ser fixado (passo seguinte, 6.3). </li></ol></li></ol></li><li> Corrigir os plug em 4% de paraformaldeído. <ol><li> Colocar todo o tampão, incluindo as camadas da pele e músculo, em um tubo de 50 ml com 25 ml de 4% de paraformaldeído durante 24 horas à temperatura ambiente sem agitação. No dia seguinte, transferir o plugue em 25 ml de etanol a 70% durante mais 24 horas antes da inclusão em parafina. NOTA: Punho paraformaldeído com cautela. Use luvas. </li></ol></li></ol> 7. Parafina Processo Matrix Gel plug <ol><li> Prepare o plug para inclusão em parafina. <ol><li> Orientar a ficha, como mostrado na Figura 1A; colocar a ficha numa cassete de tecido de modo que o lado da ficha é virada para cima e as duas camadas da pele e músculo são visíveis através da superfície do bloco de tecido que vai ser cortado em primeiro lugar durante o corte. </li></ol></li><li> Parafina incorporar a ficha de acordo com Parafina protocolos padrão 13. </li><li> Corte 8 - 10 mm de espessura fora do bloco de tecido e montar em lâminas de microscópio According a parafina seccionamento protocolos padrão 13. </li><li> Armazenar as lâminas em local seco e fresco à temperatura ambiente até que esteja pronto para a coloração. </li></ol> 8. Secções mancha com hematoxilina e eosina (H &amp; E) 13 <ol><li> De-paraffinize as secções de tecido por passagem das lâminas por meio de 100% de xileno, duas vezes, com 100% de etanol, 95% de etanol, 70% de etanol e, finalmente, 1 x PBS, cada um durante 5 min à temperatura ambiente. Deixar as lâminas em 1x PBS até ao passo seguinte. </li><li> solução de pipeta 100 mL H &amp; E para a seção e incubar por 1-5 min, ou até que haja um claro contraste entre núcleos azuis e citoplasma rosa em uma célula como visto sob um microscópio de luz na posição vertical no aumento de 10x. Tenha cuidado para não deixar que qualquer solução H &amp; E tocar o objectivo. </li><li> solução de lavagem H &amp; E fora do slide, molhando o slide em um grande copo de água da torneira, em seguida, coloque o slide em um rack no copo e lave com água corrente durante 2 min. </li><li> Move para o passo 9.8 para montar os slides. </li></ol> 9. Stain outros slides para Capilares Humanos e pericitos <ol><li> De-paraffinize as secções de tecido por passagem das lâminas por meio de 100% de xileno, duas vezes, com 100% de etanol, 95% de etanol, 70% de etanol e, finalmente, 1 x PBS, cada um durante 5 min à temperatura ambiente. Deixar as lâminas em 1x PBS até ao passo seguinte. </li><li> Ferva as seções de solução de recuperação antigênica. <ol><li> Em um copo de 2 L, preparar a solução de recuperação de antigénio de ebulição usando 1x tampão de citrato (pH 7,0) a 95 ° C num bloco de aquecimento. </li><li> Depois de ferver, coloque as lâminas em um rack de metal e mergulhe na solução de recuperação antigênica em ebulição durante 20 min. </li><li> Cuidadosamente remover o copo do bloco de aquecimento com as lâminas submersas e ainda permitir que a solução voltar lentamente à temperatura ambiente durante cerca de 30 min. </li><li> Colocar as lâminas em 1x PBS até o próximo passo. </li></ol></li><li> Bloquear as seções em tampão de bloqueio (1x PBS, 5% de soro de cabra, 00,3% de Triton X-100). <ol><li> Desenhar um círculo hidrófobo em torno das bordas de cada secção com uma caneta PAP. </li><li> Colocar as lâminas em uma bandeja de humidade com água destilada na parte inferior do tabuleiro. </li><li> Pipetar 100 ul de tampão de bloqueio para as secções assegurando-se todo o tecido é coberta por fluido (pode necessitar de mais de 100 uL). </li><li> Incubar secções com tampão de bloqueio durante 1 h. </li></ol></li><li> Incubar seções com anticorpo primário. <ol><li> Preparar uma solução com dois anticorpos primários para sondar cada secção para CD31 (ECS) e actina do músculo liso (pericitos) diluída em tampão de diluição (PBS 1x, 1% de BSA, 0,3% de Triton X-100). NOTA: Aqui, a concentração de anti-CD31 é de 1:50 e concentração actina anti-músculo liso é de 1: 300. </li><li> Incubam-se as secções durante a noite a 4 ° C com 100 ul de anticorpos primários em uma bandeja de humidade contendo água destilada. </li></ol></li><li> Lavam-se as lâminas três vezes em 1x PBST (PBS 1x + 0,1% TweEN20) durante 5 min cada lavagem. </li><li> Incubar seções com anticorpo secundário. <ol><li> Prepara-se uma solução com um anticorpo secundário anti-coelho de cabra conjugada com fluoróforo para reconhecer o anticorpo de coelho anti-CD31 diluído no tampão de diluição. <ol><li> NOTA: O anticorpo primário actina de músculo liso já é conjugado com um fluoróforo CY3, assim, não coloração do anticorpo secundário é necessária. coelho concentração de anticorpo secundário de cabra anti-é de 1: 250. </li></ol></li><li> Incubar as secções durante 1 hora com anticorpo secundário ul 100 na bandeja de umidade contendo água destilada. </li></ol></li><li> Lavam-se as lâminas três vezes em 1x PBST, durante 5 min cada lavagem. </li><li> Montar os slides. <ol><li> Pipetar 2 - 3 gotas (~ 40 - 60 L) de solução antifade montagem com coloração nuclear DAPI em cada secção. </li><li> Delicadamente, coloque um não. 1,5 tampa de deslizamento sobre as seções e solução de montagem, permitindo que o fluido para se espalhar sobre as seções e as bordasa lamela. Suavemente utilizar um dedo para pressionar para fora as bolhas de ar que podem ser localizados ao longo do percurso. </li><li> Deixe que as lâminas secar por pelo menos 1 hora antes de utilizar. </li></ol></li></ol> 10. Quantificar Capilar Densidade e Estrutura 14 <ol><li> Contar o número de capilares em H &amp; E secções coradas, expressa como # / mm 2. <ol><li> Adquirir fotos de quatro campos diferentes em um microscópio de luz na posição vertical sob 40X. NOTA: Os capilares são identificados como tubos cheios com células vermelhas do sangue. </li><li> Alternativamente, em vez de capilares contando manualmente, use imagem software de análise (por exemplo, Wimasis Análise de Imagem) para quantificar vários parâmetros de angiogênese, como o número de navio, comprimento médio navio e diâmetro, e pontos de ramificação. </li></ol></li><li> Analisar a estrutura capilar em seções de imunofluorescência corados. <ol><li> Adquirir fotos de quatro campos diferentes em um microscópio de fluorescência invertidacom cubo de filtro FITC e TxRed. <ol><li> Use um cubo FITC para a imagem ECs por excitação a 488 nm de comprimento de onda e usar um cubo TxRed de pericitos de imagem por excitação a 594 nm de comprimento de onda. <style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
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			</style></li></ol></li></ol></li></ol>

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Nenhum interesse financeiro conflitante está incluído.

O ensaio de tampão de gel de matriz tem provado ser um método conveniente e poderoso para avaliar a regulação do gene na angiogénese, os compostos angiogénicos e anti-angiogénicos in vivo, e para complementar os testes in vitro. Aqui, descrevemos em detalhe um ensaio tampão de gel matriz novela de angiogênese humana que investiga a interação entre as células endoteliais e pericitos durante a formação de vasos. Existem alguns passos novos e críticos neste protocolo....

A angiogénese é o processo pelo qual novos vasos sanguíneos são formados a partir de uma rede vascular pré-existente e 1 é o foco da pesquisa em curso em muitas áreas, desde o desenvolvimento normal da doença. Este processo dinâmico envolve a proliferação e migração de células endoteliais (ECS) e recrutamento de pericitos para a construção de um tubo vascular que é dirigida para o local que necessita de oxigénio e de nutrientes de entrega 2. Para estudar este processo requer um ensaio dinâmico igualmente, o mais importante que pode recapitular a natureza tridimensional de formação de tubos. Os ensaios in vitro de matrizes 3D foram desenvolvidos para atender a essa necessidade e têm funcionado bem para permitir que pesquisadores para definir os passos discretos no espaço e no tempo em que a angiogénese ocorre 3, 4, 5, 6. No entanto, estes modelos in vitro de matrizes 3D estão limitadas a estudar navios não-perfundidos umd, por conseguinte, não têm componentes críticos pertinentes para o processo de angiogese (por exemplo, circulando o crescimento e factores inibitórios, a tensão não natural / forças através do leito vascular) e falhar para simular o ambiente complexo presente no tecido vivo. Para resolver esta limitação, vários ensaios in vivo da angiogénese têm sido desenvolvidos 7, incluindo o ensaio de tampão de gel de matriz, que será o foco do nosso relatório 8, 9. O ensaio de matriz de tampão de gel é um ensaio in vivo de angiogénese bem estabelecido que atrai pesquisadores, pois proporciona uma plataforma robusta para testar os papéis dos diferentes células e substâncias na angiogênese. gel de matriz é uma membrana basal solução disponível comercialmente que é segregado pela linha celular de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) sarcoma de rato que solidifica em um material semelhante a gel a 37 ° C. A matriz de gel pode ser misturado com as células e / ou substâncias, tais como factores de crescimento, e injected subcutaneamente no mouse. O anfitrião ECs vai invadir a ficha ao longo de 14 dias, formar uma rede vascular, e tornar-se perfusão com sangue do hospedeiro. Até à data, os ensaios camada de gel de matriz têm-se centrado exclusivamente no estudo do comportamento da célula endotelial durante a angiogénese, no entanto, com o melhor de nosso conhecimento nenhum esforço foi feito ainda para determinar se este ensaio pode ser utilizado células endoteliais para co-cultura e pericitos para estudar como estes dois tipos de células interagem durante a angiogênese. Especificamente, a compreensão da relação entre ECs e pericitos é valioso para o estudo de doenças em que a perda de vasos sanguíneos é patológico, incluindo isquemia microvascular e doença vascular periférica 10, 11, 12. Aqui, nós descrevemos um protocolo que introduz pericitos derivadas de humanos para a mistura de gel da matriz juntamente com ECs humano e factor de crescimento de fibroblastos (bFGF). Esta mistura pode então ser injectado por via subcutânea in o dorso de ratinhos SCID para permitir a formação de pericitos, revestidos, vasos híbridos totalmente funcionais. Nosso protocolo descreve como preparar tampões de gel matriz contendo ECs humanos com ou sem pericitos humanos, colocação em ratinhos SCID e como analisar os cortes histológicos para endpoints angiogênese críticos.

<table><tbody><tr><td>PBS (Solução salina tamponada com fosfato)</td> <td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina/0,53 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Kit de mídia de células endoteliais (ECM)</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td>inclui mídia, suplemento de crescimento EC e penicilina/estreptomicina, cada um fornecido no volume apropriado para fácil mistura</td></tr><tr><td>Kit de mídia pericitária (PM)</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td>inclui meios, suplemento de crescimento de pericitos e penicilina/estreptomicina, cada um fornecido no volume apropriado para facilitar a mistura</td></tr><tr><td>de células endoteliais microvasculares pulmonares humanas primárias</td><td>Iniciativa de Avanço da Hipertensão Pulmonar</td><td></td><td>este tipo de célula também está disponível comercialmente. Células usadas na passagem 1-4</td></tr><tr><td>pericitos pulmonares humanos primários</td><td>Iniciativa de Avanço da Hipertensão Pulmonar</td><td></td><td>este tipo de célula não está disponível comercialmente, mas os paricitos cerebrais estão.&nbsp; Células usadas na passagem 1-4</td></tr><tr><td>bFGF (Fator de Crescimento de Fibroblastos básico)</td> <td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>solução estoque é 50 &mu; g/ml em 0,1% BSA em PBS, alíquotas a 50 &mu; l e armazenado a -20 graus</td></tr><tr><td>Matriz de Membrana Basal Matrigel</td><td>BD</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1 cc Seringa Insluin</td><td>BD</td><td>329410</td><td></td></tr><tr><td>SCID (Deficiência Imunológica Combinada Grave) camundongos</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>NOD. A cepa SCID IL2R gamma knockout é a melhor cepa; 4-6 semanas de idade</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, estéreis</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Tubos com tampa de rosca de 15 ml, estéril</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>caneta PAP Hemocitômetro</td><td>Life Technologies</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Creme de depilação Nair</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anticorpo primário CD31 anti-humano</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-B4737</td><td>solução de trabalho é 1:50</td></tr><tr><td>anti-humano Smooth Muscle actina CY3 anticorpo fluorescente primário</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>solução de trabalho é 1:300</td></tr><tr><td>anticorpo secundário anti-coelho de cabra; 488 / verde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>solução de trabalho é 1:250</td></tr><tr><td>Prolongar a solução DAPI de ouro</td><td>Célula Lâminas de microscópio de sinalização</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>48300-047</td><td></td></tr><tr><td>nº 1.5 lamínulas</td> Tampão de citrato <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>10x</td> Tesoura cirúrgica extra fina <td>Millipore</td><td>21545</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Formalina (paraformaldeído)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>245-685</td><td></td></tr><tr><td>de tecido</td><td>Simport</td><td>M492-12</td><td></td></tr><tr><td>soro de cabra</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr></tbody></table>

no estudo in vivo da human interaction endotelial-pericyte usando o plug ensaio matrix gel no mouse

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

A angiogênese é o processo pelo qual novos vasos sanguíneos são formados a partir de vasos existentes. O crescimento de novos vasos requer proliferação, migração e alinhamento coordenados de células endoteliais para formar estruturas tubulares, seguidos pelo recrutamento de pericitos para fornecer suporte mural e facilitar a maturação dos vasos. As abordagens atuais de cultura de células in vitro não podem reproduzir totalmente o ambiente biológico complexo onde as células endoteliais e os pericitos interagem para produzir vasos funcionais. Apresentamos uma nova aplicação do ensaio de tampão de gel de matriz in vivo para estudar as interações endotelial-pericito e a formação de vasos sanguíneos funcionais usando camundongos com mutação de imunodeficiência combinada grave (SCID). Resumidamente, o gel de matriz é misturado com uma solução contendo células endoteliais com ou sem pericitos, seguido de injeção nas costas de camundongos SCID anestesiados. Após 14 dias, os tampões de gel da matriz são removidos, fixados e seccionados para análise histológica. O comprimento, número, tamanho e extensão da cobertura de pericitos de vasos maduros (definidos pela presença de glóbulos vermelhos no lúmen) podem ser quantificados e comparados entre grupos experimentais usando plataformas estatísticas comerciais. Além de seu uso como um ensaio de angiogênese, este ensaio de tampão de gel de matriz pode ser usado para conduzir estudos genéticos e como uma plataforma para a descoberta de medicamentos. Em conclusão, este protocolo permitirá aos pesquisadores complementar os ensaios in vitro disponíveis para o estudo das interações endotelial-pericito e sua relevância para a angiogênese sistêmica ou pulmonar.

Representante H &amp; E e imunofluorescência coloração das seções camada de gel de matriz são mostrados na Figura 2. Os pontos de CE apenas fichas de exibir alguns vasos que na maioria não são perfundidos com sangue (Figura 2 parte superior esquerda, setas pretas), enquanto fichas contendo tanto ECs e pericitos mostrar vários perfundido vasos com diâmetros maiores e cobertura pericyte completa, como evidenciado por coloração SMA positivo imediatamente ad...

Nós apresentamos um protocolo para estudar as interações endotelial-pericyte humanos no rato usando uma variação do ensaio plugue angiogênese gel matriz.

No estudo in vivo da Human Interaction Endotelial-pericyte usando o plug Ensaio Matrix Gel no mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

O objetivo geral deste ensaio de gel matriz in vivo é investigar a interação de células endoteliais com parasitas. Este ensaio com matrigel foi desenvolvido para ajudar pesquisadores a estudar as principais etapas da androgênese. Além disso, permitirá a identificação de vias de sinalização responsáveis por etapas fundamentais na formação de vasos sanguíneos, bem como de genes cuja disfunção pode levar a distúrbios vasculares e outras aberrações da androgênese.A principal vantagem desta técnica é que ela nos permite estudar a formação de vasos sanguíneos in vivo envolvendo tanto as células endoteliais quanto suas células de suporte, os pericitos. Para começar, cultive culturas de células endoteliais humanas e de parasitas em placas de 100 milímetros com 10 mililitros do meio apropriado. Troque o meio a cada dois ou três dias até que as células atinjam 80% de confluência.Para preparar a solução de gel de matriz para misturar com as células, descongele um estoque de gel de matriz durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, faça alíquotas de 1,5 mililitro para armazenamento a menos vinte graus Celsius a longo prazo, ou a quatro graus Celsius por até duas semanas. Cada tampão experimental exigirá 200 microlitros de gel de matriz.Assim, um tubo estocado pode fornecer seis plugs com um excesso de 25%. Prepare cada alíquota necessária para uso adicionando 15 microlitros do estoque descongelado de beta-FGF 100x. Misture o beta-FGF na solução por pipetagem, depois incube no gelo por pelo menos 30 minutos antes de adicionar as células.Neste momento, refrigere algumas seringas de insulina de 1 cc com agulha de 28 graus para as injeções. Para coletar as células das placas de cultura, remova o meio e lave as células uma vez com PBS. Após a remoção do PBS, adicione um mililitro de solução de tripsina e retorne as placas ao incubador por um minuto.Em seguida, pipete dois mililitros de meio de cultura sobre as placas para destacar as células e colete o meio em um tubo de 15 mililitros. Agora, verifique a concentração das amostras utilizando um hemocitômetro. Em seguida, prepare alíquotas de células em tubos de 15 mililitros.Uma combinação de um milhão de células endoteliais e 200.000 parasitas é utilizada aqui para o grupo experimental. Em seguida, centrifugue as alíquotas celulares a 400g durante cinco minutos. Então, adicione o volume calculado de gel de matriz ao pellet celular e misture com pipetagem suave para não formar espuma, pois bolhas de ar não podem ser injetadas.Agora mantenha os preparos em gelo até que os camundongos estejam prontos para a injeção. Após anestesiar um camundongo com isoflurano e confirmar o estado anestesiado com um aperto no dedo do pé, fixe o camundongo ao sistema não reinalante que fornece isoflurano e coloque-o sobre o tapete aquecido, com a face ventral voltada para baixo. Em seguida, remova cerca de um centímetro quadrado de pelos de ambas as regiões laterais traseiras.Em seguida, limpe a pele exposta com álcool 70%. Depois, carregue um mililitro da solução celular preparada em uma seringa gelada, o que é suficiente para quatro implantes. Para realizar a injeção, levante a pele do dorso para localizar o espaço subcutâneo.Em seguida, injete lentamente 200 microlitros de forma uniforme no espaço subcutâneo posterior à caixa torácica e retire lentamente a agulha para evitar vazamentos. Após a injeção, formará-se uma saliência no local. Limpe o local com álcool e, em seguida, contorne a saliência com marcador permanente para que possa ser localizada posteriormente.Em seguida, repita o procedimento de injeção no outro lado do camundongo. Certifique-se de injetar todas as células dentro de três minutos, caso contrário elas começarão a aderir à seringa. A etapa de injeção é crítica e deve ser bem realizada para garantir que a rolha de gel de matriz se forme entre as camadas da pele e do músculo, de modo que a rolha mantenha uma boa forma e não se torne difusa.Antes de prosseguir para injetar o próximo camundongo, deixe o camundongo injetado permanecer sobre a placa aquecida por um minuto para dar tempo à matriz de gelificar. Após a eutanásia, posicione o camundongo na mesa cirúrgica. Após remover qualquer pelo que tenha crescido novamente no local da injeção, localize as linhas de marcação que identificam a posição do tampão.Em seguida, utilizando tesoura cirúrgica fina, faça uma incisão ao longo da borda marcada do fragmento, perpendicularmente à pele e até o músculo subjacente. Corte cuidadosamente ao redor da periferia da borda marcada. Em seguida, remova o fragmento, mantendo-o entre as camadas de pele e músculo.Lave imediatamente o coágulo em um béquer pequeno contendo PBS para remover o sangue. Em seguida, coloque todo o coágulo em um tubo de 50 mililitros com 25 mililitros de paraformaldeído 4%. Deixe fixar à temperatura ambiente por 24 horas sem qualquer agitação.No dia seguinte, transfira os fragmentos para 25 mililitros de etanol 70% por 24 horas. Em seguida, prossiga com a inclusão em parafina. Secções de fragmentos contendo apenas células endoteliais mostram que alguns vasos não são perfundidos com o sangue do hospedeiro após 14 dias in vivo.Em contraste, os plugs contendo tanto células endoteliais quanto parasitas exibem muitos vasos perfundidos após 14 dias in vivo. Esses plugs possuem células positivas para marcação de actina de músculo liso, vistas em vermelho, imediatamente adjacentes a células endoteliais positivas para CD31, vistas em verde. Portanto, os parasitas podem desempenhar um papel substancial na formação de novos vasos sanguíneos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como aplicar esta poderosa técnica in vivo para estudar a formação de vasos sanguíneos em múltiplos tipos celulares. Esta técnica abrirá caminho para que pesquisadores explorem diversas áreas da biologia vascular em modelos de camundongos. Após este procedimento, outros métodos, como PCR quantitativa e imunoblotagem ocidental, também podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como alterações na expressão gênica e proteômica.Essa técnica poderosa permitirá ao pesquisador estudar in vivo como as células endoteliais e os parasitas interagem durante a formação dos vasos sanguíneos, que é uma etapa fundamental na androgênese. Essa técnica poderosa também permitirá ao pesquisador estudar outras interações entre células que são relevantes para a compreensão de doenças vasculares, como a hipertensão pulmonar, entre outras.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui, descrevemos uma metodologia para entregar cabo de sangue humano derivado do endotélio formadoras de colônias de células (ECFCs) e derivadas da medula óssea de células-tronco mesenquimais (CTMs), incorporado em um gel de colágeno / fibronectina, por via subcutânea em ratos imunodeficientes. Esta combinação de células / gel gera uma rede vascular humano que se conecta com a vasculatura mouse.

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Neste vídeo, demonstramos a visualização em tempo real das interações entre células sanguíneas e endoteliais nas veias mesentéricas de um modelo de camundongo injetado intraperitonealmente com lipopolissacarídeo.

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Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

Descrevemos um ensaio de tampão matrigel para ilustrar o potencial angiogênico de um conjunto de fatores secretados por células cancerígenas usando duas modalidades de imagem complementares, ultrassom e endomicroscopia. O matrigel, um gel imitador de matriz extracelular (MEC), é utilizado para introduzir o hospedeiro (camundongo) com fatores angiogênicos secretados para o meio condicionado (CM).

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Ensaios In Vitro para Avaliar Formação e Perturbação de Embarque de Barreira de Sangue-Cérebro

Este apresenta protocolo um grânulo de romance em vitro ensaio que mais apropriadamente modela o processo na vivo brotando angiogênese incorporando pericitos. Esta modificação permite que o ensaio de grânulo mais fielmente recapitular as interações heterotypic celulares entre células endoteliais e células murais que são críticas para a angiogênese.

Incorporando um grânulo de célula endotelial brotando ensaio pericitos

Este ensaio utiliza células-tronco embrionárias de camundongos diferenciadas em corpos embrionários cultivadas em gel de colágeno 3D para analisar os processos biológicos que controlam a angiogênese brotada in vitro. A técnica pode ser aplicada para testar drogas, modelar doenças e estudar genes específicos no contexto de deleções embrionariamente letais.

In vitro Ensaio Tridimensional de Angiogênese Utilizando Células-Tronco Embrionárias de Camundongos para Modelagem de Doenças Vasculares e Testes de Fármacos

O método aqui apresentado pode avaliar o efeito dos reagentes na angiogênese ou permeabilidade vascular in vivo sem coloração. O método utiliza injeção de dextran-FITC através da veia caudal para visualizar neovasos ou extravasamento vascular.

Ensaio de plugue de gel de matriz in vivo modificado para estudos de angiogênese

Aprenda a estudar interações endotélio-perícito in vivo usando ensaio de plug de gel de matriz em camundongos. Este método permite investigar vias de sinalização na angiogênese e identificar genes associados a distúrbios vasculares.

No estudo in vivo da Human Interaction Endotelial-pericyte usando o plug Ensaio Matrix Gel no mouse

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