Name: Aplicação de barreiras impermeáveis combinadas com Candidate Fator Beads Soaked para estudar sinais indutores do pintainho (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprenda a usar barreiras impermeáveis e beads em embriões de pintainho para estudar sinais indutores na formação de membros. Esta técnica cirúrgica permite analisar a expressão gênica de Tbx4, Fgf10 e Fgf8.

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Este trabalho foi financiado pelo MRC grant MC.PC_13052.

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Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Nós descrevemos o uso de barreiras impermeáveis ​​para evitar a formação de gemas membros no embrião de galinha. Esta técnica tem uma série de passos críticos. Na sequência de experimentos preliminares, descobrimos que as barreiras em forma de articulação utilizados em 9, 10 permanecem no local no embrião muito melhor do que as barreiras retas. O lado distal plana da barreira adere à membrana vitelina e mantém a barreira no lugar (Figura 2C). A preparação cuidadosa da charneira em forma de barreiras de folha de alumínio, tal como descrito na etapa 1.6 protocolo é essencial para o sucesso da operação. Um segundo passo importante é garantir que os ovos não são deixados de fora da incubadora por muito tempo seguinte janelas e estadiamento antes de operar sobre o embrião. Na nossa experiência, os embriões sobreviver a uma operação de melhor se eles estão em ou perto da temperatura de incubação quando a operação é realizada. Operações devem ser realizadas o mais rapidamente possível e os ovos resealed prontaly para garantir boas taxas de sobrevivência. Muitos investigadores adicionar uma gota de antibióticos para o embrião seguinte microcirurgia antes de devolver os ovos à incubadora. A presença do líquido impedido as barreiras de furar também em posição. A adição de antibióticos também pode desalojar grânulos após a colocação. Portanto, não utilizando antibióticos, operações rápidas e boa limpeza com instrumentos é recomendado para evitar a infecção. Limpando instrumentos com 70% de etanol seguindo todas as fases de uma operação é essencial para evitar que instrumentos se torne pegajoso do contato com a membrana vitelina que pode causar ambas as barreiras ou contas de aderir a uma pinça (veja o passo protocolo 3.1.2.2). Ambas as variedades de contas utilizadas poderia cair fora do lugar após a operação. Quando a posição de barreira foi verificada no dia seguinte, não foi possível ver através da barreira de verificar se o talão permaneceu no local ou não. Nos casos em que o talão tinha caído para fora da asa bud crescimento não foi resgatado ( <strong&gt; Tabela 1). Evitando a transferência de líquido com o talão quando implantá-las significa que as contas ficar mais facilmente à superfície do corte da LPM (ver protocolo 2.3.2.3). Por último, assegurando que os embriões são corrigidos imediatamente após a colheita é fundamental para uma boa análise de expressão gênica subsequente (veja o passo protocolo 4.2). Este protocolo modifica experiências publicadas anteriormente que usaram barreiras para impedir que membros de iniciação broto, define as larguras ideais específicas para barreiras e introduz combinando barreira e talões seguido por análise de expressão gênica. Encontrámos utilizando folha de alumínio convencional, que é barato e facilmente disponível em todos os laboratórios, produz resultados iguais aos que anteriormente utilizado folha de tântalo. A folha pode ser deixado no embrião aquando da realização de hibridização in situ (Figura 2C &#39;), mas que normalmente se removê-lo mais do que um embrião está a ser processado para evitar que as arestas da folha de danificar embriões. PIlot estudos demonstraram que a largura de perna barreiras região é particularmente importante. Inicialmente, as barreiras testadas eram muito curtos e crescimento perna bud não foi evitado. 1,2-1,3 mm é a largura ideal para uma barreira para bloquear conseqüência bud perna completamente. As barreiras asa mais estreitos que se pode colocar com precisão para evitar a conseqüência bud dar as melhores taxas de sobrevivência. Isto pode ser tão estreito quanto 0,5-0,7 mm. No entanto, as barreiras que são um pouco mais amplo são mais propensos a resultar em bloqueio completo da asa bud crescimento porque permitem um pouco de imprecisão de colocação (que usamos 0,7-1 mm). Prevenção de vasos sanguíneos ao fazer a incisão é fundamental para níveis de barreira à asa bud. barreiras semipermeáveis ​​têm sido utilizados anteriormente para bissetriz do broto de membro do pintinho. MacCabe e Parker, 1976 e Summerbell, 1979 filtros utilizados tanto de 0,45 um e 0,8 um de tamanho de poro, respectivamente 16, 17. Eles relataram que os sinais difusíveis pode passar através dos poros dos filtros e queresultados obtidos com barreiras semi-permeável foram a meio caminho entre um broto de membro com nenhuma barreira de presente e um com uma barreira de folha de tântalo impermeável. Este protocolo poderia ser adaptado para utilizar as barreiras semi-permeáveis ​​de diferentes graus de tamanho de poro para diferenciar sinais de candidatos com base no tamanho ou para modificar a dinâmica de difusão de sinal. Este protocolo tem várias limitações, principalmente associados ao modelo próprio organismo. Tais técnicas podem ser usadas para sondar mais perguntas em desenvolvimento dos membros e também outras questões de embriogênese dos vertebrados. A condição é que o órgão / área em questão deve desenvolver quando o embrião de galinha é acessível a intervenção. A presença de grandes vasos sanguíneos na área onde uma barreira necessita de ser colocado torna a colocação de barreira mais tarde do que a fase 13 ou 14 de um desafio técnico. Se grandes vasos sanguíneos são cortadas durante a colocação do obstáculo que isto poderá causar mortalidade embrionária. A nossa investigação de quando os factores de transcrição TBX5 e Tbx4 são primeiro induzida no LPM foi limitada pela fase mais próxima em que se pode colocar uma barreira que, mais tarde, acabam oposto, quer a asa ou broto perna, respectivamente. Pode ser esclarecedor para tentar bloquear a indução do gene Tbx em fases anteriores, mais perto de gastrulação. O mais antigo de uma barreira pode ser colocada na região da asa presuntivo foi com sucesso fase 8 e na fase região perna 10. Este protocolo não é provavelmente adequado para o estudo da expressão do gene para além fases brotos de membros, porque o crescimento rápido subsequente deslocaria a barreira e resultados incidiria apenas para a posição inicial da barreira. Tendo relatado as limitações do embrião de pinto, neste contexto, as suas vantagens sobre outros organismos modelo de vertebrados são muitas. O embrião de galinha é um modelo animal bastante adequado para este tipo de intervenção física num embrião de vertebrado. Os embriões são relativamente grandes e são facilmente acessíveis atragh casca do ovo. Pode-se voltar para o embrião para experimentação adicional (por exemplo, a retirada de um talão 18 ou mesmo uma barreira) ou para verificar o progresso simplesmente removendo a fita janela. Não é possível escopo para incluir imagens ao vivo ou imagem lapso de tempo. Nós descrevemos um método de janelamento ovos de galinha que é particularmente adequado para operar em embriões em estágio inicial. No caso de estudos de membros é muito importante e útil que não é um membro contralateral de controlo para cada experimento que serve como um controlo interno ideal para cada réplica biológica. A combinação do uso de barreiras impermeáveis ​​para impedir a excrescência do membro e grânulos embebidos em moléculas de sinalização não foi relatada antes. A nossa análise da expressão de mRNA na sequência de tais intervenções também é romance. Estas técnicas nos permitiu dissecar o difícil problema de quando membros de transcrição específico fatores Tbx5 e Tbx4 são induzidas na LPM e tambémpara mostrar que, mais tarde, antes da iniciação limb bud, a presença desses genes TBX no LPM não é suficiente para a activação de FGF10 de transcrição e o início do crescimento de brotos de membros. Figuras 2G, 2D e 2E ilustram estas conclusões bem. A ausência de expressão Tbx4 após a inserção de uma barreira na fase 10 na figura 2G está em contraste com a sua presença em 2D e 2E após a inserção de barreira na fase 15, após a indução da Tbx4. A implantação de contas RA embebido facilitou o resgate do membro de iniciação bud após a inserção de barreira e então aponta para RA de somitos sendo essencial na LPM antes de brotos de membros conseqüência pode começar. Tais técnicas podem ser usadas para resolver outras questões no desenvolvimento dos membros, mas também outras questões de embriogênese dos vertebrados. Áreas do cérebro, olho e do tronco são susceptíveis de ser adequado.

embriologistas clássicos tradicionalmente empregadas técnicas físicas para interrogar os mecanismos que controlam o desenvolvimento embrionário. Nos anos 1960 e 1970, os investigadores desenvolveram técnicas que usaram barreiras impermeáveis ​​inseridos entre tecidos do embrião em desenvolvimento para demonstrar a importância de sinais indutores durante a embriogênese. Nosso interesse é o desenvolvimento dos membros de vertebrados e, em particular, os eventos que precedem membro bud crescimento. Por exemplo, a inserção de uma barreira pode impedir brotos de membros crescimento ocorra de um lado do embrião de galinha, enquanto que lhe permita continuar normalmente sobre o lado contralateral não operado. Os materiais utilizados para fazer essas barreiras variada; por exemplo, placas de mica 1 e tântalo folha 2. Estas barreiras eficazmente separar a mesoderme lateral (LPM), a partir do qual as formas de brotos de membros, dos somitos formada a partir da mesoderme paraxial. técnicas de enxerto cirúrgico demonstram que perto sagacidade associaçãoh somitos é essencial para a iniciação brotos de membros é que ocorra no LPM 3 4. Nos anos 80 e 90 biólogos do desenvolvimento descobriu difusível moléculas que são essenciais no controle de processos de desenvolvimento sinalização. Grânulos embebido com essas moléculas de sinalização pode ser implantado em regiões específicas do embrião e produzem alterações de desenvolvimento embrionário. Por exemplo, o ácido retinóico (RA) ocupada por grânulos de troca iônica é liberado ao longo de um período de 24 horas, quando implantada em um embrião de galinha e pode produzir a duplicação espelho-imagem dos dígitos 5. Heparina contas de acrílico contendo proteína FGF pode iniciar membro bud conseqüência da LPM interlimb 6. Mais recentemente rato e peixe genética tomaram o estudo da iniciação vertebrados membro em uma nova era (revisto em 7). Há boas evidências de que a AR presente em somitos antes do início do membro bud é o sinal difusível essencial pretendida pelo LPM para iniciar membro brotação. Nós quisemos explorar a acessibilidade e robustez experimental do embrião de galinha para dissecar os efeitos do implante de barreira na expressão do gene na LPM em torno do momento do início do membro bud. Uma nova adaptação do nosso método é combinar uma barreira que bloqueia os sinais provenientes de tecidos axiais com talões de lateral para a barreira a factores endógenos candidatos fornecimento exogenamente que foram bloqueados pela barreira. Os seguintes protocolos são aqueles desenvolvidos para destrinchar os mecanismos de indução botão do membro e iniciação. Estudar iniciação membro bud significa o uso de embriões em fase inicial. Muitos ovos janela pesquisadores de frango por primeiro remover alguns dos albumina através do saco de ar com uma agulha hipodérmica. O embrião, que se encontra em cima da gema, então encontram-se menor no ovo. Esta é uma vantagem para algumas técnicas, tais como electroporação, mas pode ser uma desvantagem se a manipulação cirúrgica do embrião é desejada.Encontramos tendo o embrião o mais próximo possível da abertura na ovo quanto possível, é uma vantagem. Questões permanecem sobre os sinais que controlam a indução botão do membro dos vertebrados e iniciação e os seguintes protocolos são adequados para resolvê-los. Somos o primeiro a desenvolver um protocolo para a inserção de barreiras para impedir que membros do pintainho bud crescimento numa fase mais cedo do estágio 12 8. versões modificadas destes protocolos também poderia ser usado para abordar outras questões sobre a origem eo calendário das pistas indutivos, onde um tecido indutor acessíveis, adjacente ao primórdio sendo induzido. Desde que a região do embrião é acessível na fase de desenvolvimento correspondente, em seguida, uma barreira pode ser colocado entre os dois tecidos e consequentes alterações no desenvolvimento estudados. Exemplos podem ser encontrados no desenvolvimento do cérebro, a extensão do eixo e possivelmente desenvolvimento de órgãos, tais como a indução de fígado ou rim.

<table><tbody><tr><td>Pinça de relojoeiro Dumont No. 5, x2</td><td>Ferramentas de Belas Ciências&nbsp; www.finescience.de</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de relojoeiro Dumont No. 4, x2</td><td>Ferramentas de Belas Ciências&nbsp; www.finescience.de</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Pinça forte Dumont, tipo AA</td><td>Ferramentas de Belas Ciências&nbsp; www.finescience.de</td><td>11210-10</td><td></td></tr><tr><td>Tesouras curvas com lâminas de 2,5 cm de comprimento</td><td>Ferramentas de Belas Ciências&nbsp; www.finescience.de</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinça curva com ponta romba, termina aprox 0.5&nbsp; cm de comprimento</td><td>Ferramentas de Belas Ciências www.finescience.de</td><td>11065-07</td><td></td></tr><tr><td>Pino de aço, 0,2 mm de largura</td><td>Ferramentas de Belas Ciências&nbsp; www.finescience.de</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Pedra de afiar, quadrada</td><td>Ferramentas de Belas Ciências&nbsp; www.finescience.de</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>Óleo</td><td></td><td></td><td></td>mineral</tr><tr><td>Porta-agulhas</td><td>Ferramentas de Ciência Fina&nbsp; www.finescience.de</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Fita transparente, 50 mm x 66&nbsp; m</td><td>www.5staroffice.com</td><td>295985</td><td></td></tr><tr><td>proteína</td><td></td><td></td> FGF4 <td>Um presente de Cliff Tabin.</td></tr><tr><td>ácido trans-retinóico Sigma</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>R2625-50MG</td><td>Lembre-se de proteger da luz.</td></tr><tr><td>BMS 493</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>B6688-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi nº 15</td><td>www.swann-morton.com</td><td>cat nº 0105</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Blue, gel de cromatografia de afinidade</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>153-7301</td><td>Grânulos para fornecer proteína.</td></tr><tr><td>AG1-X2 Resina de troca iônica</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>140-1251</td><td>Grânulos para entrega de RA ou BMS 493.</td></tr><tr><td>Incubadora para ovos</td><td>Memmert www.hce-uk.com</td><td>LAB128</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>P6148-1KG</td><td>Nocivo, irritante, corrosivo.&nbsp; Manuseie o pó na hotte com vestuário de proteção completo.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alta glicose</td><td>Gibco www.thermofisher.com</td><td>41965-039</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific webshop.fishersci.com</td><td>D/4121/PB08</td> Microscópio Binocular <td>de 500 ml</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Leica www.leica-microsystems.com</td><td>MZ6</td><td>substituído por M60</td></tr><tr><td>ovos de galinha</td><td>Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com</td><td></td><td>Ovos marrons</td></tr></tbody></table>

aplicação de barreiras impermeáveis ​​combinadas com candidate fator beads soaked para estudar sinais indutores do pintainho

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

O embrião de galinha fornece um modelo vertebrado excelente que pode ser usado para dissecar questões de desenvolvimento de uma forma direta. Sua acessibilidade e robustez após intervenção cirúrgica são os pontos fortes experimentais chave. Placas de mica foram as primeiras barreiras usadas para evitar membro pintainho bud iniciação 1. Protocolos que utilizam uma folha de alumínio como uma barreira impermeável à bud asa ou indução perna botão e ou iniciação são descritos. Combinamos esta técnica com laterais colocação talão para a barreira para exogenamente fatores endógenos candidatos de abastecimento que foram bloqueados pela barreira. Os resultados são analisados utilizando a hibridação in situ da expressão do gene subsequente. Nosso foco principal é sobre o papel da sinalização do ácido retinóico na indução e iniciação depois de o primeiro plano embrião de galinha e dos membros posteriores. Usamos BMS 493 (um agonista inverso de receptores do ácido retinóico (RAR)) grânulos embebidos implantados na mesoderme lateral (LPM) para imitar o efeito de uma barrarier colocado entre os sómitos (uma fonte de ácido retinóico (RA) e o LPM) a partir da qual crescem brotos dos membros. versões modificadas destes protocolos também poderia ser usado para abordar outras questões sobre a origem eo calendário das pistas indutivos. Desde que a região do embrião de galinha é acessível no estágio de desenvolvimento relevante, uma barreira pode ser colocado entre os dois tecidos e consequentes alterações no desenvolvimento estudados. Exemplos podem ser encontrados no cérebro, a extensão do eixo em desenvolvimento e no desenvolvimento de órgãos, tais como a indução de fígado ou rim.

O protocolo detalhado acima descreve os métodos utilizados nos Nishimoto et al. De 2015. O artigo estuda a indução botão do membro e iniciação, tanto na frente e dos membros posteriores do embrião de galinha. Resultados após a inserção de barreiras impermeáveis para evitar o crescimento do broto do membro anterior foram publicados anteriormente 1, 2, 9, mas houve apenas barreiras que descrevem um estudo que impedem perna bud iniciação 1. Dados de membro posterior Nishimoto et al. De 2015 são aqui apresentados como resultados representativos do estudo da expressão de mRNA após a inserção de barreira. Tbx4 ​​Expressão na LPM não é suficiente para iniciar membros posteriores Conseqüência: Figuras 2B e C (Tabela 2) mostra que a inserção de barreira na fase 15 (Figura 2A) (ver protocolo 3.2) leva a ambos FGF10e expressão Fgf8 estando ausente na região da perna broto (denotado por faixa) sobre o lado direito operado. Compare com o lado não operado esquerda. No entanto, a expressão Tbx4 é observado em ambas as fases 19 e 23 de fase no lado operado (Figura 2D e E). Concluímos que a expressão Tbx4 por si só não é suficiente para iniciar a excrescência dos membros posteriores do LPM. Outros estudos em o pintainho têm sugerido que a expressão do gene Tbx é suficiente para iniciar a formação do membro anterior botão 12, 13. Figura 2C &#39;é incluído para ilustrar como uma barreira parece embutida na região da perna do embrião de pós fixação. Na maioria dos casos as barreiras foram removidas antes da hibridação in situ (protocolo 4.3). RA dos Somitos é essencial na LPM antes FGF10 Induz Limb Bud Outgrowth: A Figura 3A é uma vista esquemática que representa a adição de um grânulo distai RA embebido com uma barreira inserido na fase 15 (protocolo 3.2.1.3). Subsequentemente a esta operação excrescência brotos de membros (indicado por um asterisco) é observado no lado direito operado e Tbx4, FGF10 e Fgf8 são expressos pela raiz como são no lado do controlo para a esquerda (Figura 3B, C e D, Tabela 2) . Assim, além de RA para o LPM supera o efeito da barreira e do membro de iniciação broto rendimentos. Conclui-se que, em RA desenvolvimento normal do somitos é essencial para o LPM antes excrescência brotos de membros pode ser iniciado. Os brotos dos membros posteriores resultantes são geralmente menores do que aqueles no lado de controlo. Isto pode ser devido à dose de RA no LPM não sendo equivalente à situação de tipo selvagem. Se a dose RA é muito alto o apical ectodérmica de Ridge (AER) pode ser encurtado e botões menores resultaria14, 15. Para confirmar que a AR (a partir de somitos) na LPM é necessário para o normal iniciação brotos de membros de um agonista inverso de RAR, BMS 493, foi usado. Grânulos são implantados no LPM região perna na fase 15 (ver protocolo 3.2.1.4) (Figura 3E). FGF10 expressão é regulada negativamente após a aplicação de BMS 493 pérolas na LPM, resultando em brotos dos membros posteriores menores em comparação com o lado de controlo (Figura 3F; Tabela 3). Grânulos de controlo de DMSO não causam esses defeitos (Figuras 3G e 3H; Tabela 3). Os defeitos observados após a aplicação BMS 493 são mais leves do que os induzidos por uma operação de barreira; ou seja, FGF10 ainda está expressa e brotos dos membros são formados. É provável que isto seja porque os efeitos de BMS 493 estão restritos localmente em torno dos grânulos e podem não ser capazes de antagonizar o RA todo produzido por axitecidos al. No início Sinais axial Especifique as células LPM que decidam expressar Tbx4: Testamos quando o LPM adquire a sua capacidade de expressar Tbx4 na região potencial de formação de perna. A etapa mais próxima em que uma barreira pode ser inserido, que em seguida bloquear perna bud conseqüência, é palco 10. Somos o primeiro a desenvolver um protocolo para inserir barreiras em estágios mais cedo do estágio 12. Barreiras inseridos entre a mesoderme paraxial ea perna presuntivo LPM na fase 10 (ver protocolo 3.4) a formação dos botões perna bloco e a expressão de Tbx4 na LPM formador de perna (Figuras 2F e 2G, Tabela 2), sugerindo que é necessário um sinal a partir de tecidos axial na etapa 10 para a expressão posterior Tbx4 na LPM hindlimb. Compare este resultado com figuras 2D e E, onde a inserção barreira mais tarde permite a expressão Tbx4para ser estabelecida. Além disso, testou-se este sinal pode ser axial RA observando se o agonista inverso de RAR reduz a expressão Tbx4. A BMS 493 talão colocado na LPM hindlimb na fase 10 (ver protocolo 3.4.1.3) regula negativamente a expressão Tbx4 (Figuras 2 horas e 2?), Enquanto esferas de controlo embebidos em DMSO não afetam expressão Tbx4 (Figuras 2J e 2K). Em conjunto, estes resultados apoiam um modelo de que um sinal de AR a partir de tecidos axiais regula indução membro regulando positivamente Tbx4 no membro posterior 7 LPM. Morte pós-operatória: As Tabelas 1, 2 e 3 dão detalhes de resultados experimentais, incluindo o número de embriões de galinha que morreu pós-operação e antes da colheita. Algumas mortes são esperadas após microcirurgia desta natureza. O números de morte pode ser mantido<html> a um mínimo, certificando-se que os instrumentos são limpos, o buraco no ovo é a de tamanho mínimo exigido, que os embriões são deixados sem a protecção da fita adesiva pegajosa durante um tempo mínimo e, em conjunto com este último ponto que a operação é levada a cabo tão rapidamente quanto possível. Nenhuma dessas operações são muito demorado, mas as operações envolvendo contas e barreiras demorar um pouco mais tempo. Apesar destas medidas, as operações realizadas nos estágios iniciais e os da região de asa são mais propensos a resultar em morte. Existem grandes vasos sanguíneos em torno das regiões de formação dos membros e ruptura acidental destes navios podem levar à morte devido à perda de sangue. Nós achamos que os ovos abriu na fase 8 ou 9, cujos embriões não foram operados, muitas vezes vai morrer no dia seguinte. Portanto, a única solução para estes problemas é o de realizar um elevado número de experiências. d / 54618 / 54618fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. marcador Alterações Gene Expression seguintes barreira ou Bead Inserção na presuntivo Leg Nível. (A) posição de exibição esquemática de barreira (linha verde) no nível de perna presuntivo (somites 26-32) em um estágio de 15 embriões. (B - E e G) análise DESEJO em embriões operados. A região de perna é descrito (entre parênteses). (B) a expressão FGF10 está ausente na LPM operado, mas a expressão robusta é detectado pela raiz esquerda. (C) Fgf8 expressão está ausente no lado operado, o que sugere que não há AER. (C) O mesmo embrião antes da barreira foi removido. (D) Tbx4 é expresso na LPM ao mesmo nível rostro-caudal, como o botão de controlo. (E) Expressão Tbx4 é mantida na região da perna direita apesar da ausência de crescimento do membro. (F) Diagrama esquemático de uma fase<html> 10 embrião de galinha mostrando a posição de barreira (linha verde) ao nível da perna presuntivo. (G) expressão Tbx4 está ausente na operado direito LPM (suporte). (H) Diagrama esquemático de um embrião de galinha estágio 10 mostrando BMS 493 posição de talão (círculo roxo) no nível de perna presuntivo. (I) a expressão Tbx4 é regulada negativamente no lado direito operado após o tratamento com BMS 493. (J) Diagrama esquemático de um embrião de galinha estágio 10 mostrando o controle de posição DMSO talão (círculo cinza). (K) Tbx4 é expressa no lado direito operado a um nível semelhante ao do controle do lado esquerdo após o tratamento com DMSO por si só. Este valor foi modificado a partir de 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> d / 54618 / 54618fig3.jpg &quot;/&gt; Ausência Figura 3. RA salvamentos Membro da Bud Causada por Barreira de Inserção e é essencial na LPM Antes de Perna Bud Conseqüência. (A) Diagrama esquemático indicando posição de barreira (linha verde) ao nível da perna presuntivo (somites 26-32) e um talão de RA-embebido (círculo vermelho). (B - D) RA resgates perna bud crescimento (indicado por um asterisco). (B) a expressão Tbx4 está presente na gema perna resgatado semelhante para o lado un-operado. (C) FGF10 é expresso na perna resgatado bud semelhante ao do lado operado-un. (D) Fgf8 se expressa na AER do broto perna direita resgatados. (E) esquemático indicando onde BMS 493 pérolas (círculos roxos) foram colocados na LPM perna presuntivo de estágio 15 embriões. (F) a expressão FGF10 é regulada negativamente no lado direito operado e o broto perna é pequeno BMS 49 seguinte3 tratamento. Os grânulos são asterisco. (L) esquemática semelhante à da (E), que indica a posição de controlo grânulos DMSO (círculos a cinzento). (H) esferas de DMSO (mostrados por asteriscos) não afetou a expressão FGF10 ou tamanho da perna bud. Este valor foi modificado a partir de 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Fase barreira colocado (+ grânulo) * </td><td> número operado </td><td> Asa faltando ** </td><td> Asa presente ** </td><td> mortos número </td></tr><tr><td> Stage 12-14 </td><td> 40 </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> Stage 8/9 </td><td> 65 </td><td> 23 </td><td> 0 </td><td> 42 </td></tr><tr><td> Fase 12-13 (FGF4 grânulo) </td><td> 41 </td><td> 7 (falta talão) </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Fase 12-13 (RA grânulo) </td><td> 75 </td><td> 9 (falta talão) </td><td> 32 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> Stage 13 (talão de controle) </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="5"> * Barreiras folha de 0,7-1 mm colocados entre somites 15-20 e a mesoderme lateral. 0,35 mg / ml talão FGF4. 0,05-0,1 mg / ml do grânulo RA. </td></tr><tr><td colspan="5"> esfera de controlo DMSO. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** estágios embriões de galinha fixos 21-23 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Ala Nível Barreira e Bead Experiment Outcomes. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Fase barreira colocado (+ grânulo) * </td&gt; <td> número operado </td><td> Leg faltando ** </td><td> Leg presentes ** </td><td> mortos número </td></tr><tr><td> Stage 12-15 </td><td> 43 </td><td> 39 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Stage 10/11 </td><td> 23 </td><td> 16 </td><td> 0 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Stage 15 (talão FGF4) </td><td> 8 </td><td> 0 </td><td> 5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Stage 15 (talão RA) </td><td> 18 </td><td> 0 </td><td> 18 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * Barreiras folha de 0,7-1,3 mm colocados entre somites 26-32 e a mesoderme lateral. 0,35 mg / ml talão FGF4. 0,05-0,1 mg / ml do grânulo RA. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** estágios embriões de galinha fixos 18-24 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Perna Nível Barreira e Bead Experiment Outcomes. <table border = &quot;1&quot; fo: manter-together.within-page = &quot;1&quot; fo: manter-com-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> número operado </td><td> Leg bud pequena </td><td> Leg brotar um pouco pequeno </td><td> Leg tamanho normal de bud </td><td> mortos número </td></tr><tr><td> BMS 493 esferas * </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 </td><td> 12 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> grânulos DMSO ** </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> 0 </td><td> 3 </td><td> 9 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 2-3 grânulos embebidos em 5 mg / ml BMS 493 colocado na direita do palco 14-15 LPM a nível perna. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** 2-3 grânulos embebidos em DMSO sozinho colocado na direita do palco 15 LPM a nível perna. </td></tr><tr><td colspan="5"> embriões de galinha fixado em estágios 17-19. </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Perna Nível BMS 493 Bead Experiment Outcomes.

Protocolos que usam barreiras impermeáveis para bloquear eventos de indução entre os tecidos do eixo e flanco do corpo principal no embrião de galinha necessários para a formação do membro são descritos. Grânulos embebidos em sinais indutivos candidatos são usados para superar o efeito da colocação da barreira e a análise da expressão gênica confirma isso.

Aplicação de barreiras impermeáveis ​​combinadas com Candidate Fator Beads Soaked para estudar sinais indutores do pintainho

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

O objetivo desta intervenção cirúrgica é elucidar os mecanismos de indução de membros no embrião de galinha, impedindo que moléculas sinalizadoras difundam dos tecidos mediais para as células do mesoderma da placa lateral e estudando seu efeito na expressão gênica. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia do desenvolvimento, como, por exemplo, quais são os sinais indutivos que controlam o início da formação da brotuação do membro. A vantagem desta técnica é que o embrião de galinha é acessível à manipulação cirúrgica e muito robusto; além disso, a brotuação do membro contralateral não operada serve como um controle interno muito útil.Susan Wilde demonstrará o procedimento. Para começar, corte um pedaço quadrado de 1 cm de folha de alumínio com espessura de 0,013 mm e esterilize-o limpando com etanol a 70%. Em seguida, coloque o quadrado em uma placa de Petri plástica estéril de 6 cm.Para evitar a aderência estática, descarte a tampa e faça uma nova para o recipiente com o mesmo papel alumínio. Em seguida, coloque o recipiente sobre uma graticula de estágio sob um microscópio binocular ajustado em 1,6x de ampliação. Use um escalpelo pequeno com lâmina número 15 para cortar tiras de alumínio com 1,3 mm de largura e 2 mm de comprimento.Se pare as tiras de folha com duas pinças de relojoeiro número quatro. Em seguida, faça uma dobra em ângulo reto no centro da barreira de folha, de modo que ela se assemelhe a uma dobradiça. Alinhe as barreiras no centro da placa de Petri com um lado plano encostado na placa e o outro voltado para cima, fora da placa; prepare 20 ou mais barreiras antes do dia do procedimento.Cubra o recipiente com a tampa de folha de alumínio e armazene as barreiras em um local onde não sejam perturbadas. Com o ovo deitado de lado, segure firmemente um par de pinças fortes do tipo AA e use um movimento controlado de perfuração para furar a extremidade romba do ovo que contém o saco aéreo, segurando o ovo com a outra mão. Certifique-se de que a membrana interna da casca tenha sido rompida.Em seguida, pegue o ovo com ambas as mãos e gire-o 180 graus ao longo do seu eixo horizontal. Depois, pegue um pedaço de fita transparente, com aproximadamente 5 cm quadrados, e cole-o firmemente sobre a superfície mais superior do ovo para impedir que a casca se desintegre sobre o embrião quando o ovo for aberto. Use um par de tesouras curvas para quebrar suavemente a casca e as membranas celulares internas associadas no centro da parte superior do ovo.Faça um furo bem pequeno com uma das lâminas da tesoura para que o ar possa entrar no ovo sobre o embrião. Use a tesoura para ampliar o furo na casca até formar um círculo com diâmetro de aproximadamente 1 cm. Remova esse pedaço da casca do ovo.Cubra o orifício no ovo com um pedaço de fita transparente com aproximadamente 5 cm de lado. Pressione a fita para colá-la apenas na borda do orifício, deixando o restante da fita solto. A fita solta pode então ser segurada para abrir facilmente o ovo.Retire um embrião do estágio 15 do incubador e coloque o ovo sobre um suporte para ovos sob um microscópio binocular ajustado a uma ampliação de 3,2x ou superior. Em seguida, remova a camada superior de fita transparente. Usando uma microfaca de aço, faça uma incisão através da membrana vitelina e da mesoderme lateral adjacente aos somitos 26-32 no lado direito do embrião.Segure a barreira com a pin&ccedil;a micro n&ordm; 5 em uma extremidade e gire-a para inserir a extremidade livre na incis&atilde;o. Assim que poss&iacute;vel, feche o ovo com fita transparente e devolva-o ao incubador. Se uma esfera for inserida juntamente com uma barreira, prepare primeiro as esferas embebidas em &aacute;cido retin&oacute;ico conforme descrito no protocolo textual complementar.Em seguida, pegue a esfera e um par de pin&ccedil;as microcir&uacute;rgicas n&uacute;mero 5 e insira-a na face cortada do mesoderma do local lateral no lado distal da incis&atilde;o. Depois, insira a barreira na incis&atilde;o pr&oacute;xima &agrave; esfera. Selle o ovo e devolva-o imediatamente ao incubador.Se uma esfera ou esferas devem ser inseridas sem uma barreira, não faça a incisão longa. Em vez disso, faça uma pequena incisão através da membrana vitelina e no mesoderma da placa lateral na posição onde a esfera deve ser colocada. Em seguida, pegue a esfera e uma pinça fina número 5 e insira-a no orifício no mesoderma da placa lateral.Empurre um pouco mais para dentro com as extremidades fechadas da pinça. Retire um embrião de estágio dez com janela do incubador e coloque o ovo sobre um suporte para ovos sob um microscópio estereoscópico ajustado a uma ampliação de 3,2x ou superior, se preferido. Em seguida, utilizando uma microfaca de aço, faça uma incisão através da membrana vitelina e do mesoderma da placa lateral, lateral à estria primitiva na extremidade caudal do embrião, alinhada aos somitos, com aproximadamente seis comprimentos de somito.Em seguida, pegue a barreira com uma pinça microcirúrgica número 5, na extremidade que sobressai do recipiente de Petri, e gire a mão para inserir a extremidade livre da barreira na incisão. Assim que possível, feche o ovo com fita transparente e devolva-o ao incubador. Se uma esfera for inserida sem barreira, faça uma pequena incisão através da membrana vitelina e no mesoderma da placa lateral na posição onde a esfera deve ser colocada.Em seguida, pegue o grânulo e um par de pin&ccedil;as microcir&uacute;rgicas n&uacute;mero 5 e insira-o no orif&iacute;cio no mesoderma da placa lateral. Por fim, empurre-o um pouco mais para dentro com as extremidades fechadas das pin&ccedil;as. Aqui &eacute; mostrada a posi&ccedil;&atilde;o da barreira no n&iacute;vel presumido da perna dos somitos 26-32 em um embri&atilde;o na fase 15.Essa barreira faz com que a expressão de Fhf10 e Fhf8 esteja ausente na região do broto da perna no lado operado e presente no lado esquerdo não operado. No entanto, a expressão de Tbx4 é observada tanto no estágio 19 quanto no estágio 23 no lado operado. Isso implica que a expressão de Tbx4 sozinha não é suficiente para iniciar o crescimento do membro posterior a partir do lpm.Quando microesferas embebidas em ácido retinóico são colocadas distalmente à barreira no estágio 15, Tbx4, Fgf10 e Fgf8 são todos expressos no lado operado, assim como no lado controle esquerdo. Portanto, no desenvolvimento normal, o ácido retinóico proveniente dos somitos é essencial antes que o brotamento da extremidade possa ser iniciado. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar barreiras impermeáveis e microesferas embebidas em fatores candidatos para estudar como os sinais indutivos regulam o início do brotamento da extremidade no embrião de galinha.

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Research

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