Aplicação de barreiras impermeáveis ​​combinadas com Candidate Fator Beads Soaked para estudar sinais indutores do pintainho

O objetivo desta intervenção cirúrgica é elucidar os mecanismos de indução de membros no embrião de galinha, impedindo que moléculas sinalizadoras difundam dos tecidos mediais para as células do mesoderma da placa lateral e estudando seu efeito na expressão gênica. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia do desenvolvimento, como, por exemplo, quais são os sinais indutivos que controlam o início da formação da brotuação do membro. A vantagem desta técnica é que o embrião de galinha é acessível à manipulação cirúrgica e muito robusto; além disso, a brotuação do membro contralateral não operada serve como um controle interno muito útil.

Susan Wilde demonstrará o procedimento. Para começar, corte um pedaço quadrado de 1 cm de folha de alumínio com espessura de 0,013 mm e esterilize-o limpando com etanol a 70%. Em seguida, coloque o quadrado em uma placa de Petri plástica estéril de 6 cm.

Para evitar a aderência estática, descarte a tampa e faça uma nova para o recipiente com o mesmo papel alumínio. Em seguida, coloque o recipiente sobre uma graticula de estágio sob um microscópio binocular ajustado em 1,6x de ampliação. Use um escalpelo pequeno com lâmina número 15 para cortar tiras de alumínio com 1,3 mm de largura e 2 mm de comprimento.

Se pare as tiras de folha com duas pinças de relojoeiro número quatro. Em seguida, faça uma dobra em ângulo reto no centro da barreira de folha, de modo que ela se assemelhe a uma dobradiça. Alinhe as barreiras no centro da placa de Petri com um lado plano encostado na placa e o outro voltado para cima, fora da placa; prepare 20 ou mais barreiras antes do dia do procedimento.

Cubra o recipiente com a tampa de folha de alumínio e armazene as barreiras em um local onde não sejam perturbadas. Com o ovo deitado de lado, segure firmemente um par de pinças fortes do tipo AA e use um movimento controlado de perfuração para furar a extremidade romba do ovo que contém o saco aéreo, segurando o ovo com a outra mão. Certifique-se de que a membrana interna da casca tenha sido rompida.

Em seguida, pegue o ovo com ambas as mãos e gire-o 180 graus ao longo do seu eixo horizontal. Depois, pegue um pedaço de fita transparente, com aproximadamente 5 cm quadrados, e cole-o firmemente sobre a superfície mais superior do ovo para impedir que a casca se desintegre sobre o embrião quando o ovo for aberto. Use um par de tesouras curvas para quebrar suavemente a casca e as membranas celulares internas associadas no centro da parte superior do ovo.

Faça um furo bem pequeno com uma das lâminas da tesoura para que o ar possa entrar no ovo sobre o embrião. Use a tesoura para ampliar o furo na casca até formar um círculo com diâmetro de aproximadamente 1 cm. Remova esse pedaço da casca do ovo.

Cubra o orifício no ovo com um pedaço de fita transparente com aproximadamente 5 cm de lado. Pressione a fita para colá-la apenas na borda do orifício, deixando o restante da fita solto. A fita solta pode então ser segurada para abrir facilmente o ovo.

Retire um embrião do estágio 15 do incubador e coloque o ovo sobre um suporte para ovos sob um microscópio binocular ajustado a uma ampliação de 3,2x ou superior. Em seguida, remova a camada superior de fita transparente. Usando uma microfaca de aço, faça uma incisão através da membrana vitelina e da mesoderme lateral adjacente aos somitos 26-32 no lado direito do embrião.

Segure a barreira com a pinça micro nº 5 em uma extremidade e gire-a para inserir a extremidade livre na incisão. Assim que possível, feche o ovo com fita transparente e devolva-o ao incubador. Se uma esfera for inserida juntamente com uma barreira, prepare primeiro as esferas embebidas em ácido retinóico conforme descrito no protocolo textual complementar.

Em seguida, pegue a esfera e um par de pinças microcirúrgicas número 5 e insira-a na face cortada do mesoderma do local lateral no lado distal da incisão. Depois, insira a barreira na incisão próxima à esfera. Selle o ovo e devolva-o imediatamente ao incubador.

Se uma esfera ou esferas devem ser inseridas sem uma barreira, não faça a incisão longa. Em vez disso, faça uma pequena incisão através da membrana vitelina e no mesoderma da placa lateral na posição onde a esfera deve ser colocada. Em seguida, pegue a esfera e uma pinça fina número 5 e insira-a no orifício no mesoderma da placa lateral.

Empurre um pouco mais para dentro com as extremidades fechadas da pinça. Retire um embrião de estágio dez com janela do incubador e coloque o ovo sobre um suporte para ovos sob um microscópio estereoscópico ajustado a uma ampliação de 3,2x ou superior, se preferido. Em seguida, utilizando uma microfaca de aço, faça uma incisão através da membrana vitelina e do mesoderma da placa lateral, lateral à estria primitiva na extremidade caudal do embrião, alinhada aos somitos, com aproximadamente seis comprimentos de somito.

Em seguida, pegue a barreira com uma pinça microcirúrgica número 5, na extremidade que sobressai do recipiente de Petri, e gire a mão para inserir a extremidade livre da barreira na incisão. Assim que possível, feche o ovo com fita transparente e devolva-o ao incubador. Se uma esfera for inserida sem barreira, faça uma pequena incisão através da membrana vitelina e no mesoderma da placa lateral na posição onde a esfera deve ser colocada.

Em seguida, pegue o grânulo e um par de pinças microcirúrgicas número 5 e insira-o no orifício no mesoderma da placa lateral. Por fim, empurre-o um pouco mais para dentro com as extremidades fechadas das pinças. Aqui é mostrada a posição da barreira no nível presumido da perna dos somitos 26-32 em um embrião na fase 15.

Essa barreira faz com que a expressão de Fhf10 e Fhf8 esteja ausente na região do broto da perna no lado operado e presente no lado esquerdo não operado. No entanto, a expressão de Tbx4 é observada tanto no estágio 19 quanto no estágio 23 no lado operado. Isso implica que a expressão de Tbx4 sozinha não é suficiente para iniciar o crescimento do membro posterior a partir do lpm.

Quando microesferas embebidas em ácido retinóico são colocadas distalmente à barreira no estágio 15, Tbx4, Fgf10 e Fgf8 são todos expressos no lado operado, assim como no lado controle esquerdo. Portanto, no desenvolvimento normal, o ácido retinóico proveniente dos somitos é essencial antes que o brotamento da extremidade possa ser iniciado. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar barreiras impermeáveis e microesferas embebidas em fatores candidatos para estudar como os sinais indutivos regulam o início do brotamento da extremidade no embrião de galinha.