Aplicação de barreiras impermeáveis ​​combinadas com Candidate Fator Beads Soaked para estudar sinais indutores do pintainho

O objetivo desta intervenção cirúrgica é elucidar os mecanismos de indução do membro no embrião de galinha, impedindo que as moléculas de sinalização se difundam dos tecidos mediais para as células do mesoderma da placa lateral e estudando seu efeito na expressão gênica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia do desenvolvimento, como quais são os sinais indutivos para controlar a iniciação dos brotos dos membros. A vantagem desta técnica é que o embrião de galinha é acessível à manipulação cirúrgica e muito robusto, além disso, o broto do membro de controle contralateral não operado serve como um controle interno muito útil.

Susan Wilde demonstrará o procedimento. Para começar, corte um pedaço quadrado de 1 cm de papel alumínio de 0,013 mm de espessura e esterilize-o limpando-o com etanol 70%. Em seguida, coloque o quadrado em uma placa de Petri de plástico estéril de 6 cm.

Para evitar a aderência estática, descarte a tampa e faça uma nova para o prato com o mesmo papel alumínio. Em seguida, coloque a placa de Petri em cima de uma retícula de platina sob um microscópio binocular com ampliação de 1,6x. Use um bisturi pequeno de lâmina número 15 para cortar tiras de 1,3 mm de largura da folha com 2 mm de comprimento.

Separe as tiras de alumínio usando dois pares de pinças de relojoeiro número quatro. Em seguida, faça uma curva em ângulo reto no centro da barreira de alumínio, de modo que se assemelhe a uma dobradiça. Alinhe as barreiras no centro da placa de Petri com um lado plano contra o prato e o outro apontando para fora do prato, prepare 20 ou mais barreiras antes do dia da operação.

Coloque a tampa de alumínio sobre o prato e guarde as barreiras em um local onde não sejam perturbadas. Com o ovo deitado de lado, segure um par de pinças fortes do tipo AA com firmeza e use um movimento controlado de esfaqueamento para perfurar a extremidade cega do ovo contendo o saco de ar enquanto segura o ovo com a mão livre. Certifique-se de que a membrana interna da casca foi quebrada.

Em seguida, pegue o ovo com as duas mãos e gire-o 180 graus ao longo de seu eixo horizontal. Em seguida, pegue um pedaço de fita adesiva transparente, de aproximadamente 5 cm quadrados, e cole-o bem perto da superfície superior do ovo para impedir que a casca do ovo se desintegre no embrião quando o ovo for aberto. Use uma tesoura curva para romper suavemente a casca e suas membranas celulares internas associadas no centro da parte superior do ovo.

Faça um orifício bem pequeno com uma lâmina da tesoura para que o ar possa entrar no ovo sobre o embrião. Use a tesoura para ampliar o orifício na concha para um círculo com um diâmetro de aproximadamente 1 cm. Remova este pedaço de casca do tamanho de um ovo do ovo.

Cubra o orifício do ovo com um pedaço de fita adesiva transparente de aproximadamente 5 cm quadrados. Pressione a fita para colá-la apenas na borda do orifício, deixando a fita restante livre. A fita livre pode então ser agarrada para abrir facilmente o ovo.

Pegue um embrião do estágio 15 da incubadora e coloque o ovo em um descanso de ovo sob um microscópio binocular com uma ampliação de 3,2x ou superior. Em seguida, remova a camada superior de fita transparente. Usando uma microfaca de aço, faça uma incisão através da membrana vitelina e coloque lateralmente o mesoderma adjacente aos somitos 26-32 no lado direito do embrião.

Pegue a barreira com uma micropinça número 5 em uma extremidade e gire a barreira para inserir a extremidade livre na incisão. Assim que possível, feche o ovo com fita adesiva transparente e devolva-o à incubadora. Se um cordão for inserido em conjunto com uma barreira, em primeiro lugar, prepare grânulos embebidos em ácido retinóico conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.

Em seguida, pegue o cordão e um par de micropinças número 5 e insira-o na face cortada do mesoderma lateral no lado distal da incisão. Em seguida, insira a barreira na incisão proximal ao cordão. Feche o ovo e devolva-o imediatamente à incubadora.

Se uma conta ou contas forem inseridas sem barreira, não faça a incisão longa. Em vez disso, faça uma pequena incisão através da membrana vitelina e no mesoderma da placa lateral na posição em que o cordão deve ser colocado. Em seguida, pegue o cordão e a micropinça número 5 e insira-a no orifício do mesoderma da placa lateral.

Empurre-o um pouco mais com as extremidades fechadas da pinça. Pegue um embrião de estágio dez com janela da incubadora e coloque o ovo em um descanso de ovo sob microscópio binocular ajustado para ampliação de 3,2x ou superior, se preferir. Em seguida, usando uma microfaca de aço, faça uma incisão através da membrana vitelina e da placa lateral do mesoderma, lateral à faixa primitiva na extremidade caudal do embrião alinhada com os somitos, com aproximadamente seis comprimentos de somito.

Em seguida, pegue a barreira com um par de micropinças número 5, na extremidade saliente da placa de Petri e gire a mão para inserir a extremidade livre da barreira na incisão. Assim que possível, feche o ovo com fita adesiva transparente e devolva-o à incubadora. Se um cordão for inserido sem barreira, faça uma pequena incisão através da membrana vitelina e no mesoderma da placa lateral na posição em que o cordão deve ser colocado.

Em seguida, pegue o cordão e um par de micropinças número 5 e insira-o no orifício no mesoderma da placa lateral. Por fim, empurre-o um pouco mais com as extremidades fechadas da pinça. Aqui é mostrada a posição de barreira no nível presuntivo da perna dos somitos 26-32 em um embrião de estágio 15.

Essa barreira faz com que a expressão de Fhf10 e Fhf8 esteja ausente na região do broto da perna no lado operado e presente no lado esquerdo não operado. No entanto, a expressão de Tbx4 é observada no estágio 19 e no estágio 23 no lado operado. Isso implica que a expressão de Tbx4 por si só não é suficiente para iniciar o crescimento dos membros posteriores a partir do lpm.

Quando os grânulos embebidos em ácido retinóico são colocados distalmente à barreira no estágio 15, Tbx4, Fgf10 e Fgf8 são todos expressos no lado operado e no lado esquerdo do controle. Assim, no desenvolvimento normal, o ácido retinóico dos somitos é essencial antes que o crescimento dos brotos dos membros possa ser iniciado. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar barreiras impermeáveis e grânulos fatoriados embebidos em candidatos para estudar como os sinais indutivos regulam a iniciação do botão do membro no embrião de pintinho.