Um Modelo aguda da retina para a Avaliação sanguíneos da retina barreira Descumprimento e potenciais fármacos para o tratamento

Um baixo custo, o sistema easy-to-use e poderoso é estabelecida para avaliar potenciais tratamentos que possam amenizar violação sangue barreira retina induzida pela histamina. vazamento dos vasos sanguíneos, a ativação de células Müller e a continuidade dos processos neuronais são utilizados para avaliar a resposta a danos e sua reversão com uma droga potencial, lipoxina A4.

O objetivo geral deste sistema modelo de retina ex vivo é rastrear drogas que melhorem a violação da barreira neural do sangue. Este método pode responder a várias questões-chave no campo das doenças degenerativas neurais, como quais são os eventos iniciais e como podemos rastrear medicamentos que possam ajudar a tratar esses pacientes. A principal vantagem dessa técnica é que ela é de baixo custo, fácil de usar, rápida e adaptável.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a obtenção de dados confiáveis e reprodutíveis depende das habilidades técnicas para gerar boas amostras. As primeiras retinas suínas, obtidas de uma fonte comercial, são usadas aqui. Após a obtenção da fonte, os globos oculares devem ser mantidos a quatro graus, ou no gelo, e processados o mais rápido possível.

Comece a dissecção em um capuz de cultura de tecidos cortando ao redor da lente para abrir a tampa do olho. Em seguida, usando um pincel, remova suavemente o humor vítreo, sem puxar a retina. Use uma escova para separar suavemente a retina da borda cortada, para expor o disco óptico.

Corte o nervo óptico com uma navalha e solte a retina. Transfira a retina para uma placa de Petri e enxágue cuidadosamente a retina uma vez usando HBSS frio. Coloque a amostra em HBSS no gelo.

Em seguida, use uma navalha para cortar a retina ao meio simetricamente. Quando os tratamentos são necessários, metade da retina é tratada, enquanto a outra metade da mesma retina deve ser processada para definir a linha de base e corrigir as variações dos animais. Transfira suavemente as amostras para uma placa de seis poços contendo três mililitros de meio de estabilização por poço.

Equilibre as retinas por 30 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora com a atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, aspire cuidadosamente o meio de estabilização e adicione três mililitros de meio contendo histamina e LXA4 a cada poço. Incube as amostras por mais uma hora.

Após enxaguar com PBS estéril quente, adicione três mililitros de 4% de PFA a cada poço e incube por 15 minutos em temperatura ambiente. Decorrido o tempo de incubação, aspire rapidamente o PFA e enxágue as amostras uma vez com PBS. Adicione 10% de sacarose aos poços e incube por duas a quatro horas a quatro graus Celsius.

Em seguida, substitua a sacarose a 10% por 30% de sacarose e incube durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, misture uma parte de meio de congelamento comercial com duas partes de 20% de sacarose, para fazer um meio de congelamento de trabalho. Deixe a quatro graus Celsius durante a noite ou mais até que as bolhas de ar desapareçam.

No dia seguinte, substitua a sacarose a 30% por meio de congelamento de trabalho e deixe equilibrar por cinco minutos em temperatura ambiente. Após o equilíbrio, corte cada retina em retângulos de três milímetros por cinco milímetros e, em seguida, congele as fatias da retina colocando-as em meio de congelamento, contido em um cilindro de folha de alumínio. Certifique-se de que as fatias da retina estejam na vertical para fornecer uma seção transversal da retina após a seccionamento e congele-as em nitrogênio líquido.

Divida cada bloco em um criostato em fatias de 14 mícrons e monte as seções em lâminas de vidro. Armazene as lâminas a 80 graus Celsius negativos até o uso. Comece a imunocoloração lavando as seções com tampão fosfato de sacarose a 5%, ou SPB.

Em seguida, bloqueie os locais de ligação não específicos, incubando as seções e bloqueando o buffer por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, incube as seções com o anticorpo primário apropriado por uma hora. Decorrido o tempo de uma hora, aspirar a solução e lavar as secções três vezes em SPB a 5%.

Em seguida, incube as seções com os anticorpos secundários correspondentes por uma hora, enquanto protegidas da luz. Depois de lavar as seções três vezes com 5%SPB, prepare as amostras para microscopia montando-as em meio contendo DAPI e cobrindo com lamínulas. Por fim, capture imagens usando um microscópio confocal.

Para medir a largura do processo, use a ferramenta de lupa para escolher uma área da seção onde os processos estão sendo gestados, como a camada nuclear externa. Em seguida, escolha um campo óptico onde esses processos sejam visíveis e contínuos. Clique na ferramenta de análise no menu principal e, em seguida, clique em definir escala no submenu para definir a barra de escala de acordo com a configuração microscópica.

Selecione a função de linha no menu principal e desenhe uma linha ao longo do processo. Clique em analisar no menu principal e, em seguida, clique em medir no submenu para executar a medição. Para analisar a continuidade do processo, retorne ao menu principal e use a função polígono para selecionar a camada plexiforme interna como a região de interesse.

Meça a área clicando em analisar e depois em medir. Clique em processar, filtrar e, em seguida, em variantes, para aprimorar as bordas da imagem, substituindo cada pixel por sua variante de vizinhança. Em seguida, ajuste automaticamente o contraste e o brilho clicando em imagem, ajuste, brilho e contraste e, em seguida, auto no submenu.

Em seguida, conte as linhas. Nessas imagens, a imunorreatividade do IGG é vista em vermelho. Nos grupos controle, o IGG é restrito dentro dos vasos sanguíneos.

No grupo da histamina, o IGG é detectado fora dos vasos sanguíneos, onde forma nuvens de vazamento indicadas por círculos pontilhados. Nos grupos tratados com LXA4, o IGG é novamente restrito dentro dos vasos sanguíneos. A adição adicional de LXA4 resgata a função dos vasos induzida pela histamina.

Este histograma mostra a porcentagem de vasos sanguíneos com vazamento nos grupos testados. Nessas imagens, é apresentada imunomarcação para GFAP, que cora as células de Muller. A coloração positiva é obtida nos processos das células de Muller, através da retina e ao redor dos vasos sanguíneos.

A largura dos processos celulares de Muller, de todos os grupos, é apresentada. O tratamento com histamina, ou LXA4 isoladamente, reduziu a largura do processo. Mas quando os dois reagentes foram aplicados juntos, a largura do processo foi resgatada.

Nessas imagens, a imunomarcação para MAP2 é apresentada. Observa-se coloração positiva dos processos e corpos celulares das células ganglionares. A densidade de processos contínuos de células ganglionares positivas para MAP2 de todos os grupos é apresentada.

O tratamento com histamina diminui a continuidade dos processos dendríticos, enquanto o LXA4 não tem efeitos significativos. Uma vez dominado, esse experimento pode ser feito em três a cinco dias, se realizado corretamente, com cinco minutos por retina para dissecção, seis minutos para tratamento, seguido de secção, imunocoloração e análise. Ao tentar este procedimento, é importante usar tecido fresco e controles adequados.

Após este procedimento, outros métodos, como imagens ao vivo, podem ser adicionados, para rastrear mudanças em tempo real nos níveis de cálcio e propriedades mitocondriais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar esse modelo de cultura de retina aguda ex vivo, para criar uma disfunção BRB, avaliar o dano e rastrear possíveis medicamentos. Muito obrigado por assistir e tudo de bom com seus experimentos.