Um ensaio baseado em CFSE para estudar a migração de Murino pele as células dendríticas em drenagem gânglios linfáticos durante a infecção com Mycobacterium bovis Bacilo de Calmette-Guérin

O objetivo geral deste ensaio baseado em rastreador de células fluorescentes é monitorar e caracterizar populações de células específicas de interesse à medida que migram da pele para o linfonodo de drenagem após a infecção da almofada do pé com Bacille Calmette-Guerin, ou BCG. Usamos essa técnica para identificar a população de células dendríticas que abriga o linfonodo drenante após a infecção por BCG da pele. Essa técnica permitiu estudar a migração celular injetando os tumores durante uma janela definida de 24 horas.

A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de injeção da almofada do pé e isolamento dos linfonodos são difíceis de aprender a partir do texto. Para injeção de microbactéria Bovus BCG, após confirmar o nível apropriado de sedação por pinça do dedo do pé, use uma seringa equipada com uma agulha de calibre 29 de 1/2 polegada para inocular a almofada do pé traseiro de um camundongo de oito a 12 semanas de idade com uma vez dez elevado à sexta unidade formadora de colônias da bactéria em 30 microlitros de PBS. Injete as almofadas de controle dos pés apenas com PBS.

Em seguida, monitore os animais até que estejam totalmente deitados e capazes de colocar peso na almofada do pé injetada. Para injeção de CFSE, no momento apropriado após a injeção de BCG, dilua um frasco de CFSE em temperatura ambiente, cinco milimolares CFSE dez vezes em PBS, tendo o cuidado de ressuspender completamente a solução. Em seguida, carregue a seringa com o CFSE diluído e administre 20 microlitros na mesma almofada do pé traseiro que recebeu a primeira injeção.

24 horas após a injeção de CFSE, faça cuidadosamente uma incisão vertical na coxa traseira e limpe a gordura muscular. Em seguida, use uma tesoura e uma pinça para expor e extirpar o linfonodo poplíteo, localizado no fundo da bolsa de gordura na cavidade do joelho. Transfira o linfonodo para 0,5 mililitros de PBS estéril no gelo e homogeneize o linfonodo através de um filtro de células de 70 mícrons dentro de um poço de uma placa de seis poços contendo cinco mililitros de PBS com a extremidade traseira de uma seringa de três mililitros.

Lave o filtro com mais 5 mililitros de tampão e transfira a solução celular para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, centrifugue as células e ressuspenda o pellet em um volume suficiente de tampão. Para rotular as células para citometria de fluxo, vou Liaquat de uma a dez vezes dez elevado à sexta células em tubos de poliestireno de fundo redondo de cinco mililitros e lavo as células em tampão FACS fresco.

Ressuspenda os pellets em 50 a 100 microlitros do coquetel de anticorpos apropriado contendo CD16 CD32 anti-camundongo para bloquear interações mediadas por FC inespecíficas no tampão FACS no gelo, protegido da luz. Após 30 a 45 minutos, lave as células em tampão FACS e ressuspenda os pellets em 50 a 100 microlitros de tampão FACS fresco. A maior parte da marcação do CFSE no linfonodo poplíteo é observada em células baixas MHC-II e CD11c positivas, consistentes com células dendríticas da pele que migram para linfonodos de drenagem da pele.

Tanto a frequência quanto o número total dessas células marcadas aparecem em números aumentados nos linfonodos poplíteos de camundongos infectados com BCG, em comparação com os controles injetados com PBS, sugerindo que o BCG aumenta a realocação dessas células para o linfonodo de drenagem. As células dendríticas da pele continuam a entrar na linfa de drenagem até cinco dias após a infecção, estendendo a migração de células dendríticas no modelo atual muito além da linha do tempo para a ativação inicial de células T CD4 positivas específicas do antígeno no linfonodo poplíteo. Além disso, as células dendríticas migratórias da pele expressam níveis elevados de moléculas co-estimulatórias, apoiando o conceito de que essas células dendríticas migratórias são ativadas.

É importante ressaltar que tanto as células dendríticas monocitoides resistentes a linfonodos quanto as células dendríticas plasmáticas-citóides, que entram nos linfonodos inflamados através de vênulas endoteliais altas, e não linfáticas aferentes, são negativas para CFSE, verificando ainda mais que a marcação CFSE ocorre principalmente na almofada do pé. Além disso, a análise citometria de fluxo adicional revela que uma subpopulação de células altas de EpCAM com baixo CD11b é o principal subconjunto de células dendríticas migratórias da pele que drena para o linfonodo poplíteo em resposta à infecção por BCG. Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em cinco minutos se for feita corretamente.

Ao tentar esse processo, é importante ter cuidado com o local da injeção e o volume da injeção; Muito cuidado deve ser tomado para não danificar o linfonodo de drenagem durante a dissecção. Após o procedimento, outros métodos, como citometria de fluxo ou microscopia confocal, podem ser realizados para análise adicional da microexpressão celular específica do subconjunto. Essa técnica abriu caminho para os pesquisadores rastrearem células da pele até o linfonodo de drenagem, dentro de um período de 24 horas em resposta à infecção ou vacinação.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar injeções de almofada no pé e localizar e isolar os gânglios linfáticos de drenagem para rastreamento e caracterização de populações de células dendríticas migratórias de interesse.