Um ensaio baseado em CFSE para estudar a migração de Murino pele as células dendríticas em drenagem gânglios linfáticos durante a infecção com

O objetivo geral deste ensaio baseado em rastreamento celular fluorescente é monitorar e caracterizar populações celulares específicas de interesse enquanto migram da pele para o linfonodo drenante após infecção no coxim plantar com Bacillus Calmette-Guérin, ou BCG. Utilizamos esta técnica para identificar a população de células dendríticas que migra para o linfonodo drenante após infecção cutânea com BCG. Esta técnica permitiu estudar a migração celular mediante injeção nos tumores durante uma janela definida de 24 horas.

A demonstração visual deste método é essencial, pois os passos de injeção na pata e isolamento do linfonodo são difíceis de aprender apenas com texto. Para a injeção de microbactéria Bovis BCG, após confirmar o nível apropriado de sedação por meio de pinçamento do dedo do pé, utilize uma seringa com uma agulha de 29 graus e 1/2 polegada para inocular a pata traseira de um camundongo de oito a 12 semanas de idade com um vezes dez à sexta unidade formadora de colônia da bactéria em 30 microlitros de PBS. Inocule as patas controle apenas com PBS.

Em seguida, monitore os animais até que estejam completamente recumbentes e capazes de apoiar peso sobre a pata injetada. Para a injeção de CFSE, no ponto temporal apropriado após a injeção de BCG, dilua um frasco de CFSE a cinco milimolares em temperatura ambiente em PBS em uma proporção de 1:10, tomando cuidado para ressuspender completamente a solução. Em seguida, carregue a seringa com o CFSE diluído e administre 20 microlitros na mesma pata traseira que recebeu a primeira injeção.

24 horas após a injeção de CFSE, faça cuidadosamente uma incisão vertical na coxa traseira e remova a gordura muscular. Em seguida, use tesoura e pinça para expor e excisar o linfonodo poplíteo, localizado profundamente dentro da bolsa de gordura na cavidade do joelho. Transfira o linfonodo para 0,5 mililitros de PBS estéril sobre gelo e homogeneíze o linfonodo através de uma peneira celular de 70 mícrons dentro de um poço de uma placa de seis poços contendo cinco mililitros de PBS, usando a extremidade traseira de uma seringa de três mililitros.

Lave o filtro com mais 5 mililitros de tampão e transfira a solução celular para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, centrifugue as células e ressuspenda o pellet em um volume suficiente de tampão. Para marcar as células para citometria de fluxo, distribua de um a dez vezes dez à sexta potência células em tubos de poliestireno redondos de 5 mililitros e lave as células com tampão FACS fresco.

Re-suspenda os pellets em 50 a 100 microlitros do coquetel de anticorpos apropriado contendo anti-CD16 CD32 de camundongo para bloquear interações inespecíficas mediadas por FC no tampão FACS em gelo, protegido da luz. Após 30 a 45 minutos, lave as células com tampão FACS e re-suspenda os pellets em 50 a 100 microlitros de tampão FACS fresco. A maioria da marcação com CFSE no linfonodo poplíteo é observada em células MHC-II alta e CD11c positivas baixas, compatível com células dendríticas da pele que migram para linfonodos drenantes da pele.

Tanto a frequência quanto o número total dessas células marcadas parecem aumentados nos linfonodos poplíteos de camundongos infectados com BCG, em comparação com os controles injetados com PBS, sugerindo que o BCG potencializa o realocamento dessas células para o linfonodo drenante. As células dendríticas da pele continuam a ingressar no linfonodo drenante até cinco dias após a infecção, estendendo a migração das células dendríticas no modelo atual muito além da linha do tempo para a ativação inicial de linfócitos T CD4 positivos específicos para antígeno no linfonodo poplíteo. Além disso, as células dendríticas migratórias da pele expressam níveis elevados de moléculas coestimuladoras, reforçando a ideia de que essas células dendríticas migratórias estão ativadas.

É importante destacar que tanto as células dendríticas monocitoides quanto as plasmacitoides resistentes dos linfonodos, que entram nos linfonodos inflamados através dos vênulos endoteliais altos e não pelas linfáticas aferentes, são negativas para CFSE, o que confirma ainda mais que a marcação com CFSE ocorre principalmente na pata. Além disso, análises adicionais por citometria de fluxo revelam que uma subpopulação de células EpCAM baixo CD11b alto representa o principal subconjunto de células dendríticas da pele migratórias que drenam para o linfonodo poplíteo em resposta à infecção por BCG. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cinco minutos, se for feita corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante ter cuidado com o local e o volume de injeção; deve-se tomar muito cuidado para não danificar o linfonodo drenante durante a dissecção. Após o procedimento, outros métodos, como citometria de fluxo ou microscopia confocal, podem ser realizados para análise adicional da microexpressão celular específica de subpopulações. Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores rastreassem células da pele até o linfonodo drenante, dentro de um período de 24 horas, em resposta a infecção ou vacinação.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar injeções em almofadas plantares e localizar e isolar os linfonodos drenantes para rastrear e caracterizar populações de células dendríticas migratórias de interesse.