Name: genotipagem de Staphylococcus aureus por Ribossômico Spacer PCR (RS-PCR) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprenda a genotipagem de Staphylococcus aureus por RS-PCR com eletroforese miniaturizada para estudo de mastite bovina. Este método rápido e de alto rendimento auxilia pesquisadores na análise de transmissão.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

O autor agradece a R. Boss, A. Cosandey, C. Fournier, I. Ivanovic e J. Naskova por seu excelente trabalho.

1. Staphylococcus aureus <ol><li> Espalhe 10 ul de S. aureus cultura de reserva ou uma colónia crescida em meio selectivo em placas de agar de Columbia contendo 5% de sangue de carneiro (BA). </li><li> Incubar aerobicamente a 37 ° C durante 18 h a 24 h. </li></ol> 2. Extração de DNA <ol><li> Preparar tampão TEL contendo Tris-HCl 10 mM e 10 mM de Na 2 EDTA, pH 8,5. Preparar alíquotas e autoclave a 121 ° C durante 15 min. </li><li> Recolha 1 colónia da BA usando uma ansa estéril de plástico ou um palito de madeira estéril e ressuspender em 100 mL TEL. Use tubos de 1,5 ml com tampas de rosca. </li><li> Incubar a 95 ° C durante 10 min. Em seguida, coloque as amostras imediatamente em gelo molhado. </li><li> Dilui-se as amostras 1: 100 em H2O adequado para PCR (= ADN molde para PCR). As amostras não diluídas e diluídas podem ser mantidos à temperatura de -20 ° C durante 1 mês. </li></ol> 3. RS-PCR <ol><li&gt; para cada pipeta de amostra para um tubo de PCR de 1,5 ul de H2O, 12,5 uL de Taq Master Mix, 2 ul de iniciador G1 10? M, 2 ul de L1 iniciador 10 uM, e 7 ul de molde de ADN que corresponde a cerca de 30 ng de puro DNA 2. </li><li> Executar o seguinte programa de ciclos num ciclizador PCR padrão: 15 min 95 ° C, seguido por 27 ciclos que compreendem 94 ° C durante 1 min, seguido de uma rampa de 2 minutos e hibridação a 55 ° C durante 7 min. Após mais 2 min rampa, estender a 72 ° C durante 2 min. Terminar PCR por uma extensão final a 72 ° C durante 10 minutos, seguido por arrefecimento a 4 ° C. NOTA: Os produtos de PCR podem ser armazenadas a -20 ° C durante 5 dias. </li><li> Para cada passagem de RS-PCR incluem um controlo positivo, ou seja, uma amostra com um genótipo conhecido (normalmente GTB), e um controlo negativo (H2O). </li></ol> 4. Eletroforese <ol><li> Use um kit de eletroforese miniaturizado comercial para DNA (kit MED) em conjuntocom um Bioanalyzer conectado a um PC eo software instalado. Estudar os manuais correspondentes do fabricante com cuidado. </li><li> Configurar a estação de priming de chips e ajustar o clipe de seringa de acordo com o manual do fabricante. </li><li> Preparar a mistura de gel de corante-de acordo com o manual do fabricante. </li><li> Carregando o mix gel-dye (de acordo com o manual do fabricante). <ol><li> Equilibrar a mistura de gel de corante-à TA durante 30 min antes da utilização. </li><li> Coloque novo chip de ADN na estação de chip de priming. Pipeta 9 jul de gel-dye na G. bem marcado </li><li> Certifique-se de que o êmbolo está posicionado em 1 ml e depois fechar a estação de chip de priming. Pressione o êmbolo até que seja preso pelo clipe seringa. Espere exatamente durante 30 segundos, em seguida, solte o clipe seringa. </li><li> Espere por 5 seg. Puxe lentamente o êmbolo para 1 ml posição. </li><li> Abrir chip de estação de priming e pipeta 9 jul de gel-dye em ambos os poços marcados &#39;G&#39;. </li></ol></li><li> Carregando o Marker <ol><li> Pipetar 5 ul de marcador em todos os 12 poços de amostra e na escada bem. Não deixe qualquer um destes 13 poços vazios. </li></ol></li><li> Carregando a escada e as amostras. <ol><li> Pipeta de 1 ml de escada de DNA para o bem-marcados com o sinal escada. </li><li> Pipetar 1 mL da amostra (poços utilizados) ou 1 ul de água desionizada (poços) não utilizados. </li><li> Colocar o chip horizontalmente no adaptador e vortex durante 1 min a 2400 rpm. </li><li> Executar o chip no Bioanalyzer dentro de 5 min. </li></ol></li><li> Execução da análise <ol><li> Comece o Bioanalyzer eo computador conectado. Abra o software. </li><li> Abra a tampa do Bioanalyzer e colocar o chip no suporte do chip (o chip se encaixa apenas um caminho). Feche a tampa com cuidado. </li><li> No contexto Instrumento do software selecione &quot;Eletroforese&quot;&gt; &quot;dsDNA&quot;&gt; &quot;DNA 7500&quot;. Aceitar o prefixo do arquivo atual do software ou modificá-lo.</li><li> Clique no botão Iniciar presente no software. Digite os nomes de amostra no software. Quando o chip de execução é concluída (após cerca de 30 min) o Fim do Run mensagem aparece no software Bioanalyzer. </li><li> Remover o chip e limpar os eléctrodos do Bioanalyzer de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol></li></ol> 5. inferir o genótipo do perfil Eletroforese <ol><li> Carregue o software Mahal (software está disponível gratuitamente a partir dos autores). </li><li> dados de referência importação para o software Mahal: &quot;Arquivo&quot;&gt; ​​&quot;Importar Dados de Referência&quot; </li><li> Abra o eletroforese executado no contexto de dados do software Bioanalyzer. Selecione um perfil de electroforese de uma amostra. </li><li> Verifique se os picos relevantes. <ol><li> Use o software Mahal para verificar se os picos relevantes: &quot;Ferramentas&quot;&gt; &quot;Média de Fluorescência&quot;. Insira na caixa &quot;fluorescência&quot;os valores de fluorescência indicado como unidades de fluorescência (UF), tal como eles podem ser lidos a partir do software Bioanalyzer. Insira as (3) picos 4 com a maior fluorescência em ordem crescente e separados por vírgulas. Exemplo: 126.130.132.137. NOTA: Se nem todos estes picos FU são indicados pelo software Bioanalyzer, eles precisam ser estimada por lê-los para fora da trama. </li></ol></li><li> Pressione o botão &quot;Calcular&quot;. Um pico é relevante se a fluorescência observado exceder o valor dado na caixa &quot;Minimal altura de pico&quot;. </li><li> Inferir o genótipo. <ol><li> Inserir na caixa de texto Mahal &quot;Picos de entrada (pb)&quot; os tamanhos em bp de todos os picos relevantes em ordem crescente e separados por vírgulas. Exemplo: 440.462.519.579.637. NOTA: Se nem todos esses tamanhos de pico são indicados pelo software Bioanalyzer, eles precisam ser estimada por lê-los para fora da trama. </li></ol></li><li> Pressione o botão &quot;Calcular&quot;. </li><li> Na listacaixa de, procure o mínimo quadrado distância de Mahalanobis &quot;D2M&quot;. Se o valor P correspondente direito a ela é ≥0.05 então a probabilidade é ≥5% que a hipótese nula H 0 é rejeitada (H 0: o observado e os contornos de referência são idênticos) o que significa que o perfil observado é aceito para ser idêntico ao o perfil de referência do genótipo indicada. </li><li> Se D2M é mínima, mas o campo do valor de P correspondente está vazia, rejeitar H 0 com uma probabilidade de &lt;5%. Nota: Isto significa que os perfis são desiguais embora D2M é mínima. Tal resultado pode resultar de condições não-médias electroforese. <ol><li> Para corrigir estes desvios, insira na caixa de texto &quot;Observado Peak (pb)&quot; o valor 395 e pressione o botão &quot;Calcular&quot;. Verifique novamente por D2M mínimo e um ≥0.05 valor P correspondente. Se não funcionar, tente os valores 405, 415 e 425. Nota: Às vezes pequenos passos são aindaindicado. Se ainda não tiver êxito, o perfil observado não está presente nos dados de referência, que pode ser um novo genótipo ou variante. </li></ol></li><li> vários perfis <ol><li> Repita os passos de 5,6-5,9 para cada perfil de electroforese em separado. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sears, P. M., McCarthy, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+and+treatment+of+staphylococcal+mastitis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Clin.North+Am.Food+Anim.Pract%22%5BJournal%5D)">Management and treatment of staphylococcal mastitis.</a> Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract. 19 (1), 171-185 (2003).</li>
<li>Fournier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+Staphylococcus+aureus%3A+association+of+virulence+genes%2C+genotypes+and+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Res.Vet.Sci%22%5BJournal%5D)">Bovine Staphylococcus aureus: association of virulence genes, genotypes and clinical outcome.</a> Res.Vet.Sci. 85 (3), 439-448 (2008).</li>
<li>Cosandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+genotype+B+and+other+genotypes+isolated+from+cow+milk+in+European+countries%5BTitle%5D)+AND+%22J.Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus genotype B and other genotypes isolated from cow milk in European countries.</a> J.Dairy Sci. 99 (1), 529-540 (2016).</li>
<li>Boss, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+Staphylococcus+aureus%3A+Subtyping%2C+evolution%2C+and+zoonotic+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Bovine Staphylococcus aureus: Subtyping, evolution, and zoonotic transfer.</a> J.Dairy Sci. 99 (1), 515-528 (2016).</li>
<li>Graber, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mastitis-related+subtypes+of+bovine+Staphylococcus+aureus+are+characterized+by+different+clinical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Mastitis-related subtypes of bovine Staphylococcus aureus are characterized by different clinical properties.</a> J.Dairy Sci. 92 (4), 1442-1451 (2009).</li>
<li>Heiniger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kosten-Nutzen-Analyse+einer+Intervention+zur+Verbesserung+der+Eutergesundheit+in+Schweizer+Milchviehbetrieben%5BTitle%5D)+AND+%22Schweiz.Arch.Tierheilkd%22%5BJournal%5D)">Kosten-Nutzen-Analyse einer Intervention zur Verbesserung der Eutergesundheit in Schweizer Milchviehbetrieben.</a> Schweiz.Arch.Tierheilkd. 156 (10), 473-481 (2014).</li>
<li>Hamann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+the+physiological+cell+count+threshold+based+on+changes+in+milk+composition%5BTitle%5D)+AND+%22IDF+Mastitis+Newsletter%22%5BJournal%5D)">Definition of the physiological cell count threshold based on changes in milk composition.</a> IDF Mastitis Newsletter. 25, 9-12 (2003).</li>
<li>Hwang, S. Y., Park, Y. K., Koo, H. C., Park, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((spa+typing+and+enterotoxin+gene+profile+of+Staphylococcus+aureus+isolated+from+bovine+raw+milk+in+Korea%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vet.Sci%22%5BJournal%5D)">spa typing and enterotoxin gene profile of Staphylococcus aureus isolated from bovine raw milk in Korea.</a> J.Vet.Sci. 11 (2), 125-131 (2010).</li>
<li>Sakwinska, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Link+between+genotype+and+antimicrobial+resistance+in+bovine+mastitis-related+Staphylococcus+aureus+strains%2C+determined+by+comparing+Swiss+and+French+isolates+from+the+Rhone+Valley%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.Environ.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Link between genotype and antimicrobial resistance in bovine mastitis-related Staphylococcus aureus strains, determined by comparing Swiss and French isolates from the Rhone Valley.</a> Appl.Environ.Microbiol. 77 (10), 3428-3432 (2011).</li>
<li>Rabello, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilocus+sequence+typing+of+Staphylococcus+aureus+isolates+recovered+from+cows+with+mastitis+in+Brazilian+dairy+herds%5BTitle%5D)+AND+%22J.Med.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multilocus sequence typing of Staphylococcus aureus isolates recovered from cows with mastitis in Brazilian dairy herds.</a> J.Med.Microbiol. 56, 1505-1511 (2007).</li>
<li>Tavakol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine-associated+MRSA+ST398+in+the+Netherlands%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Vet.Scand%22%5BJournal%5D)">Bovine-associated MRSA ST398 in the Netherlands.</a> Acta Vet.Scand. 54, 28(2012).</li>
<li>Harmsen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Typing+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+in+a+university+hospital+setting+by+using+novel+software+for+spa+repeat+determination+and+database+management%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management.</a> J.Clin.Microbiol. 41 (12), 5442-5448 (2003).</li>
<li>Zadoks, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+pulsed-field+gel+electrophoresis+and+binary+typing+as+tools+in+veterinary+clinical+microbiology+and+molecular+epidemiologic+analysis+of+bovine+and+human+Staphylococcus+aureus+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Application of pulsed-field gel electrophoresis and binary typing as tools in veterinary clinical microbiology and molecular epidemiologic analysis of bovine and human Staphylococcus aureus isolates.</a> J.Clin.Microbiol. 38 (5), 1931-1939 (2000).</li>
<li>Cremonesi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+characteristics+of+Staphylococcus+aureus+strains+associated+with+high+within-herd+prevalence+of+intramammary+infections+in+dairy+cows%5BTitle%5D)+AND+%22J.Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Genomic characteristics of Staphylococcus aureus strains associated with high within-herd prevalence of intramammary infections in dairy cows.</a> J.Dairy Sci. 98 (10), 6828-6838 (2015).</li>
<li>Enright, M. C., Day, N. P., Davies, C. E., Peacock, S. J., Spratt, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilocus+sequence+typing+for+characterization+of+methicillin-resistant+and+methicillin-susceptible+clones+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus.</a> J.Clin.Microbiol. 38 (3), 1008-1015 (2000).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O passo mais importante de todo o processo é quando há um excesso de ADN de RS-PCR (&gt; 30 ng de ADN / ensaio puro) 2. Em geral, a resolução de um perfil é ideal se todos os seus picos de começar e terminar na linha de base. Se dois picos são muito próximos, a resolução é incompleto. Sob estas condições, o software Bioanalyzer inadequado pode levar ao pico de identificação de modo a que é requerida uma identificação manual. Todos os picos visivelmente separadas e relevantes expre...

Staphylococcus (S. aureus) é conhecido como o mais importante agente patogénico responsável a nível mundial para a infecção intramamária (IMI) em bovinos 1. O estudo realizado por Fournier et al. 2 demonstraram em vacas suíças e os estudos por Cosandey et al. 3 e Boss et al. 4, em vacas de 12 países europeus que S. aureus isolados de bovinos IMI é um grupo geneticamente heterogénea. Por amplificação por PCR de rRNA 16S-23S região espaçadora de intergénica (RS-PCR), um total de 17 genótipos foram inicialmente detectados em 101 isolados independentes epidemiologicamente 2. Genótipo B eo genótipo C (GTC) eram mais comuns (80%), enquanto os outros 15 genótipos (GTs) ocorreram raramente, cada um fazendo 1 a 4% de todos os isolados. A nível europeu 3, GTB, GTC, GTF, GTI e GTR foram os genótipos mais importantes que compreendem 76% de todas as cepas analisadas (n = 456). GTB estava situada na Europa Central whereas os outros genótipos foram amplamente divulgados. Os restantes 24% das cepas incluiu 41 genótipos, muitos deles, no entanto, foram observados apenas uma vez. Os estudos por Fournier et al. 2, Cosandey et al. 3, e Graber et ai. 5 ainda demonstrado que os genótipos foram altamente associado com o seu padrão de gene de virulência, bem como no Swiss como a nível europeu. Os estudos revelaram ainda grandes diferenças na prevalência do IMI entre S. aureus GTB, GTC e os outros genótipos de 2,5: Considerando GTB, até 87% das vacas em um rebanho foram infectados por esse genótipo. No caso de GTC e de outros genótipos, no entanto, o IMI foi encontrado apenas em 1 a 2 vacas de uma manada. IMI causada por S. aureus, normalmente resulta em inflamação das glândulas mamárias correspondentes e um aumento de células inflamatórias no leite. Como consequência, a co células somáticasunts no leite (SCC), o principal indicador da qualidade do leite na maioria dos países, é aumentada levando a um preço de leite diminuída ou até mesmo parar de entrega. Além do RS-PCR de Fournier et ai. 2, outros métodos de tipagem foram descritas para subtipar estirpes de S. bovina aureus 8-11. Dois dos mais comuns incluem spa digitação 12 e multi Locus Sequence Typing (MLST) 13. O primeiro é baseado em sequenciação de ADN da região variável de espaçador do gene que codifica para a proteína Termas de estafilococos A, enquanto que o segundo exige uma sequenciação de 7 genes housekeeping. Isto significa que um e sete 12 PCRs 13, respectivamente, têm de ser realizada, seguido por purificação amplicão, reacção de sequenciação e análise utilizando equipamento específico. Em comparação com RS-PCR, estes métodos requerem um considerável esforço adicional no laboratório resultando num rendimento de amostras de baixo e custos elevados. othroughput é particularmente baixa para PFGE. Considerando a resolução destes métodos para as estirpes da espécie bovina de S. aureus, RS-PCR é pelo menos tão boa como spa digitando 4 e melhor do que MLST 4 ou 15 PFGE. Todos estes métodos, incluindo digitação binário 13 demonstraram a sua eficácia na obtenção de mais conhecimento sobre a patogênese da bovina IMI causada por S. aureus, mas por causa das restrições mencionadas são menos apropriada para grandes investigações clínicas. Além disso, a genotipagem pela RS-PCR como descrito por Fournier et al. 2 permite a previsão fiável do epidemiológica e o potencial patogênico de S. aureus envolvido no IMI bovina, dois valores-chave na medicina veterinária clínica.

<table><tbody><tr><td>Tris (hidroximetil) -aminometano</td><td>Merck</td><td>1,08382,0500</td><td>Mw = 121,14 g / mol</td></tr><tr><td>Titriplex III</td><td>Merck</td><td>1,08418,0250</td><td>Mw = 372,24 g / mol; A substância é equivalente a Na2EDTA&middot; 2H2O</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico 5 mol/L</td><td>Merck</td><td>1.09911.0001</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Columbia+5% de sangue de ovelha</td><td>bioM&eacute; rieux</td><td>43049</td><td></td></tr><tr><td>Kit de DNA7500 Agilent</td><td>Technologies</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 software especialista</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq master mix&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>203445</td><td></td></tr><tr><td>Primer L1</td><td>Mycrosinth</td><td></td><td>5'CAA GGC ATC CAC CGT3'Primer</td></tr> <tr><td>G1</td><td>Mycrosinth</td><td></td><td>5'GAA GTC GTA ACA AGG3'</td></tr></tbody></table>

genotipagem de<em&gt; staphylococcus aureus</em&gt; por ribossômico spacer pcr (rs-pcr)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

A PCR espaçadora ribossômica (RS-PCR) é um método de genotipagem altamente resolutivo e robusto para S. aureus que permite um alto rendimento a custos moderados e, portanto, é adequado para ser usado para fins rotineiros. Para melhor resolução, avaliação e gerenciamento de dados, é necessário um sistema de eletroforese miniaturizado. Juntamente com esse sistema de eletroforese e o software desenvolvido internamente (disponível gratuitamente aqui), a atribuição do padrão de bandas a um genótipo é padronizada e direta. A extração de DNA é simples (preparação de ebulição), a configuração das reações é fácil e elas podem ser executadas em qualquer máquina de PCR padrão. A ciclagem de PCR é comum, exceto tempos prolongados de rampa e alongamento. Em comparação com a tipagem spa e a tipagem de sequência multilocus (MLST), o RS-PCR não requer sequenciamento de DNA, o que simplifica consideravelmente a análise e permite um alto rendimento. Além disso, a resolução para cepas bovinas de S. aureus é pelo menos tão boa quanto a tipagem spa e melhor do que MLST ou eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). O banco de dados RS-PCR inclui atualmente um total de 141 genótipos e variantes. O método está altamente associado ao padrão genético de virulência, contagiosidade e patogenicidade de cepas de S. aureus envolvidas na mastite bovina. O genótipo B de S. aureus (GTB) é contagioso e causa problemas nos rebanhos, causando grandes custos na Suíça e em outros países europeus. Todos os outros genótipos observados na Suíça infectam vacas e quartos individuais. A genotipagem por RS-PCR permite a previsão confiável do potencial epidemiológico e patogênico de S. aureus envolvido na infecção intramamária bovina (IMI), dois fatores-chave para a medicina clínica veterinária. Devido a essas propriedades benéficas, juntamente com custos moderados e um alto rendimento de amostras, o objetivo desta publicação é fornecer um protocolo detalhado e passo a passo para estabelecer e executar facilmente RS-PCR para genotipagem de S. aureus em outros laboratórios.

Definição de um genótipo e suas variantes Um perfil electroforético que difira em mais do que uma banda de todos os genótipos identificados é considerado como um novo genótipo. Novos genótipos são nomeados e ampliado de acordo com a Fournier et al. 5 levando aos genótipos GTA a GTZ, seguido pelos genótipos GTAA para GTAZ e GTBA para GTBZ e GTCA para GTCC no presente. Variação em apenas uma faixa é considera...

Aqui, o espaçador ribossômico PCR (RS-PCR) é usado em conjunto com um sistema de eletroforese miniaturizado como um método rápido e de alta resolução para genotipagem de S. aureus a custos moderados, permitindo um alto rendimento.

genotipagem de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; por Ribossômico Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

O objetivo geral deste procedimento é obter genótipos de Staphylococcus aureus e associá-los à doença em hospedeiros. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área da mastite bovina, visando proteger contra a contagiosidade e a passagenicidade de Staphylococcus aureus, isolando-o de vacas com infecção intramamária. Demonstrará o procedimento Ivana Ivanovic, técnica do meu laboratório.Para começar, espalhe 10 microlitros de cultura estoque de Staphylococcus aureus ou uma colônia cultivada em meio seletivo em placas de Ágar Columbia contendo 5% de sangue de carneiro, ou BA. Incube a cultura em aerobiose a 37 graus Celsius por 18 a 24 horas. Use um alça plástica estéril ou palito de dente de madeira para coletar uma colônia bacteriana de uma placa de ágar BA e re-suspenda-a em 100 microlitros de TEL em um tubo de tampa rosqueável de 1,5 mililitro. Incube as amostras a 95 graus Celsius por 10 minutos e coloque-as imediatamente sobre gelo úmido.Em seguida, dilua as amostras de um para 100 em água apropriada para PCR. Prepare uma mistura-mestre adicionando a um tubo os reagentes listados aqui. Depois, distribua-a em tubos de PCR e adicione o DNA das amostras.Inclua um

genotyping-of-staphylococcus-aureus-by-ribosomal-spacer-pcr-rs-pcr

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós descrevemos um multiplex PCR para a detecção rápida de Salmonella enterica sorotipos Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium. Sorovares de Salmonella específicos podem ser identificados por alvo um multiplex PCR para os genes e as seqüências exclusivas para o cluster biossíntese O antígeno-flagelina e de um sorovar dado. Sorovar é atribuída então a uma Salmonella isolar baseado na aparência de amplicons específicos, o tamanho (produto de PCR) correspondente ao alelo alvo.

Uma PCR Allelotyping para Identificar Salmonella enterica Sorovares Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium

Um eficiente do genoma método única mutação genética foi estabelecida...

Do genoma deleções de genes em<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de Alto Rendimento

Demonstramos um ensaio de PCR multiplex simples para triagem e tipagem rápidas de Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) tipos I-V para Staphylococcus aureus resistente à meticilina e fornecemos algumas das etapas vitais e nuances processuais que o tornam bem-sucedido na adaptação deste ensaio a laboratórios individuais.

Multiplex PCR Ensaio para a digita

Caracterizar a comunidade microbiana tem sido um objetivo de longa data na microbiologia ambiental. Os métodos de sequenciamento de última geração agora permitem a caracterização de comunidades microbianas em uma profundidade sem precedentes, com custo e mão de obra mínimos. Detalhamos aqui nossa abordagem para sequenciar genes de RNA ribossômico 16S bacteriano usando um sequenciador de bancada.

O sequenciamento de próxima geração de 16S RNA ribossomal Gene amplicons

Este protocolo descreve a detecção de integrons de classe 1 e seus de genes associados em alimentos.

Triagem géneros alimentícios destinados a uma classe integrons e Gene Cassetes

A espectrometria de massa de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS) e as técnicas moleculares (sequenciamento do gene 16S rRNA) permitem a identificação de patógenos bacterianos raros em diagnósticos de rotina. O objetivo deste protocolo reside na combinação de ambas as técnicas, o que leva a dados mais precisos e confiáveis.

Identificação de patógenos bacterianos raras, seqüência do gene 16rRNA e MALDI-TOF MS

Nós descrevemos um método eficiente, robusto e de baixo custo para extração de ácidos nucleicos de cotonetes para a caracterização das comunidades bacterianas usando 16S rRNA amplicon gene seqüenciamento. O método permite uma abordagem comum para processamento de múltiplos tipos de amostras e acomoda uma série de processos analíticos jusante.

Eficiente de Ácido Nucleico Extração e sequenciamento genético 16S rRNA para Bacteriana Comunidade Caracterização

Aqui, apresentamos um protocolo para rastreamento genômica contaminação de DNA (gDNA) em amostras de RNA. O método apresentado utiliza primers específicos para a região de espaçador transcrito interno (ITS) de genes ribossomais de DNA (rDNA). O método é adequado para detecção fiável e sensível de contaminação de DNA na maioria dos eucariontes e procariontes.

Avaliação da contaminação de DNA em amostras de RNA com base no ADN ribossómico

Protocolos para a utilização de biofilmes fluxo de abrir o sistema com reatores de fluxo de gotejamento e girando reatores disco são apresentadas em detalhe.

O uso do fluxo de gotejamento e Reatores de disco rotativo para Staphylococcus aureus Análise de biofilme

Pele murina e modelo de infecção dos tecidos moles é utilizado para avaliar a função de virulência de Staphylococcus aureus resistente (MRSA) e as respostas imunológico do hospedeiro. Aqui, apresentamos um modelo de infecção subcutânea por infecção da pele e tecidos moles.

Infecção subcutânea de Staphylococcus aureus resistente (MRSA)

Aprenda a genotipagem de Staphylococcus aureus por RS-PCR com eletroforese miniaturizada para estudo de mastite bovina. Este método rápido e de alto rendimento auxilia pesquisadores na análise de transmissão.

genotipagem de

Explorar mais vídeos