Name: Transdução-Transplante Rato Modelo de neoplasia mieloproliferativa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprenda o método de transdução-transplante para gerar modelos murinos expressando genes específicos em células hematopoiéticas. Esta técnica permite estudar neoplasias hematológicas e hematopoiese normal em pouco tempo.

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Este trabalho é apoiado pelo V Foundation Scholar (AGF) e pela MPN Research Foundation (AGF).

Este estudo foi aprovado e executado de acordo com as recomendações do Comité Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade da Califórnia, Irvine. Todos os procedimentos foram realizados sob anestesia isoflurano e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. 1. Produção de Retrovírus ecotrópico <ol><li> Preparar plasmídeos de alta qualidade com uma concentração de pelo menos 1 mg / mL usando um kit Maxi-prep comercial ou purificação de cloreto de césio. Nota: Estes incluem um vector de espinha dorsal MSCV que codifica o gene de interesse (neste caso Calr 7,8) e o marcador de escolha (GFP, neo, etc.), bem como um plasmídeo empacotamento ecotrópico, codificação de gag-pol-env (referido como aqui plasmídeo). </li><li> Descongelar e expandir células 293T de baixa passagem em DMEM suplementado com 10% de FBS e L-glutamina com penicilina / estreptomicina (D10). Placa 5 x 10 6 células em um prato de 10 centímetros de tecido tratado com a cultura em um umidificadoincubador de cultura de tecido a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Expandir células 293T em cultura. No dia antes da transfecção, as células lavagem por adição de 1 ml de PBS e aspirar o sobrenadante para um balão de vácuo. </li><li> Para trypsinize células, adiciona-se 2 ml de tripsina a 0,05% e incubar pratos numa incubadora de cultura de tecidos humidificada durante 2-3 min a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Para parar a tripsinização, adicionar 3 ml D10 de prato e células de transferência para um tubo de 15 ml. Girar células a 400 xg durante 10 minutos. </li><li> Aspirar o sobrenadante para um agregado de células frasco de vácuo e ressuspender em 2 ml de D10. </li><li> Contagem das células por exclusão do azul de tripano utilizando um hemocitómetro. </li><li> Semente de 2 x 10 6 culas por prato em três tecidos de 10 cm pratos tratados com cultura por vírus gerados. NOTA: Para melhores resultados, não permitem que as células de exceder 30-50% de confluência no momento da transfecção ou pode ser obtido um rendimento de vírus pobre. </li><li> Imediatamente antes da transfecção,media aspirado em um balão de vácuo e substituir com 5 ml D10 fresco. </li><li> Para cada placa de Petri de 10 cm para ser transfectada preparar um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml esterilizado individual. </li><li> Pipeta 760 ul de meio de soro reduzido em cada tubo de microcentrífuga, em seguida, adicionar cuidadosamente 40 mL de reagente de transfecção diretamente para a mídia. Incubar os tubos no capuz de cultura de tecidos à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Adicionar 30 g de MSCV vector com o gene de interesse (15 ug se utilizando o vector vazio), bem como 5 ug de plasmídeo a cada tubo respectivo e misturar suavemente por pipetagem para cima e para baixo. Incubar à temperatura ambiente no capuz de cultura de tecidos durante mais 15 min. NOTA: vetores menores tendem a ter rendimentos virais mais elevadas. </li><li> Cuidadosamente adicionar o volume total de cada reacção (aproximadamente 800 mL) gota a gota em seu respectivo 10 centímetros de Petri e gentilmente incline o prato de lado a lado para misturar. células retornar ao cu tecido umidificadoincubadora LTURE. </li><li> Após 8 h ou uma incubação durante a noite na incubadora de cultura de tecidos, meios aspirado para um frasco de vácuo e colocar suavemente com 10 ml de D10 fresco. </li><li> Em 48 horas após a transfecção recolher o sobrenadante para uma seringa de 35 mL e filtrar através de uma membrana de 0,45 pm para remover detritos celulares. </li><li> OPCIONAL: Coloque 10 ml de volta fresco D10 nas células 293T e vírus adicional pode ser colhida em 72 horas após a transfecção. </li><li> Descarte as células 293T em resíduos de risco biológico quando nenhum vírus adicionais são coletadas. </li><li> sobrenadante viral alíquota em volumes de uso único (por exemplo, 1 ml de título do vírus ou 6,5 ml para a infecção BM). vírus flash-congelamento com nitrogênio líquido e vírus armazenar a -80 ° C. NOTA: Evitar ciclos de congelamento / descongelamento repetidos à medida que reduzir muito o título do vírus. </li></ol> 2. Determinar título viral Relativa por Citometria de Fluxo <ol><li> Thaw 3T3 e manter em D10. Cultura as células em um 10 centímetrosda cultura de tecidos tratados prato numa incubadora de cultura de tecidos humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Realizar título virai em triplicado. Para preparar as células, lavar as células por adição de 1 ml de PBS e aspirar o sobrenadante para um balão de vácuo. </li><li> Para trypsinize células, adiciona-se 2 ml de tripsina a 0,05% e incubar pratos numa incubadora de cultura de tecidos humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Para parar a tripsinização, adicionar 3 ml D10 de prato e células de transferência para um tubo de 15 ml. Girar células a 400 xg durante 10 minutos. </li><li> Aspirar o sobrenadante para um agregado de células frasco de vácuo e ressuspender em 2 ml de D10. </li><li> Contagem das células por exclusão do azul de tripano utilizando um hemocitómetro. </li><li> Semente células 3T3 a uma densidade de 1 x 10 5 células em quinze 60 mm pratos de tecido de cultura tratados com e incubar durante a noite. </li><li> Adicione 1: 3, 1:10, 1:30, e 1: 100 de sobrenadante viral diluições descongelado, usando D10 em um total de 1 ml. Também incluem um controle livre de vírus. </li><li> aspirar meDiâmetro de células 3T3 em um frasco de vácuo e substituir com 4 ml de D10. </li><li> Sobrepor as células 3T3 com as diluições do sobrenadante viral e adicionar polibreno a uma concentração final de 8 ug / ml a cada placa. Incubar durante 48 horas na incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Determinar título virai em relação por citometria de fluxo: <ol><li> Para lavar as células, aspirar os meios de comunicação em um balão de vácuo e adicionar 5 ml PBS. </li><li> Aspirar o PBS para um balão de vácuo. Adicionar 1 ml de 0,05% de tripsina e incubar a 37 ° C durante 2-5 minutos para separar as células do prato. </li><li> Adicionar 3 ml D10 e pipeta cima e para baixo para destacar todas as células restantes da placa. Transferir as células num tubo de FACS e centrifugar a 400 xg durante 10 min. </li><li> Decantar o sobrenadante e lavar as células com 3 ml de PBS. Centrifuga-se a 400 xg durante 10 min e o sobrenadante decantado. Ressuspender em 200 ul de PBS. </li><li> Células executado em um citômetro de fluxo 9. Recolha entre 20.000 - 30.000 eventos dentro tele vive portão celular (determinado pelo FSC vs. SSC) e calcular a percentagem de GFP + e GFP - células. NOTA: O título virai é considerada aceitável quando a diluição do sobrenadante rendimentos virais, pelo menos, 50% + 3T3 células GFP 01:30. Se esta diluição resulta em menos do que 50% de células GFP +, em seguida, sub-óptimos resultados de transdução pode ser obtido. O cálculo para determinar título virai foi adaptado a partir Limon et ai. , Blood (1997) 9. </li><li> Para determinar o título do vírus relativo, use a equação: título do vírus = formando partículas unidades (UFP) / ml = [(Número de 3T3 × frequência de células GFP +) / Volume de sobrenadante (ml)] × Factor de diluição. </li></ol></li></ol> 3. transdução de Doadores Células de Medula Óssea <ol><li> Para preparar ratinhos dadores de medula óssea (BM) de colheita, primeiro anestesiar ratos por vaporizador de isoflurano com uma taxa de fluxo de 5% suplementar combinadaoxigénio em 1 L / min. Comprima pé para avaliar a resposta. NOTA: Os ratinhos dadores (menos de 8 semanas de idade) deve ser preparado 5 dias antes da colheita de medula óssea (8 dias antes da transplantação). Um camundongos doadores irá fornecer células suficientes para pelo menos 2 receptores. </li><li> Injectar 150 mg / kg de 5-fluorouracilo (5-FU) por meio de injecção retro-orbital em ratos anestesiados usando um 27 L × ½ &quot;agulha. CUIDADO! 5-FU um agente quimioterapêutico anti-câncer. Sempre lidar com 5-FU dentro de uma Cobertura de vapores químicos certificada ou de um gabinete de biossegurança canalizado. Consulte o comitê de segurança de laboratório e animal da instituição para determinar uma rotulagem adequada de camundongos tratados com 5-FU. <ol><li> Posicione o mouse anestesiado em seu lado e restringir usando tanto o polegar eo dedo indicador de modo a que o olho sai ligeiramente da cabeça. </li><li> Começando com o lateral, agulha para o canto medial e com o bisel voltado para cima, insira a agulha em um 45° ângulo na direção medial e parar quando a agulha é inserida no meio do caminho. Lentamente injetar células e remover remova cuidadosamente agulha. NOTA: Se esta técnica é realizada corretamente, o olho deve recuar um pouco e nenhuma resistência deve ser sentida após a inserção da agulha. </li><li> Examine o mouse para detectar quaisquer sinais de lesão, tais como inchaço ou hemorragia. </li></ol></li><li> Colheita da medula óssea 5 dias após o tratamento com 5-FU (3 dias antes da transplantação). <ol><li> Anestesiar ratos por vaporizador de isoflurano com uma taxa de fluxo de 5% de oxigénio suplementar combinada em 1 L / min. Comprima pé para avaliar a resposta. </li><li> Sacrifício do mouse por deslocamento cervical. Esterilizar rato pulverizando generosamente com etanol 70%, até a pele ficar molhada. </li><li> Usando dissecando tesoura, fazer uma incisão na pele e dissecar a fáscia longe dos músculos da perna. Em seguida, dissecar a mão fora de rato, cortando o fêmur na altura do quadril e da tíbia, no tornozelo. </li><li> dobrara perna em um &quot;L&quot; forma e separar cada osso da perna, cortando na articulação do joelho com uma tesoura de dissecção. </li><li> Para remover cartilagem nas extremidades distais de cada osso da perna, usar as tesouras de dissecação para raspar suavemente músculo direcção de uma extremidade do osso da perna, até a cartilagem é desengatada. </li><li> Usando uma seringa com uma agulha de 27 G x ½ polegada, lave cada osso da perna com PBS suplementado com 2% de FBS ao longo de um membrana de nylon de 100 um de um tubo de 50 ml. osso nivelado até osso torna-se branco para maximizar o número de células colhidas. </li><li> Utilizar o êmbolo de uma seringa para triturar as células através da membrana de nylon no interior do tubo cónico de 50 ml para se obter uma suspensão de célula única. Repita com a outra perna mouse. </li></ol></li><li> células Centrifugar a 4 ° C durante 10 min a 400 xg e rejeitar o sobrenadante. Ressuspender BM potássio em 5 ml de cloreto de amónio (ACK) tampão para lisar as células vermelhas do sangue. Incubar as células em gelo durante 10 min. </li><li> Encha o tubo com PBS para parar a lise celular. Centrifuge células a 4 ° C durante 10 min a 400 xg e rejeitar o sobrenadante. Repita o passo de lise se o pellet BM tem da cor vermelha. </li><li> Ressuspender em 5 ml de PBS e contagem de células por exclusão com azul de tripano utilizando um hemocitómetro. </li><li> Ressuspender as células a 2 x 10 6 culas por M e um cocktail pré-STIM 2x que contém DMEM suplementado com 20% de FBS, L-glutamina, penicilina / estreptomicina, a IL-3 (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / ml), e SCF (112 ng / ml). Placa de 2 ml por poço em placas de 6 cavidades. </li><li> Incubam-se as células durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Adicionar 2 ml de sobrenadante virai para cada poço contendo células de MO e adicionar polibreno (8 ug / ml). chapas giram a 30 ° C durante 90 min a 1500 xg, em seguida, voltar a placa na incubadora de cultura de tecidos durante a noite. </li><li> suspensão de células em tubos cónicos de pipeta e centrifugar a 4 ° C durante 10 minutos a 400 xg, não elimine a placa. Ressuspender as células em 2 ml fresco 2x cocktail pré-Stim por poço e voltar aos poços originais. </li&gt; <li> Executar uma spinoculation 2º, repetindo os passos 3,7-3,9. </li></ol> 4. Células de transplantes em ratos destinatário <ol><li> Prepare ratinhos receptores singeneicos para transplante com uma dose de irradiação corporal total letal &lt;24 hr antes da injecção de células de MO. NOTA: irradiação dose letal para camundongos BALB / c é normalmente 800-900 cGy e 1.000-1.200 cGy para C57B / 6 10. A dose está tipicamente em duas sessões de irradiação espaçados, pelo menos, 3-4 horas de intervalo. </li><li> Continuação da etapa 3.11, células do doador colheita transduzida a partir das 6 placas de poços com cuidado pipetando sobrenadante para tubos cônicos. Lave cada poço com 1 ml de PBS para coletar células residuais e adicionar 50 ml tubos cônicos. </li><li> Adicionar 0,5 ml de tripsina a 0,05% aos poços e incuba-se a 37 ° C na incubadora de cultura de tecido durante 5 minutos. </li><li> Adicionar 1 ml D10 aos poços e retirar todas as células restantes por pipetagem suave. Adicionar células para o respectivo tubos a partir do passo 4.2 e sedimento por centrifugação a 4 ° C durante 10 min a 400 x g. </li><li> Lavar células com PBS e centrifugação a 4 ° C durante 10 min a 400 x g. Ressuspender em 5 ml PBS e contagem de células usando um hemocitômetro por exclusão azul de tripano. NOTA: Se o vector tem uma marcação GFP então quantificar a percentagem de células positivas para GFP com um citómetro de fluxo. </li><li> Ressuspender 5 x 10 5 - 2 X 10 6 células em 50 - 100 ul de PBS para injecção em ratinhos. </li><li> Injetar células através de injecção retro-orbital em ratos anestesiados usando um 27 G x ½ &quot;agulha estéril. NOTA: Outras técnicas de injeção incluem tail-veia, baço, ou femoral. <ol><li> Anestesiar mouse usando isoflurano e pitada pé para avaliar a resposta. </li><li> Posicione o mouse de lado e restringir usando tanto o polegar eo dedo indicador de modo a que o olho sai ligeiramente da cabeça. </li><li> Com o bisel voltado para cima, insira o needle lateral ao canto medial em um ângulo de 45 °. NOTA: Se esta técnica é realizada corretamente, o olho deve recuar um pouco e nenhuma resistência deve ser sentida após a inserção da agulha. </li><li> Examine o mouse para detectar quaisquer sinais de lesão, tais como inchaço ou hemorragia. NOTA: Seguindo ratos transplante terá baixa contagem do sangue para um número de semanas e por isso são suscetíveis à infecção. pode ser utilizada a profilaxia com antibióticos ou uso de água acidificada. </li></ol></li><li> Um mês após o transplante, medir a GFP% no sangue periférico como indicador para células doadoras enxertados, por citometria de fluxo. NOTA: GFP sozinha não pode determinar o sucesso do enxerto de células. A transdução viral pode ter falhado ainda enxerto pode ter ocorrido. Neste caso, não há células GFP + seria detectado, mas o enxerto de células transplantadas foi bem-sucedida. <ol><li> Tome 10 ml de sangue periférico bY punção da veia safena da perna com um 21 L x 1 ½ &quot;seringa e adicioná-lo ao EDTA 100 mM em PBS, para prevenir a coagulação. </li><li> Adicionar 1 mL de ACK para o sangue e lise em gelo durante 10 min. as células por centrifugação a 400 xg durante 10 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante num balão de vácuo e adicionar 1 ml de PBS suplementado com FBS a 2% para parar a lise. as células por centrifugação a 400 xg durante 10 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante num balão de vácuo e sedimento ressuspender em 100 ul de PBS suplementado com 2% de FBS. </li><li> Executar amostras em um citômetro de fluxo e recolher 300.000 eventos dentro do portão de células vivas (determinado pelo FSC vs. SSC) e calcular a percentagem de GFP + e GFP - células 9. </li></ol></li><li> Além disso em 1 mês pós-transplante, realizar hemogramas completos (CBC) usando um analisador de hematologia veterinária automatizado 18 para monitorar a progressão da doença. NOTA: Continue a monitorar a doença por%GFP no sangue periférico e CBC mensalmente. </li><li> Para terminar a experiência, anestesiar mouse usando isoflurano e pitada pé para avaliar a resposta. Sacrifício do mouse por deslocamento cervical e baço colheita e medula óssea para histopatologia. NOTA: A duração do experimento é subjetivo e a data da rescisão deve ser avaliada com base no fenótipo da doença esperado. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo fornece uma descrição detalhada de como realizar os transplantes de medula óssea em ratinhos recapitular uma doença trombocitemia essencial, como com progressão para mielofibrose com mutação CALRdel52 como o controlador da doença. O transplante bem sucedido de células que expressam os resultados CALRdel52 no aumento de plaquetas, a expansão de megacariócitos e fibrose da medula óssea. Como o transplante de medula óssea é um processo de vários passos, é importante reconhecer passos onde erro técnico pode s...

Transdução-transplante é um método útil para modelar doenças malignas hematológicas em ratinhos. Esta técnica tem sido particularmente valiosa para estudar malignidades mielóides que datam da primeira demonstração de que a expressão ectópica de BCR-ABL1 poderia fielmente recapitular leucemia mielóide crônica em ratos 1. Esta técnica foi posteriormente facilitou o estudo extensivo de JAK2 V617F e MPL W515K / L mutado neoplasia mieloproliferativa (MPN). NMP são um grupo de doenças hematológicas, caracterizado por o excesso de produção de células mielóides maduras e fibrose da medula óssea. Essas doenças geralmente surgem a partir da expansão clonal de uma célula-tronco hematopoiéticas, que adquiriu uma mutação somática em qualquer Jak2, MPL, ou Calr. Transdução-transplante JAK2 V617F e MPL W515K L modelos / exibem as características clínicas da policitemia vera e mielofibrose 2-5 &lt;/ Sup&gt;. Recentemente, também foi gerado um modelo de ratinho de NMP mutada-calreticulina com o método de transdução-transplante 6. Estes ratinhos desenvolvem uma doença essencial thrombocythemia-like com o aumento das plaquetas, aumento do número de megacariócitos e fibrose da medula óssea. Juntos, esses modelos não só forneceram a oportunidade para obter insights sobre a patogênese molecular do MPN, mas também a capacidade de desenvolver e estudar terapias em um ambiente pré-clínica. Este manuscrito fornece uma descrição detalhada da metodologia de transdução-transplante, com foco na mutação CALRdel52. Esta técnica envolve a transplantação de células de medula óssea transduzidas retroviralmente expressando o mutante de construir em ratinhos receptores singeneicos irradiados.

<table><tbody><tr><td>Cell Lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>MT-10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>293T células</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>3T3 células</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoPak, também conhecido como pCL-Eco</td><td>Addgene</td><td>12371</td><td>Linhas celulares de empacotamento retroviral, como EcoPack 2-293, podem ser usadas no lugar do plasmídeo EcoPak e das células 293T padrão. Envelopes adicionais de retrovírus e plasmídeos de embalagem estão disponíveis na Addgene e outros.</td></tr><tr><td>MSCV-IRES-GFP (MIG) Addgene</td><td></td> <td>20672</td><td>Plasmídeos de transferência &gamma;-retrovirais adicionais estão disponíveis na Addgene e outros.</td></tr><tr><td><forte> consumíveis< / forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 G x 1/2 "agulhas</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Corning</td><td>MT-35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / estreptomicina / L-glutamina</td><td>Corning</td><td>MT-30-009-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%)</td> <td>Corning</td><td>MT-25-052-CI</td><td>Pode ser PBS caseiro</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de 10 cm</td><td>Fisher</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 15 ml</td><td>Pratos Fisher</td><td>12565268</td><td></td></tr><tr><td>60 mm</td><td>Fisher</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Fisher</td><td>NC9840454</td><td></td></tr><tr><td>5-FU</td><td>Fisher</td><td>A13456-06</td><td></td></tr><tr><td>100 &#181; filtros de células m</td><td>Fisher</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 50 ml</td><td>Fisher</td><td>12565270</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 poços</td><td>Fisher</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>tubos FACS</td><td>Fisher</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m filtros de seringa</td><td>Fisher</td><td>0974061B</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>ACK buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Pode ser caseiro</td></tr><tr><td>IL-3 murino recombinante</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 murino recombinante</td><td>Peprotech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>SCF murino recombinante</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365809001</td><td>Reagente de transfecção</td></tr> tubos de <tr><td>centrífuga de 1,5 ml</td><td>EUA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Irradiador</td><td></td><td></td><td></td> de raios-X</tr></tbody></table>

transdução-transplante rato modelo de neoplasia mieloproliferativa

Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

O transplante de transdução é uma maneira rápida e eficiente de modelar malignidades hematológicas humanas em camundongos. Essa técnica resulta na expressão do gene de interesse nas células hematopoiéticas e pode ser usada para estudar o papel do gene na hematopoiese normal e/ou maligna. Este protocolo fornece uma descrição detalhada sobre como realizar o transplante de transdução usando mutações de calreticulina (CALR) recentemente identificadas na neoplasia mieloproliferativa (NMP) como exemplo. Neste protocolo, células inteiras da medula óssea de camundongos doadores tratados com 5-flurouracil (5-FU) são transduzidas com um retrovírus que codifica o CALR mutante e transplantadas para hospedeiros singênicos letalmente irradiados. As células doadoras que expressam CALR mutante são marcadas com proteína fluorescente verde (GFP). Os camundongos transplantados desenvolvem um fenótipo MPN, incluindo plaquetas elevadas no sangue periférico, expansão de megacariócitos na medula óssea e fibrose da medula óssea. Fornecemos um relato passo a passo de como gerar retrovírus, calcular o título viral, transduzir células inteiras da medula óssea e transplantar em camundongos receptores irradiados.

A técnica de transdução-transplante resulta na reconstituição hematopoiética dos ratinhos receptores com células que expressam o gene de interesse. A Figura 1 mostra uma visão geral do modelo de rato transdução-transplante de calreticulina mutado MPN. Resumidamente, retrovírus que expressam CALRwt ou CALRdel52 é utilizado para infectar células de MO de um ratinho dador C57B / 6. transduzidas células são transplantadas para irradiado C57B / 6 rato receptor e doador da cél...

Este manuscrito fornece uma descrição da metodologia usada para estabelecer modelos de camundongos de transdução-transplante. Um relato detalhado é dado de erros técnicos a serem evitados ao realizar transplantes de medula óssea. Deve-se obter uma compreensão clara da importância do alto título viral, transfecção/transdução e irradiação.

Transdução-Transplante Rato Modelo de neoplasia mieloproliferativa

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar camundongos que expressem o gene de interesse em células hematopoiéticas utilizando o método de transdução-transplante. Em um curto período de tempo, este método pode ajudar a determinar se o seu gene de interesse induz uma neoplasia hematológica. As implicações desta técnica estendem-se para a terapia ou diagnóstico de neoplasias hematológicas, devido ao desenvolvimento acelerado de modelos murinos que podem testar terapêuticas putativas.Embora este método possa fornecer informações sobre malignidades hematológicas, ele também pode ser usado para estudar o papel de um gene de interesse na hematopoiese normal. Geralmente, indivíduos novos nesta experiência terão dificuldades, pois ela exige múltiplas etapas. Além disso, a geração de um vírus com título elevado é fundamental para o sucesso deste experimento.A demonstração visual deste procedimento é importante, pois trabalhar com camundongos pode ser difícil e exige prática. Após anestesiar um camundongo e verificar a profundidade da anestesia de acordo com o protocolo descrito no texto, posicione o animal de lado e, usando o polegar e o indicador, imobilize-o de modo que o olho protruda ligeiramente da cabeça. Para injetar 150 miligramas por quilograma de 5-fluorouracil, ou 5-FU, por via retro-orbital, insira uma agulha de meia polegada e 27 graus de calibre em um ângulo de 45 graus, com o bisel voltado para cima, na direção medial, e pare quando a agulha estiver inserida até a metade.Injete lentamente a solução e, em seguida, remova cuidadosamente a agulha. Examine o camundongo em busca de sinais de lesão, como inchaço ou sangramento, e certifique-se de que ele se recupere e comece a andar. Cinco dias depois, após sacrificar o animal de acordo com o protocolo descrito, use etanol 70% para esterilizar o camundongo, borrifando generosamente até que o pelo fique úmido.Com tesoura de dissecação, faça uma incisão na pele e dissecção a fáscia dos músculos da perna. Em seguida, separe a perna do camundongo seccionando o fêmur no quadril e a tíbia no tornozelo. Dobre a perna em formato de L e use a tesoura de dissecação para separar cada osso da perna cortando na articulação do joelho.Em seguida, remova suavemente o músculo em direção a uma extremidade do osso da perna até que a cartilagem seja desprendida. A seguir, utilizando uma seringa com agulha de 27 graus e meia polegada, aspire e expulse, em PBS suplementado com 2% de FBS, cada osso da perna sobre uma membrana de náilon de 100 micrômetros para dentro de um tubo cônico de 50 mililitros, até que o osso fique branco, a fim de maximizar o número de células coletadas. Com o êmbolo de uma seringa, pressione as células através da membrana de náilon para dentro do tubo cônico de 50 mililitros para obter uma suspensão de células simples.Repita com a outra pata do camundongo. Centrifugue as células coletadas a 400 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos e descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione cinco mililitros de cloreto de amônio potássico, ou ACK, para re-suspender a medula óssea.Incube a suspensão celular no gelo por 10 minutos para lisar os glóbulos vermelhos. Para interromper a lise, complete o tubo com PBS. Em seguida, centrifugue as células novamente e descarte o sobrenadante.Com cinco mililitros de PBS, re-suspenda as células e, pelo método de exclusão com azul de tripano, utilize um hemocitômetro para contar as células. Em seguida, adicione o coquetel pré-tronco 2x para re-suspender as células a duas vezes 10 à sexta potência de células por mililitro. Então, plaque dois mililitros nos poços de placas de seis poços.Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite. Após a incubação, adicione dois mililitros de sobrenadante viral a cada poço, seguido de oito microgramas por mililitro de polibreno. Centrifugue as placas a 1500 vezes g a 30 graus Celsius por 90 minutos.Em seguida, devolva as placas ao incubador durante a noite. Pipete a suspensão celular para tubos cônicos e centrifugue a 400 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos. Use o coquetel pré-tronco 2x por poço para ressuspender as células e replaque nos poços originais.Após preparar os camundongos receptores para transplante de acordo com o protocolo descrito, colete as células doadoras transduzidas das placas de seis poços pipetando suavemente o sobrenadante para tubos cônicos. Utilize um mililitro de PBS para lavar cada poço e colete as células residuais nos tubos. Adicione 0,5 mililitros de tripsina a 0,05% nos poços e incube a 37 graus Celsius por cinco minutos.Em seguida, adicione um mililitro de D-10 aos poços e desprenda as células remanescentes pipetando suavemente. Depois, adicione as células aos tubos respectivos e centrifugue a 400 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos. Lave as células novamente com PBS.Em seguida, após a centrifugação, utilize cinco mililitros de PBS para ressuspender as células e conte-as utilizando exclusão com azul de tripano e um hemocitômetro. Para injeção em camundongos, ressuspender cinco vezes 10 à quinta, até duas vezes 10 à sexta células em 50 a 100 microlitros de PBS. Posicione o camundongo de lado e imobilize-o usando o polegar e o indicador, de modo que o olho protruda ligeiramente da cabeça.Com o bisel voltado para cima, insira a agulha lateralmente ao canto medial em um ângulo de 45 graus e injete. Após a injeção, examine o camundongo em busca de sinais de lesão, como inchaço ou sangramento, no local da injeção, e consulte o protocolo descrito no texto para os cuidados adicionais pós-injeção. Por fim, analise a expressão de GFP no sangue, de acordo com o protocolo descrito no texto.Esta figura ilustra como calcular o título viral relativo, em que a porcentagem de GFP é calculada a partir dos eventos coletados no gate de células viáveis. Aqui é mostrado um título com mais de uma partícula viral por célula, e essas amostras representam títulos com uma única partícula viral por célula. Idealmente, pelo menos 50% das células GFP-positivas seriam detectadas com uma diluição de um para 30 do sobrenadante viral.Neste experimento, é apresentado um receptor de transplante bem-sucedido no qual camundongos CALRdel52 exibem um fenótipo de MPN com plaquetas aumentadas, megacariócitos aumentados na medula óssea e fibrose da medula óssea. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em oito dias, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante seguir todos os passos do protocolo.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que os pesquisadores explorassem os efeitos de genes específicos na hematopoiese. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir camundongos que expressem seu gene de interesse em células hematopoéticas.

transduction-transplantation-mouse-model-myeloproliferative

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo demonstra a indução da doença intestinal do enxerto contra o hospedeiro, GvHD, em um camundongo receptor letalmente irradiado usando células-tronco hematopoiéticas alogênicas e linfócitos T alorreativos esplênicos indutores de GvHD. Este protocolo ajuda a estabelecer um modelo de GvHD intestinal aguda grave para entender o mecanismo da doença e desenvolver opções terapêuticas inovadoras.

Indução da doença do enxerto contra o hospedeiro em modelos de camundongos via transplante alogênico de medula óssea e células esplênicas

Apresentamos um protocolo rápido e flexível para um único sistema de expressão in vivo baseado em receptor de células T (TCR) retroviral.  Vetores retrovirais são usados para transduzir células progenitoras da medula óssea para estudar o desenvolvimento de células T e a função de um único TCR in vivo como uma alternativa aos camundongos transgênicos TCR.

Transdução retroviral de Células de Medula Óssea progenitoras para gerar células T Receptor Retrogenic Mice

Aqui usamos bioluminescentes, raio-x e positron-emissão calculado a tomografia computadorizada/tomografia computadorizada de imagem para estudar a atividade como a inibição de mTOR impactos tumores de medula óssea-incorporada do mieloma múltiplo em um modelo de transplante. Isto permite análises fisiologicamente relevantes, não-invasivo e multimodais do efeito antimieloma de terapias direcionamento incorporada a medula óssea mieloma tumores na vivo.

Imagem de tomografia computadorizada multimodal bioluminescentes e emissão positrônica Tomography/computacional de mieloma múltiplo Xenografts de medula óssea em camundongos NOG

Nós descrevemos o uso do transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH) para avaliar o potencial maligno das células hematopoiéticas geneticamente modificados. TCTH é útil para avaliar várias células hematopoiéticas malignas na vivo , bem como gerar uma grande coorte de ratos com Síndromes Mielodisplásicas (MDS) ou leucemia para avaliar novas terapias.

Uso de transplante de células-tronco hematopoiéticas para avaliar a origem da síndrome mielodisplásica

A doença enxerto versus hospedeiro é uma grande complicação após o transplante de medula óssea alogênico. As células dendríticas desempenham um papel crítico na patogênese da doença enxerto-versus-hospedeiro. O artigo atual descreve uma nova plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas no desenvolvimento da doença enxerto versus hospedeiro e o efeito enxerto-versus-leucemia.

Plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas na doença enxerto-versus-hospedeiro

Descrevemos o transplante intraparenquimal de células progenitoras neurais transduzidas com um vetor de repórter duplo expressando proteína fluorescente verde-luciferase (GFP) no cérebro do camundongo. Após o transplante, o sinal de luciferase é repetidamente medido usando bioluminescência in vivo e células enxertadas expressas por GFP identificadas em seções cerebrais usando microscopia de fluorescência.

Transplante intracerebral e rastreamento de bioluminescência in vivo de células progenitoras neurais humanas no cérebro do camundongo

Este protocolo descreve o isolamento de timócitos duplo-negativos do timo de camundongo seguido de transdução retroviral e co-cultura no sistema de co-cultura de linhagem celular estromal de medula óssea delta-like 4 (OP9-DL4) para análise funcional adicional.

Co-cultura e transdução de timócitos murinos em células estromais delta-like 4 expressando para estudo de oncogenes em leucemia de células T

Aqui, a injeção intraperitoneal de células leucêmicas é utilizada para estabelecer e propagar a leucemia mieloide aguda (LMA) em camundongos. Este novo método é eficaz no transplante seriado de células da LMA e pode servir como uma alternativa para aqueles que podem experimentar dificuldades e inconsistências com a injeção intravenosa em camundongos.

Transplante Intra-Peritoneal na Geração de Leucemia Mielóide Aguda em Camundongos

O presente protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo murino reprodutível de glioma medular por meio da injeção de células tumorais no espaço intervertebral, oferecendo uma abordagem mais eficaz e menos invasiva para pesquisa e desenvolvimento terapêutico.

Transplante cirúrgico de células tumorais na medula espinhal de camundongos

O protocolo tem como objetivo descrever um modelo de camundongo para gerar recidivas de leucemia linfoblástica aguda, com base na dinâmica da resposta à quimioterapia de indução.

Modelo Murino de Leucemia Recaída para Quimioterapia de Indução para Leucemia Linfoblástica Aguda

Aprenda o método de transdução-transplante para gerar modelos murinos expressando genes específicos em células hematopoiéticas. Esta técnica permite estudar neoplasias hematológicas e hematopoiese normal em pouco tempo.

Transdução-Transplante Rato Modelo de neoplasia mieloproliferativa

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