Induzindo completa Polyp Regeneração do aboral Physa da Anémona Starlet Vectensis Nematostella

O objetivo geral deste procedimento é ilustrar a série previsível de mudanças morfológicas que ocorreram durante a regeneração de um pólipo completo a partir de uma pequena seção de tecido removida da ponta aboral da nematostella vectensis Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia da regeneração, como a forma como as células no local de uma ferida se reorganizam e se desdobram para refazer as estruturas ausentes. Tive a ideia desse método porque queria ver como pólipos relativamente complexos poderiam se recompor, começando com a menor quantidade de informações morfológicas. A demonstração visual desse método é crítica porque a progressão do estágio após a ferida inicial às vezes é obscurecida por uma membrana mucosa.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldade em obter uma separação completa do tecido no local da ferida, devido à natureza macia, pegajosa e gelatinosa do pólipo. Comece este procedimento com o condicionamento de nematostella vectensis conforme descrito no protocolo de texto. É especialmente importante ao usar essa técnica que os animais selecionados sejam do mesmo tamanho e tenham o mesmo histórico de cultura, como alimentação idêntica e outros parâmetros de condição.

Remova o prato de animais selecionados da incubadora para a luz ambiente pelo menos uma hora antes da amputação. Use uma pipeta de plástico de calibre largo para transferir os cinco animais da piscina a serem amputados para o fundo de uma travessa de corte de vidro estéril de 100 milímetros de diâmetro contendo água do mar artificial a uma salinidade de 12 partes por mil. Coloque o prato no palco de um microscópio estéreo com ampliação variável entre 10 a 40x.

Selecione pólipos de tamanho igual de aproximadamente o mesmo comprimento e coloque-os em uma tigela separada da colônia por três dias antes da amputação. Usando um bisturi estéril, ampute a fisa aboral de cada pólipo para obter uma seção da fisa que seja aproximadamente tão longa quanto larga e sem mesentério. Para conseguir isso, coloque a lâmina do bisturi em contato com o animal no local desejado da amputação.

Faça isso sem ajuda ou segurando suavemente o corpo do animal com uma pinça número cinco. Corte o tecido alavancando a lâmina curva do bisturi em um movimento de balanço pelo corpo. Remova cada pólipo de doador amputado do prato e coloque-o de volta em uma tigela separada rotulada como amputados agrupados.

Depois de datar a tigela, devolva-a à cultura de estoque. Lavar a physa excisada que permanece na cápsula de corte em água do mar artificial a uma salinidade de 12 partes por 1 000. Em seguida, transfira cada physa para um poço estéril separado em uma placa de cultura de células de vários poços que tenha 10 mililitros de água do mar artificial a uma salinidade de 12 partes por 1.000 em cada poço.

Repita essas etapas para coletar pelo menos cinco physa em cada poço a ser reservado para cada tratamento experimental. Coloque a placa contendo o physa em uma incubadora com temperatura regulada a uma temperatura fixa determinada pela taxa de regeneração desejada. Marque o physa usando um microscópio composto estéreo com ampliação variável.

Marque o nematostella physa recém-cortado como estágio zero e continue marcando no mesmo horário todos os dias após a amputação, ou DPA, usando o NRSS. Marque o physa como estágio zero se um physa recém-cortado aparecer como uma massa em forma de taça semelhante a um balão flácido com um local de ferida aberto que provavelmente é visível. Marque um physa como estágio um se a ferida de amputação parecer fechada.

Marque um physa como estágio dois se a superfície do pólo auditivo parecer inflada, revelando oito arcos elevados dispostos em um padrão radialmente simétrico e separados por sulcos. No estágio dois, observe pequenas bolhas hemisféricas no ápice dos arcos que são quase tão altas quanto largas, provavelmente transitórias e iniciais compostas por uma única camada de células ectodérmicas. À medida que a physa envelhece, ela pode ficar envolta em muco, que deve ser cuidadosamente removido com uma pinça.

Marque uma physa como estágio três se os botões dos tentáculos contendo camadas de tecido endodérmico e ectodérmico forem formados de forma estável na extremidade aural de pelo menos alguns arcos radiais. Pontue um physa como estágio quatro se o physa contiver oito mesentérios visíveis distintos que se estendem em um celandero a partir de inserções na parede do corpo com comprimentos aborais aurais que são mais do que o dobro de sua largura radial medida de onde eles parecem se conectar à faringe em sua extremidade aboral, ou enterrostomi. Finalmente, marque um physa como estágio cinco se o physa tiver mais de quatro mesentérios com pregas, e o plissamento for mais completo e sinuoso do que no estágio quatro.

No estágio cinco, o animal tem uma aparência adulta quase normal, mas não há células gonadais visíveis. Este grupo de nematostella physa de controle tratado com 0,1 por cento de DMSO se regenerou completamente até o estágio cinco. Physa tratada com cloroquina, no entanto, não conseguiu formar mesentérios completos.

Um close-up mostra a presença e a falta de pregas nos mesentérios em uma physa que foi incubada em cloroquina. Este gráfico ilustra os resultados agregados do tratamento com cloroquina. Qualquer tratamento entre 10 e 50 micromolares causou defeitos semelhantes, principalmente a falta de reforma completa dos mesentérios, pois os mesentérios carecem de plissados.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de uma hora para cada placa de seis poços contendo 30 physa cortadas. A pontuação é rápida, talvez exigindo meia hora para cada placa replicada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como amputar a fisa para visualizar as mudanças morfológicas que ocorrem durante a regeneração de um pólipo completo de uma pequena seção de tecido aboral.

A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece estágios morfológicos para identificar os eventos moleculares subjacentes à regeneração de um pólipo completo a partir de um copo de tecido visualmente uniforme. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de pré-condicionar os animais em relação à história nutricional, bissetriz para excluir o mesentério adulto e padronizar o tamanho da physa em regeneração para reduzir a variação dentro dos tratamentos. Após esse procedimento, os efeitos de mutações genéticas ou perturbações da via de sinalização com pequenas moléculas, por exemplo, podem ser avaliados.

Ou as alterações morfogenéticas podem ser correlacionadas com a análise microscópica da autoproliferação, rastreamento da linhagem ou expressão gênica do local dois. Essa técnica abrirá caminho para pesquisadores no campo da biologia da regeneração explorarem a biologia celular, as vias de sinalização e os processos morfogenéticos subjacentes à notável capacidade regenerativa desse organismo modelo.