Medindo a rigidez Ex Vivo Mouse aortas Usando Microscopia de Força Atômica

O objetivo geral deste protocolo é descrever os procedimentos para o uso da Microscopia de Força Atômica para medir o módulo elástico Ex Vivo de aortas de camundongos. Este método ajuda a responder a questões-chave no campo da biomecânica vascular e da doença, como doenças cardiovasculares e envelhecimento. A principal vantagem desta técnica é o AFM caracterizado propriedades biomecânicas de amostras biológicas moles, como artérias e células, com um grande grau de precisão em níveis de Danoscale.

Apresentarei os procedimentos de AFM, e o Dr. Shu-lin Liu, pesquisador associado de nosso laboratório, mostrará como isolar aortas de camundongos. Para começar, eutanasiar um camundongo e dissecá-lo até a aorta, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Usando uma pinça pequena, segure a gordura ao redor da aorta e use uma pequena tesoura para cortar cuidadosamente a gordura que está ao redor da aorta.

Em seguida, segure suavemente a aorta com uma pinça e faça um corte no vaso no início da aorta ascendente e outro corte no final da aorta descendente, logo acima da aorta abdominal. Transfira a aorta dissecada para uma placa de 60 milímetros contendo PBS sem cálcio ou magnésio. No prato, continue a dissecar qualquer tecido adiposo remanescente da aorta e, em seguida, abra a aorta longitudinalmente.

Em seguida, corte um pedaço de 2 milímetros por 4 milímetros da aorta descendente e um pedaço do mesmo tamanho do arco aórtico, para análise usando o Microscópio de Força Atômica. Coloque esses pedaços de tecido em um prato de plástico fresco de 60 milímetros e mantenha-os úmidos em uma gota de PBS. Remova cuidadosamente o PBS ao redor do tecido usando um lenço de laboratório sem tocar na aorta.

Certifique-se de que o lado luminal do tecido esteja voltado para cima e use de cinco a 10 microlitros de adesivo de cianoacrilato para colar suavemente cada extremidade da aorta aberta à placa. É fundamental que a aorta não seja esticada durante esse processo. Quando terminar, verifique se a aorta colada não está dobrada ou flutuando.

Depois de secar a cola ao ar na aorta por 30 a 60 segundos, adicione suavemente PBS e mergulhe a amostra. Usando uma pinça, deslize uma sonda AFM de nitrato de silicone com uma ponta esférica no suporte da sonda. Em seguida, prenda firmemente o suporte da sonda ao suporte ZScanner do cabeçote do AFM.

Em seguida, abra o software AFM. Escolha o tipo de experimento acessando a Categoria do experimento e selecionando Modo de contato. Em seguida, vá para Grupo de experimentos e selecione Modo de contato no Fluid e, finalmente, vá para Experiment e selecione Modo de contato no Fluid.

Depois de selecionados, clique em Carregar experimento. Isso ligará o laser. Em seguida, prepare uma amostra usada para alinhar o laser conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.

Coloque a amostra no AFM. Posicione o ponto do laser na ponta da ponta de prova do AFM, ajustando os botões de posicionamento do laser. Em seguida, use os botões de posicionamento do detector para ajustar a posição do fotodiodo até que os valores da deflexão vertical estejam entre zero e menos um volts, e a deflexão horizontal esteja próxima de zero volts.

Em seguida, verifique se o sinal de soma do laser está maximizado. Se necessário, reajuste a posição do feixe de laser na ponta do AFM e a posição do fotodiodo, para obter o sinal de soma máxima. Para iniciar a calibração, selecione verificar parâmetros e defina o parâmetro para Tamanho da digitalização como zero.

Defina a Taxa de varredura para um hertz. Defina a amostra/linha para 256 e o ponto de ajuste de deflexão para 20 nanômetros. Em seguida, selecione Envolver.

Assim que a sonda entrar em contato com a superfície da placa, clique em Rampa. Em seguida, selecione o modo expandido no menu da barra de ferramentas de varredura e defina os parâmetros conforme mostrado aqui. Na barra de ferramentas de rampa, selecione continuus de rampa e obtenha uma curva de força na placa.

Nesta curva de força, defina o Canal 1 como Erro de Deflexão para permitir que o software represente graficamente os resultados como deflexão vertical versus posição Z. Clique nas extremidades esquerda ou direita da curva de força e arraste o cursor para abranger uma região linear da curva de força que será ajustada à linha reta. Em seguida, selecione Ramp na barra de ferramentas e clique em Update Sensitivity.

Registre o valor atual. Em seguida, selecione Calibrar e clique em Detector. Entrada e valor médio das cinco medições na caixa Sensibilidade à deflexão.

Clique sobre Retirar duas a três vezes, para levantar a cabeça do AFM e evitar a interação entre a ponta do AFM e a placa durante o processo de ajuste térmico. Em seguida, clique em Thermal Tune na barra de ferramentas. Defina a faixa de ajuste térmico entre um e 100 kilohertz e defina a correção de sensibilidade de deflexão para 1.144 para cantiléver em forma de V e 1.166 para cantiléver retangular.

No menu Thermal Tune, clique em Acquire Data para obter uma curva de ajuste térmico. Em seguida, coloque um traço vermelho nas linhas em ambos os lados da curva e selecione o modelo do oscilador harmônico Lorentziano ou simples, dependendo do que melhor se encaixa nos dados. Em seguida, clique em Ajustar dados e selecione Calcular mola K para salvar esse valor.

Coloque uma placa de cultura de 60 milímetros contendo o tecido aórtico no microscópio stage e prenda a placa com o suporte da placa magnética. Uma vez que a aorta esteja engatada com o cantilever, certifique-se de que o centro piezoelétrico esteja estável e clique em Rampa. Defina o tamanho da rampa para três micrômetros, o modo de disparo para Relativo e o limite de disparo para 100 nanômetros.

Em seguida, selecione rampa contínua. Observe que o ponto de contato entre a sonda e a amostra ocorre aproximadamente no centro para os três quartos inferiores do ciclo da rampa Z. Se isso não for observado, desengate da amostra, ajuste o tamanho da rampa conforme necessário e reative a amostra.

Em seguida, clique em Microscópio na barra de menus e selecione Configurações de ativação. Altere a retirada do SPM para 30 micrômetros e clique em OK. Depois de observar a curva de força, clique em Capturar na barra de menus e selecione Capturar nome do arquivo. Insira um nome de arquivo desejado que termine com OOO, selecione uma pasta designada e salve os dados.

Para iniciar a análise, abra o software de análise de curva de força, carregue o arquivo a ser analisado e modifique e suavize os dados conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, selecione Correção de linha de base na barra de menus e defina as entradas conforme mostrado aqui. Em seguida, ajuste a linha azul pontilhada vertical no gráfico para abranger a parte plana da curva de força e clique em Executar.

Em seguida, clique em Recuo no menu da barra de ferramentas e defina as entradas conforme mostrado aqui. Salve esses valores e analise o módulo de Young de cada uma das áreas de interesse medindo cinco curvas de força por área que são tomadas a uma pequena distância uma da outra. Para determinar a rigidez geral da amostra de tecido, até 25 medições devem ser feitas em cinco regiões diferentes da área da amostra dentro do tecido.

Essas áreas podem ser usadas para comparar tecidos em diferentes locais, como o arco aórtico e a aorta descendente. Nesses gráficos, curvas de força representativas da aorta descendente e do arco aórtico são mostradas a partir da mesma amostra de aorta de camundongo. Com base nesses dados, o módulo de elasticidade pode ser calculado para cada grupo e usado para comparar entre diferentes regiões ou condições.

Depois de assistir a este vídeo, você terá uma boa compreensão de como isolar adequadamente a aorta do camundongo e medir o módulo de elasticidade por Microscopia de Força Atômica. Após ter tentado este procedimento é importante recordar realizar a medida do AFM imediatamente após o isolamento do tecido. Uma vez dominado, o isolamento das aortas pode ser terminado em aproximadamente 45 minutos pelo rato, e a medida e a análise do AFM podem ser terminadas em uma hora e meia, se é executada corretamente.

Após este procedimento, outros métodos, como ensaios de imunofluorescência ou proliferação, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais relacionadas à remodelação vascular ou proliferação de células musculares lisas vasculares.