Name: Medindo a rigidez Ex Vivo Mouse aortas Usando Microscopia de Força Atômica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Aprenda a medir o módulo elástico ex vivo de aortas de camundongos usando microscopia de força atômica. Este método permite caracterizar propriedades biomecânicas vasculares com precisão nanométrica para pesquisa cardiovascular.

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A análise AFM foi realizada em instrumentação apoiada pelo Instituto Muscular da Pensilvânia e pelo Instituto de Medicina Translacional e Terapêutica, Escola de Medicina Perelman, Universidade da Pensilvânia. Este trabalho foi apoiado por bolsas do NIH HL62250 e AG047373. YHB foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da American Heart Association.

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<li>Steppan, J., Barodka, V., Berkowitz, D. E., Nyhan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Stiffness+and+Increased+Pulse+Pressure+in+the+Aging+Cardiovascular+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Vascular Stiffness and Increased Pulse Pressure in the Aging Cardiovascular System.</a> Cardiol Res Pract. 2011, 263585(2011).</li>
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<li>Hsu, B. Y., Bae, Y. H., Mui, K. L., Liu, S. -L., Assoian, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+E3+Inhibits+Rho+to+Regulate+the+Mechanosensitive+Expression+of+Cox2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein E3 Inhibits Rho to Regulate the Mechanosensitive Expression of Cox2.</a> PLoS ONE. 10, e0128974(2015).</li>
<li>Johnson, K. L., Kendall, K., Roberts, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Energy+and+the+Contact+of+Elastic+Solids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+A%22%5BJournal%5D)">Surface Energy and the Contact of Elastic Solids.</a> Proc R Soc Lond A. 324, 301-313 (1971).</li>
<li>Derjaguin, B. V., Muller, V. M., Toporov, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+contact+deformations+on+the+adhesion+of+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of contact deformations on the adhesion of particles.</a> J Colloid Interface Sci. 53, 314-326 (1975).</li>
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<li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+surface+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch+EJP%22%5BJournal%5D)">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Arch EJP. 440, 653-666 (2000).</li>
<li>Pogoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depth-sensing+analysis+of+cytoskeleton+organization+based+on+AFM+data%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Depth-sensing analysis of cytoskeleton organization based on AFM data.</a> Eur Biophys J. 41, 79-87 (2012).</li>
<li>Mendez, M. G., Restle, D., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+Enhances+Cell+Elastic+Behavior+and+Protects+against+Compressive+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Vimentin Enhances Cell Elastic Behavior and Protects against Compressive Stress.</a> Biophys J. 107, 314-323 (2014).</li>
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<li>Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+human+mesenchymally-derived+stem+cells+and+primary+osteoblasts%2C+chondrocytes%2C+and+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes.</a> J Biomech. 41, 454-464 (2008).</li>
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<li>Laurent, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expert+consensus+document+on+arterial+stiffness%3A+methodological+issues+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications.</a> Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).</li>
<li>Plodinec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nanomechanical+signature+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">The nanomechanical signature of breast cancer.</a> Nat Nano. 7, 757-765 (2012).</li>
<li>Raman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+nanomechanical+properties+of+live+cells+using+multi-harmonic+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy.</a> Nat Nano. 6, 809-814 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

AFM recuo pode ser utilizado para caracterizar a rigidez (módulo de elasticidade) de células e tecidos. Neste artigo, nós fornecemos protocolos detalhados passo-a-passo para isolar a aorta descendente e arco aórtico em ratos e determinar o módulo de elasticidade dessas regiões arteriais ex vivo. Vamos agora resumir e discutir as questões técnicas e limitações do método descrito neste artigo. Várias questões técnicas podem surgir no isolamento e análise de aortas de rato dado o seu p...

As propriedades biomecânicas das artérias são um determinante crítico nas doenças cardiovasculares (DCV) e no envelhecimento. A rigidez arterial, um importante fator de risco independente do colesterol e um indicador da progressão da DCV, aumenta com lesão vascular, aterosclerose, idade e diabetes1-8. O enrijecimento da parede arterial está associado ao aumento da desdiferenciação, migração e proliferação de células musculares lisas vasculares9-12. Além disso, o aumento da rigidez arterial tem sido associado ao aumento da adesão dos macrófagos1, permeabilidade endotelial e transmigração de leucócitos13 e remodelação da parede dos vasos14,15. Assim, terapias que podem prevenir o enrijecimento arterial na DCV ou no envelhecimento podem complementar as intervenções farmacológicas atualmente disponíveis que tratam a DCV reduzindo o colesterol alto no sangue. 
AFM é uma poderosa ferramenta analítica usada para várias aplicações físicas e biológicas. O AFM é usado cada vez mais para obter as imagens de alta resolução e caracterizar as propriedades biomecânicas de amostras biológicas macias tais como tecidos e pilhas1,2,10,16,17 com um grande grau da precisão em níveis do nanoscale. Uma grande vantagem do AFM é o fato de que ele pode ser usado com células vivas.
Este artigo descreve nosso método para medir o módulo elástico das artérias de camundongos ex vivo usando AFM. O método descrito mostra como nós 1) isolamos adequadamente as artérias do camundongo (aorta descendente e arco aórtico) e 2) medimos o módulo de elasticidade desses tecidos por AFM. Medidas de módulos elásticos descarregados nas artérias podem ajudar a elucidar alterações na matriz extracelular (MEC) que ocorrem em resposta a lesão vascular, DCV e envelhecimento.

<table><tbody><tr><td>BioScope Catalyst AFM sistema</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE 200 microscópio invertido</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitreto de silício AFM sonda</td><td>Novascan Technologies</td><td>PT. SI02. SN.1</td><td>0,06 N/m em balanço; 1 &micro; m SiO2 partícula</td></tr><tr><td>Dumont #5 fórceps</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11251-10</td><td>Ver seção 1.4</td></tr><tr><td>Fórceps de #5SF Dumont</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11252-00</td><td>Ver seção 1.8</td></tr><tr><td>Tesouras Finas-ToughCut</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>14058-11</td><td>Ver seção 1.4 (tamanho médio)</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; tesoura de mola bingen</td><td>Fine Science Tools</td><td>15008-08</td><td>Consulte a seção 1.6 (tamanho pequeno)</td></tr> <tr><td>Placa de cultura de células tratada com TC de 60 mm</td><td>Corning</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td>Sem cálcio e magnésio</td></tr><tr><td>Krazy Glue líquido instantâneo para todos os fins</td><td>KG58548R</td><td>Glue Consulte a seção 2.2</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de carregamento de gel, 1 - 200 &micro; l</td><td>Fisher</td><td>02-707-139</td><td>Consulte a seção 2.2</td></tr><tr><td>Pinças de ponta</td><td>Microscopia eletrônica Sciences</td><td>78092-CP</td><td>Consulte a seção 3.2</td></tr><tr><td>Pratos com fundo de vidro de parede transparente de 50 mm</td><td>TED PELLA</td><td>14027-20</td><td>Consulte a seção 4.4</td></tr></tbody></table>

medindo a rigidez<em&gt; ex vivo</em&gt; mouse aortas usando microscopia de força atômica

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

enrijecimento arterial é um fator de risco significativo e biomarcador para a doença cardiovascular e uma característica do envelhecimento. Microscopia de força atómica (AFM), é uma ferramenta analítica versátil para a caracterização de propriedades mecânicas viscoelásticas para uma variedade de materiais que vão desde a dura (de plástico, vidro, metal, etc.) superfícies de células em qualquer substrato. Tem sido largamente utilizado para medir a rigidez das células, mas menos frequentemente utilizados para medir a rigidez das aortas. Neste artigo, vamos descrever os procedimentos para a utilização AFM no modo de contato para medir o módulo de elasticidade ex vivo das artérias descarregados do mouse. Nós descrevemos o nosso procedimento para isolamento de aortas do rato e, em seguida, forneça informações detalhadas para a análise AFM. Isso inclui instruções passo-a-passo para o alinhamento do feixe de laser, a calibração da constante da mola e sensibilidade deflexão da sonda de AFM, e aquisição de curvas força. Nós também fornecemos um protocolo detalhado para Analy dadossis das curvas de força.

<html> A Figura 5A mostra uma imagem de contraste de fase da aorta descendente (torácica) a partir de um 6-meses de idade C57BL / 6 de rato, do sexo masculino. O cantilever AFM está no local diretamente acima do tecido e pronto para recuo. Figuras 5B e 5C mostram curvas força representativos obtidos por AFM recuo no modo de contato. Linhas verdes mostradas nas Figuras 5B e 5C representam os melhores curvas de ajuste obtidos usando o mode...

Apresentamos protocolos detalhados para isolamento de aortas de camundongos e medição de seu módulo de elasticidade usando microscopia de força atômica.

Medindo a rigidez<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aortas Usando Microscopia de Força Atômica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

O objetivo geral deste protocolo é descrever os procedimentos para utilizar a Microscopia de Força Atômica na medição do módulo elástico ex vivo de aortas de camundongo. Este método ajuda a responder perguntas fundamentais na área de biomecânica e doenças vasculares, como doenças cardiovasculares e envelhecimento. A principal vantagem desta técnica é a capacidade da AFM de caracterizar propriedades biomecânicas de amostras biológicas moles, como artérias e células, com alto grau de precisão em níveis nanométricos.Apresentarei os procedimentos de AFM, e o Doutor Shu-lin Liu, pesquisador associado do nosso laboratório, mostrará como isolar aortas de camundongo. Para começar, eutanazie um camundongo e realize a dissecação até a aorta conforme descrito no protocolo de texto complementar. Usando um par de pinças pequenas, segure a gordura ao redor da aorta e utilize um pequeno par de tesouras para cortar cuidadosamente a gordura que envolve a aorta.Em seguida, segure suavemente a aorta com pin&ccedil;as e fa&ccedil;a um corte no vaso no in&iacute;cio da aorta ascendente e outro corte no final da aorta descendente, logo acima da aorta abdominal. Transfira a aorta dissecada para uma placa de 60 mil&iacute;metros contendo PBS sem c&aacute;lcio ou magn&eacute;sio. Na placa, continue a dissecar qualquer tecido adiposo remanescente da aorta e, em seguida, abra a aorta longitudinalmente.Em seguida, corte um pedaço de 2 milímetros por 4 milímetros da aorta descendente e um pedaço do mesmo tamanho do arco aórtico, para análise utilizando o microscópio de força atômica. Coloque esses pedaços de tecido em uma nova placa plástica de 60 milímetros e mantenha-os úmidos em uma gota de PBS. Remova cuidadosamente o PBS ao redor do tecido usando uma toalha de laboratório, sem tocar a aorta.Certifique-se de que o lado luminal do tecido esteja voltado para cima e utilize de cinco a 10 microlitros de adesivo de cianoacrilato para colar suavemente cada extremidade da aorta aberta à placa. É fundamental que a aorta não seja esticada durante esse processo. Ao finalizar, verifique se a aorta colada não está dobrada ou flutuando.Após secar ao ar a cola na aorta por 30 a 60 segundos, adicione cuidadosamente PBS e submerja a amostra. Usando pinças, deslize uma ponta de nitrocelulose silicone para AFM com ponta esférica no suporte da ponta. Em seguida, fixe firmemente o suporte da ponta ao montante ZScanner da cabeça do AFM.Em seguida, abra o software do AFM. Escolha o tipo de experimento acessando a Categoria do Experimento e selecionando Modo de Contato. Depois, vá para Grupo do Experimento e selecione Modo de Contato em Fluido, e finalmente acesse Experimento e selecione Modo de Contato em Fluido.Após a seleção desses itens, clique em Carregar Experimento. Isso ativará o laser. Em seguida, prepare uma amostra utilizada para alinhar o laser, conforme descrito no protocolo de texto complementar.Coloque a amostra no MFA. Posicione o ponto do laser na ponta da sonda do MFA ajustando os botões de posicionamento do laser. Em seguida, use os botões de posicionamento do detector para ajustar a posição do fotodiodo até que os valores de Desvio Vertical estejam entre zero e um volt negativo, e o Desvio Horizontal esteja próximo de zero volt.Em seguida, verifique se o Sinal Soma do laser está maximizado. Se necessário, reajuste a posição do feixe de laser na ponta do MFA e a posição do fotodiodo para obter o sinal soma máximo. Para iniciar a calibração, selecione verificar parâmetros e defina o parâmetro de Tamanho de Varredura para zero.Defina a taxa de varredura como um hertz. Defina a amostra/linha como 256 e o ponto de deflexão como 20 nanômetros. Em seguida, selecione Engajar.Uma vez que a sonda entre em contato com a superfície da placa, clique em Ramp. Em seguida, selecione o modo expandido no menu da barra de ferramentas de varredura e defina os parâmetros conforme mostrado aqui. Na barra de ferramentas de rampa, selecione rampa contínua e obtenha uma curva de força na placa.Nesta curva de força, configure o Canal 1 como Erro de Deflexão para permitir que o software represente os resultados como deflexão vertical versus posição Z. Clique nas extremidades esquerda ou direita da curva de força e arraste o cursor para abranger uma região linear da curva de força que será ajustada com uma linha reta. Em seguida, selecione Rampa na barra de ferramentas e clique em Atualizar Sensibilidade.Registre o valor da corrente. Em seguida, selecione Calibrar e clique em Detector. Insira e calcule o valor médio das cinco medições no campo Sensibilidade de Deflexão.Clique em Recuar duas ou três vezes para elevar a cabeça do MFA e evitar a interação entre a ponta do MFA e a placa durante o processo de calibração térmica. Em seguida, clique em Calibração Térmica na barra de ferramentas. Defina a faixa de calibração térmica entre um e 100 quilohertz e configure a correção de sensibilidade de deflexão para 1,144 para cantiléveres em forma de V e 1,166 para cantiléveres retangulares.No menu Ajuste Térmico, clique em Adquirir Dados para obter uma curva de ajuste térmico. Em seguida, posicione traços vermelhos em ambos os lados da curva e selecione o modelo Lorentziano ou o modelo do oscilador harmônico simples, dependendo de qual se ajusta melhor aos dados. Depois, clique em Ajustar Dados e selecione Calcular K da Mola para salvar este valor.Coloque uma placa de cultura de 60 milímetros contendo o tecido aórtico sobre a platina do microscópio e fixe a placa com o suporte magnético. Uma vez que a aorta esteja engatada ao cantiléver, certifique-se de que o centro do piezo esteja estável e clique em Rampa. Ajuste o tamanho da Rampa para três micrômetros, o modo de Gatilho para Relativo e o limiar de Gatilho para 100 nanômetros.Em seguida, selecione rampa contínua. Observe que o ponto de contato entre a sonda e a amostra ocorre aproximadamente no centro até os três quartos inferiores do ciclo de rampa em Z. Se isso não for observado, desengate da amostra, ajuste o tamanho da rampa conforme necessário e reengate a amostra.Em seguida, clique em Microscópio na barra de menu e selecione Configurações de Ativação. Altere a retirada do SPM para 30 micrômetros, então clique em OK. Após observar a curva de força, clique em Capturar na barra de menu e selecione Nome do Arquivo de Captura. Insira um nome de arquivo desejado terminando com OOO, selecione uma pasta designada e salve os dados.Para iniciar a análise, abra o software de análise de curva de força, carregue o arquivo que será analisado e modifique e suavize os dados conforme descrito no protocolo de texto complementar. Em seguida, selecione Correção de Linha de Base na barra de menu e defina as entradas conforme mostrado aqui. Depois, ajuste a linha pontilhada azul vertical no gráfico para abranger a porção plana da curva de força e clique em Executar.Em seguida, clique em Recuo no menu da barra de ferramentas e defina as entradas conforme mostrado aqui. Salve esses valores e analise o módulo de Young de cada uma das áreas de interesse medindo cinco curvas de força por área, obtidas a uma pequena distância umas das outras. Para determinar a rigidez geral da amostra de tecido, devem ser realizadas até 25 medições em cinco regiões diferentes da área da amostra dentro do tecido.Essas áreas podem ser usadas para comparar tecidos em diferentes locais, como o arco aórtico e a aorta descendente. Nestes gráficos, são apresentadas curvas de força representativas da aorta descendente e do arco aórtico provenientes da mesma amostra de aorta de camundongo. Com base nesses dados, o módulo de elasticidade pode ser calculado para cada grupo e utilizado para comparação entre diferentes regiões ou condições.Após assistir a este vídeo, você terá uma boa compreensão de como isolar corretamente a aorta de camundongo e medir o módulo de elasticidade por Microscopia de Força Atômica. Após tentar este procedimento, é importante lembrar de realizar a medição por AFM imediatamente após o isolamento do tecido. Uma vez dominado, o isolamento das aortas pode ser concluído em aproximadamente 45 minutos por camundongo, e a medição e análise por AFM podem ser realizadas em uma hora e meia, se realizadas corretamente.Após este procedimento, outros métodos como imunofluorescência ou ensaios de proliferação podem ser realizados para responder perguntas adicionais relacionadas à remodelação vascular ou à proliferação de células musculares lisas vasculares.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A rigidez da matriz extracelular influencia fortemente os comportamentos múltiplo de células aderentes. Rigidez da matriz varia espacialmente ao longo de um tecido, e sofre modificação nas condições de várias doenças. Aqui nós desenvolvemos métodos para caracterizar as variações espaciais na rigidez do tecido normal e pulmão fibrótico do mouse usando microindentation microscopia de força atômica.

Micro-Mecânica Caracterização do tecido pulmonar Usando Microscopia de Força Atômica

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Descrevemos uma técnica para medir a rigidez aórtica a partir de sua relação pressão-diâmetro in vivo em camundongos. O diâmetro da aorta é registrado por ultrassom e a pressão aórtica é medida de forma invasiva com um cateter de pressão de estado sólido. A pressão arterial é alterada de forma incremental e o diâmetro resultante é medido.

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Aplicação de microscopia de força atômica para detectar osteoartrite precoce

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Recentemente, identificamos o enrijecimento capilar da retina como um novo paradigma para a disfunção retiniana associada ao diabetes. Este protocolo elabora as etapas para o isolamento dos capilares retinianos de camundongos e da matriz subendotelial das culturas endoteliais da retina, seguidas de uma descrição da técnica de medição da rigidez usando microscopia de força atômica.

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In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

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