Name: Um ensaio baseado em fluorescência de Fosfolípido scramblase Atividade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Aprenda a medir a atividade de scramblase de fosfolípideos usando um ensaio baseado em fluorescência com lipossomas contendo opsina. Este método robusto permite estudar o transporte lipídico intercelular e identificar proteínas envolvidas no processo.

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Este estudo foi apoiado pela Velux Stiftung (AKM), NIH grant EY024207 (AKM) e pelo projeto J3686 (BP) do Austrian Science Fund (FWF).

1. Preparação dos lipossomas e proteolipossomas <ol><li> Formação de lipossomas <ol><li> Usando uma seringa de vidro, adiciona 1435 ul POPC (25 mg / ml, em clorofórmio) e 160 ul POPG (25 mg / ml, em clorofórmio) para um balão de fundo redondo para se obter 52,5 umol lípidos numa razão molar de POPC: POPG = 9: 1. </li><li> Secam-se os lípidos para 30 min, utilizando um evaporador rotativo a uma velocidade de rotação de 145 rpm (sem banho de água é necessária para este volume de solvente), e depois transferir o frasco para um secador de vácuo durante pelo menos três horas, ou durante a noite, à temperatura ambiente (RT). </li><li> Hidratar a película de lípido seca com 10 ml de HEPES 50 mM pH 7,4, NaCl 100 mM (daqui em diante referido como tampão A) agitando suavemente o balão até uma homogéneos, resultados suspensão turva; NOTA: A concentração de lípido nesta fase deve ser de 5,25 mM como não há perdas deve ter ocorrido até agora. </li><li> Sonicar a suspensão num banho de água durante 10 min à temperatura ambiente com uma frequência óF 40 kHz. A solução vai olhar um pouco mais clara. </li><li> Usando um extrusor, passar a suspensão a 10 vezes através de uma membrana com um tamanho de poro de 400 nm, seguido de um segundo ciclo de extrusão com 4 passagens através de uma membrana com um tamanho de poro de 200 nm. NOTA: O diâmetro médio dos LUV resultantes é de ~ 175 nm. Se necessário, o tamanho e homogeneidade dos LUV podem ser verificados por dispersão de luz dinâmica de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Quantificar a concentração de fosfolípidos da suspensão LUV como descrito na secção 1.2). NOTA: Devido às perdas durante a extrusão, a concentração é geralmente cerca de 3,6 mM. </li><li> Armazenar os LUV a 4 ° C durante cerca de 2 semanas se não for usado imediatamente. </li></ol></li><li> Quantificação Phospholipid NOTA: Para determinar a concentração de fosfolípidos da suspensão LUV utilizada para a reconstituição, bem como a dos proteolipossomas que, eventualmente, são gerados, uma alíquota da amostra é subjected à oxidação pelo ácido perclórico. Este procedimento decompõe fosfolípidos para libertar fosfato inorgânico que é em seguida quantificado por um ensaio colorimétrico, em comparação com os padrões de 23. <ol><li> Prepara-se uma solução estoque de 40 mM de fosfato de sódio (Na 2 HPO 4) em água desionizada destilada. </li><li> Diluir a solução estoque com água destilada deionizada para obter 4 mM e 0,4 mM soluções que servirão como padrões de calibração de trabalho. </li><li> Usando as soluções de trabalho, preparar padrões em tubos de 13 x 100 mm 2 de vidro que vão de 0 a 80 nmoles de fosfato de sódio, num volume final de 50 ul. </li><li> Tomar 10 ul de cada uma das amostras e LUV proteolipossoma a serem quantificados e dilui-se com 40 jil de ddH2O em 13 tubos x 100 mm 2 de vidro. NOTA: Como a concentração de lípidos das LUV e proteolipossomas está na gama de 2,5-5 | iM, os 10 ul da amostra deve conter 25-50 nmol de lípido de fósforo.</li><li> Adiciona-se ácido perclórico a 300 ul a cada um dos padrões e amostras e calor durante 1 hora a 145 ° C num bloco de aquecimento. Colocar os tubos em berlindes para prevenir a evaporação. </li><li> Deixe os tubos arrefecer até à temperatura ambiente e adiciona-se 1 ml de ddH 2 O. </li><li> Adicionar 400 ul de cada recém-preparada de 12 g de molibdato de L / de amónio e 50 g / l de ascorbato de sódio e agitar com vortex para misturar. </li><li> Aquecer durante 10 min a 100 ° C com berlindes no topo dos tubos. Retire os tubos do bloco de aquecimento e deixou-se arrefecer até à temperatura ambiente. </li><li> Medir a absorção das amostras contra a (amostra padrão contendo fosfato de sódio 0 nmol) em branco com um espectrómetro, num comprimento de onda de 797 nm. </li><li> Determinar o teor de fosfato de amostras em relação à curva padrão de calibração. </li></ol></li><li> Reconstituição de Opsina NOTA: É necessário determinar as condições óptimas para a reconstituição de inchamento uma vez que estes dependem da natureza do detergente, bemcomo a composição de lípido e concentração das LUV. Como LUV alterar as suas propriedades de dispersão de luz no inchaço do processo pode ser monitorizada por medição da absorvência (Figura 2) como revisto por Rigaud e Levy 24 e Geertsma et ai. 25. <ol><li> Pipetar 800 l de LUV (a partir da Secção 1.1, tal como a recuperação de lípido após a extrusão é de 70%, a concentração esperada de LUV é fosfolípido 3,6 mM) num tubo de microcentrifugação de 2 ml. </li><li> Adicionar 5,3 mL de tampão A e 34,7 ul de 10% (w / v) DDM dissolvido em tampão A. </li><li> Incubar durante 3 h à temperatura ambiente com mistura-sobre-extremidade final. </li><li> Enquanto isso, prepare as esferas de poliestireno: <ol><li> Use 400 mg de contas por amostra e pesá-los para fora em um copo de vidro. </li><li> Lavar duas vezes com metanol, três vezes com água e uma vez com tampão A. Para cada utilização passo de lavagem de 5 ml de líquido e agita-se lentamente durante 10 min. NOTA: Recomenda-se a preparar o poliestirenogrânulos para várias amostras ao mesmo tempo, por exemplo, pesam em 6 g de pérolas e lava-se com 75 ml de líquido. grânulos excesso pode ser armazenado num frigorífico durante vários dias. </li></ol></li><li> Durante os últimos 30 min de desestabilização vesícula secar o fosfolípido NBD-rotulados num tubo com tampa de rosca de vidro ( &#39;reconstituição tubo de vidro&#39;): por exemplo, 9,5 ul de NBD-PC (1 mg / ml em clorofórmio, obtendo-se 0,4% em mol de fosfolípidos totais) são secas sob uma corrente de azoto num tubo de vidro e subsequentemente dissolvido em 45 ul de 0,1% (w / v) em tampão A. DDM </li><li> Após 3 h de desestabilização vesícula adicionar o fosfolipido Dissolveu-NBD-marcado, a proteína solubilizada e DDM-tampão A de tal modo que o volume final de 1 ml contém 0,36% (w / v), isto é, 7 mM, DDM. <ol><li> Assim, para gerar lipossomas livres de proteínas (utilizado como uma amostra de controlo) adicionar 45 ul de NBD-PC (dissolvidos em 0,1% de DDM), 60 ul de 0,1% de DDM e 55 ul de tampão A; para proteolipossomos acrescentar, para o examePLE, 40 ul de proteína (a partir de uma solução-mãe típica de ~ 110 ng / ul) em 0,1% de DDM, 45 ul de NBD-PC (dissolvidos em 0,1% de DDM), 20 ul de 0,1% de DDM e 55 ul de tampão A . NOTA: A ordem de adição deve ser conforme listado. </li></ol></li><li> Misturar a amostra para um fim horas adicionais sobre a extremidade, à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 80 mg de pérolas de poliestireno preparadas e incubar a amostra com a extremidade-sobre-extremidade mistura durante 1 h à TA. </li><li> Em seguida adicione um adicional de 160 mg de grânulos de poliestireno e incubar com ponta-a-ponta a mistura durante mais 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Transferir a amostra (deixando os grânulos de poliestireno passados ​​para trás) a um tubo de vidro com tampa de rosca contendo 160 mg de grânulos de poliestireno frescos e misturar durante a noite a 4 ° C. NOTA: A maneira mais fácil de transferir a amostra e evitar sugando grânulos é a utilização de uma pipeta de Pasteur, que é empurrada para a parte inferior do tubo de vidro com uma pequena pressão positiva. Uma vez que a ponta da pipeta é firmemente nofundo do tubo, em seguida, a amostra pode ser retirada facilmente, sem interferência a partir das esferas. </li><li> Na manhã seguinte, transferir a amostra para um tubo de microcentrífuga sem carregar sobre contas e colocar no gelo na preparação para o ensaio da atividade scramblase. </li></ol></li></ol> 2. Ensaio de Actividade scramblase NOTA: A intensidade de fluorescência de lipossomas ou proteolipossomas diluídas com tampão A é monitorizada ao longo do tempo após a adição de ditionito num espectrómetro de fluorescência. Para se obter uma intensidade de partida estável, a fluorescência é registada por pelo menos 50 segundos (ou até que um sinal estável é alcançada) antes de adicionar ditionito a uma amostra constantemente agitada e é, então, seguido por, pelo menos, 500 segundos após a adição de ditionito. <ol><li> Adicionar 1,950 mL de tampão A a uma tina de plástico contendo um mini-barra de agitação. </li><li> Adicionar 50 ul da Proteo preparada (lipossomas) e deixar equilibrar a amostra no espectrofotómetro de fluorescênciamedidor com agitação constante durante vários segundos. </li><li> Enquanto isso preparar uma solução de 1 M de ditionito em Tris 0,5 M não tamponada (por exemplo, para duas amostras pesam-se 20 mg de ditionito num tubo de microcentrifugação e dissolve-se em 114 mL de gelo frio de Tris 0,5 M directamente antes da utilização e manter em gelo para o próximo amostra). NOTA: A solução de ditionito deve ser preparada imediatamente e não deve ser usado mais de 20 minutos após a preparação; Se muitas medições estão a ser feitas, alíquotas de ditionito pode ser pesado com antecedência e dissolveu-se imediatamente antes da utilização. </li><li> Iniciar a monitorização da fluorescência (excitação 470 nm, emissão a 530 nm, fenda de largura de 0,5 nM). </li><li> Adicionar 40 ul da solução de ditionito de 1 M para a cuvete 50 segundos depois de começar a gravação de fluorescência (use o septo na tampa da câmara de cuvete se possível) e continuar a gravar a fluorescência para um outro 400-600 seg. </li><li> Analisar os dados conforme descrito na seção 3. </li></ol> 3.Análise de dados <ol><li> Cinética de Scrambling <ol><li> Caracterizar o rastreio de fluorescência de cada amostra obtida pelo ensaio de actividade scramblase definindo a fluorescência inicial, F I, antes de se adicionar ditionito, e a fluorescência de ponto final, F, alcançado após&gt; 400 seg. F i é determinada para cada amostra como o valor médio de fluorescência para o período de 30 segundos antes da adição de ditionito. </li><li> Determinar os dados de ponto de extremidade correspondente à extensão da redução da fluorescência, R = 100 • F / F i. Usamos os termos R L para os lipossomas livres de proteínas e R P para proteolipossomas contendo opsina. </li></ol></li><li> Determinação do peso molecular do Funcionalmente reconstituído scramblase <ol><li> Converter os dados de redução de fluorescência de acordo com a seguinte equação: P (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (Rmax - R L) (Equação 1) NOTA: Onde Rmax é a redução máxima que é obtida quando a proteína suficiente é reconstituído de modo a que todas as vesículas na amostra possuem pelo menos um scramblase funcional, e P é a probabilidade de que uma vesícula particular numa amostra reconstituída é &#39;scramblase-activo &quot;, isto é, que possui pelo menos um scramblase funcional. O valor de R L é tipicamente 45% 3 enquanto que Rmax é tipicamente 82,5% 3, em vez do esperado 100% (R máx pode ser determinada experimentalmente para proteolipossomas opsina com um PPR de&gt; 1 mg / mmol). Como Rmax &lt;100%, presume-se que uma sub-população de vesículas é refractário à reconstituição. Por R max = 82,5%, a fração de vesículas que é incapaz de aceitar a proteína é de 0,35. </li><li> Descrever a relação entre P (≥1 scramblase) e PPR (mg de proteína / fosfolípido mmol) por estatística de Poisson da seguinte forma: P (≥1 scramblase) = 1 - e <sup&gt; -m = 1 - exp (-PPR / α) (equação 2) NOTA: em que m = número de scramblases por vesícula e α = constante ajuste de mono-exponencial em unidades de mg de proteína fosfolípido / mmol. </li><li> Como uma fracção das vesículas não contribui para a cifragem mesmo em alta PPR (ver discussão), modificar a equação: P (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (Equação 3) NOTA: Se PPR * = PPR / (1- f), em que f é a população de vesículas ou refractário, neste caso, PPR * = PPR / 0,65 (Equação 4). NOTA: O α constante ajuste é determinada ajustando um gráfico de p (≥1 scramblase) versus PPR * com uma função mono-exponencial. Se opsina (peso molecular 41,7 kDa) reconstitui funcionalmente em vesículas de 175 nm de diâmetro (cada vesícula tem 280.000 fosfolipídios 26) como um monômero, a = 0,187 mg mmol -1. Se opsina dimeriza antes da reconstituição 3, para se obter vesículas scramblase-activo, em seguida, α= 0,37 mg mmol -1. Se em vez de PPR PPR * estavam a ser utilizados para a análise, em seguida, os valores correspondentes ct seria 0,122 e 0,244 mg mmol -1. Estes valores previstos para α assumir que todas as moléculas opsina são funcionalmente competente. Se apenas uma fracção das moléculas é competente para embaralhar lípidos, em seguida, os valores correspondentes de α será maior. </li></ol></li></ol>

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<li>Marek, M., Günther-Pomorski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+Flippase+Activity+in+Proteoliposomes+Using+Fluorescent+Lipid+Derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives.</a> Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).</li>
<li>Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+purification%2C+and+functional+reconstitution+of+the+P4-ATPase+Atp8a2%2C+a+phosphatidylserine+flippase+in+photoreceptor+disc+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes.</a> J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).</li>
<li>Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+P4-ATPases+and+ABC+transporters+and+their+role+in+phospholipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).</li>
<li>Romsicki, Y., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+flippase+activity+of+the+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter.</a> Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).</li>
<li>Zhou, X., Graham, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+phospholipid+translocase+activity+with+purified+Drs2p%2C+a+type-IV+P-type+ATPase+from+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

O ensaio de atividade scramblase permitiu-nos inicialmente para determinar que opsina tem actividade scramblase 2. O ensaio também permitiu-nos caracterizar a actividade scramblase de opsina por meio de testes de especificidade (foi utilizada uma variedade de lípidos repórter NBD-rotulados como NBD-fosfatidiletanolamina, marcado com NBD em uma cadeia de acilo, tal como mostrado para NBD-PC na Figura 1A, ou na headgroup, NBD-esf ingomielina ou NBD- fosfatidilserina 2), o efeito da c...

A rodopsina dos fotorreceptores, um receptor acoplado a proteína G prototípico (revisto por exemplo, na referência 1), é a primeira scramblase a ser identificado e bioquimicamente verificada 2,3. Scramblases são transportadores de fosfolipídios que aumentam a taxa intrinsecamente lenta de transbilayer movimento fosfolipídios para fisiologicamente níveis apropriados em um bidirecional, forma ATP-independente 4-6. Exemplos de as suas acções podem ser encontradas no retículo endoplasmático e na membrana citoplasmática de bactérias, onde constitutiva de cifragem é necessária para a homeostase da membrana e crescimento, bem como para uma variedade de vias de glicosilação 5. Fosfolípido scrambling regulada é necessária para expor a fosfatidilserina (PS) sobre a superfície de células apoptóticas, onde actua como um &quot;comer-me&quot; -signal para macrófagos 7 e proporciona uma superfície de pró-coagulante nas plaquetas sanguíneas activadas para catalisar a produção do factor de proteínass necessário para a coagulação do sangue. Em membranas de discos fotorreceptoras, actividade de cifragem de rodopsina foi sugerido para compensar o desequilíbrio de fosfolípido entre os dois folhetos da membrana de bicamada que é gerado pelo ATP-dependente, lípido unidireccional flipase ABCA4 4,8,9 10-12. Apesar da importância fisiológica da scramblases, a sua identidade permanecido elusivos até rodopsina foi reportado como um scramblase em discos fotorreceptoras 2, membros da família de proteínas TMEM16 foram identificados como de Ca2 + dependentes de scramblases necessários para a exposição de PS na membrana plasmática (revisto em referência 13), e a proteína bacteriana FTSW foi proposto como um lípido II scramblase necessária para a síntese do peptidoglicano 14. Estas descobertas basearam-se na reconstituição de proteínas purificadas em lipossomas e demonstração de actividade scramblase nas proteolipossomas resultante utilizando a metodologia described aqui. Outros potenciais scramblases 15-21 - as proteínas MurJ e AMJ implicados na biossíntese dos peptidoglicanos, WzxE e proteínas relacionadas implicada na cifragem precursores de O-antigénio, proteína MprF necessário para translocar fosfatidilglicerol aminoacilado através da membrana citoplasmática de bactérias, e membros da família Xkr8 que têm sido propostos para expor PS na superfície de células apoptóticas - continuam a ser testado bioquimicamente. Isso destaca a importância de um ensaio robusto para identificar e caracterizar a atividade scramblase. Aqui, nós descrevemos a reconstituição de opsina purificada, a apoproteína da rodopsina de fotorreceptores, em vesículas unilamelares grandes (LUV), e a análise subsequente da actividade de scramblase nas proteolipossomas resultantes usando um ensaio baseado em fluorescência. Existem vários protocolos descritos poços disponíveis na literatura para a expressão heteróloga e purificação de opsina, portanto, não serádescrevê-lo neste protocolo; usamos os protocolos descritos em Goren et ai. 3 que produz FLAG-tag, opsina termoestável a cerca de 100 ng / ul em 0,1% (w / v) dodecylmaltoside (DDM). A reconstituição é conseguida por tratamento com LUV detergente suficiente para que elas incham mas não se dissolvem. Sob estas condições, uma proteína de membrana - fornecido na forma de micelas de detergente-proteína - irá integrar-se os lipossomas e tornar-se reconstituída para a membrana do lipossoma após a remoção de detergente, resultando em proteolipossomas. Para reconstituir opsina (obtido na forma de uma proteína purificada em 0,1% (w / v) DDM), LUV são preparados a partir de uma mistura de POPC (1-palmitoil-2-oleoyl--sn-glicero-3-fosfocolina) e POPG (1- palmitoil-2-oleoyl--sn-glicero-3- [fosfo-rac- (1-glicerol)]) e saturou-se com DCM antes de adicionar opsina e NBD-PC. O detergente é então removido por tratamento da amostra com contas de poliestireno. lass = &quot;jove_content&quot;&gt; O princípio subjacente ao ensaio baseado em fluorescência é mostrado na Figura 1B. LUV são simetricamente reconstituída com uma quantidade vestigial de NBD-PC ou outro fosfolípido repórter fluorescente NBD-rotulado (Figura 1A). Por adição de ditionito, um dianião de membrana-impermeabilizante, moléculas de NBD-PC na monocamada externa dos LUV são tornadas não-fluorescente como a nitro-grupo de NBD é reduzido a um grupo amino não-fluorescente. Como nem moléculas NBD-PC nem ditionito são capazes de atravessar a membrana sobre a escala de tempo da experiência (&lt;10 minutos), o que resulta em redução de 50% do sinal de fluorescência. No entanto, se os lipossomas são reconstituídos com uma scramblase, moléculas de NBD-PC no folheto interno pode precipitação rapidamente para o exterior, onde eles são reduzidos. Isso resulta na perda total de fluorescência, no caso ideal (Figura 1C). es / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg &quot;/&gt; . Figura 1: Representação esquemática do ensaio de actividade scramblase O ensaio utiliza um repórter lípido marcado com NBD fluorescente; NBD-PC é mostrado (A). As grandes vesículas unilamelares são reconstituídos com uma quantidade vestigial de NBD-PC. Reconstituição produz vesículas simétricas, com NBD-PC distribuído igualmente nos folhetos exteriores e interiores. Ditionito de (S 2 O 4 2-) quimicamente reduz o grupo nitro de NBD para um grupo amino não-fluorescente. Tratamento de lipossomas livres de proteínas com ditionito (B, parte superior) provoca uma redução de 50% da fluorescência uma vez que apenas as moléculas de NBD-PC na monocamada externa são reduzidas: ditionito é carregada negativamente e não pode atravessar a membrana para reagir com as moléculas de NBD-PC no folheto interno. Tratamento ditionito de proteolipossomas contendo opsina (B, parte inferior), isto é, proteolipossomas scramblase-activo, resulta em perda de 100% do Fluorescence como opsina facilita o movimento de NBD-PC entre o interior e o folheto externo. (C) mostra vestígios de fluorescência obtidos idealizadas no tratamento de lipossomas livres de proteínas e proteolipossomas contendo opsina com ditionito. A taxa de perda de fluorescência é o mesmo em ambos os casos, indicando que a redução química de NBD por ditionito é limitante da taxa, e que o embaralhamento ocorre a uma velocidade igual ou maior do que a velocidade da reacção química. Traços obtidos a partir de um experimento real são mostrados na Figura 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Os métodos que descrevem pode ser utilizado para a reconstituição e ensaio de outras proteínas purificadas, bem como misturas de proteínas de membrana obtida, por exemplo, por extracção com detergente 22 microssomas.

<table><tbody><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1-Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerol) (sal de sódio)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457C</td><td>POPG</td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il)amino]hexanoil}-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810130C</td><td>NBD-PC</td></tr><tr><td>4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanossulfônico</td><td>ácido VWR Scientific</td><td>EM-5330</td><td>HEPES</td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>Sigma S7653-1KG</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Dodecil-&beta;-D-maltosídeo</td><td>Anatrace</td><td>D310 5 GM</td><td>DDM</td></tr><tr><td>Fluorímetro cuvetes</td><td>sigma</td><td>C0918-100EA</td><td>cuvetes</td></tr><tr><td>Espectrofluorômetro</td><td>Photon Technology International, Inc.</td><td>fluorímetro</td> Hidrossulfito <td></td></tr><tr><td>de sódio grau técnico, 85%</td><td>Sigma</td><td>157953-5G</td><td>ditionita</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5 software</td><td></td><td></td><td>Prism</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>VWR</td><td>JTX171-3</td><td>Tris</td></tr><tr><td>LIPEX extrusora de 10 ml&nbsp;</td><td>Lipídios do Norte, Inc.</td><td></td><td>Extrusora</td></tr><tr><td>Whatman, Disco de drenagem, PE, 25 mm</td> Suporte de <td>disco</td><td>Sigma</td><td>28156-243</td></tr><tr><td>Membranas de Trilha Nuclepore Whatman, 0.4 &micro; m, membrana</td><td>Sigma</td><td>WHA110607</td><td>400 nm</td>de 25 mm de diâmetro</tr><tr><td>Membranas Rastreadas de Nucleóporos Whatman, 0.2 &micro; m, 25 mm de diâmetro</td><td>Sigma</td><td>WHA110606</td> membrana de <td>fosfato</td></tr><tr><td>de sódio</td> de 200 nm <td>Sigma</td><td>S3264-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultura VWR, descartáveis, vidro borossilicato, 13 x 100 mm</td><td>VWR Scientific</td><td>47729-572</td><td>tubos de vidro</td></tr><tr><td>Ácido perclórico</td><td>Sigma</td><td>30755-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Molibdato de amônio tetrahidratado</td><td>Sigma</td><td>A-7302</td><td>molibdato de amônio</td></tr><tr><td>(+)-L-ascorbato de sódio</td><td>Sigma</td><td>A7631-25G</td><td>ascorbato de sódio</td></tr><tr><td>Bio-Beads SM2 adsorventes</td><td>Bio Rad</td><td>1523920</td><td>contas de poliestireno</td></tr><tr><td>&nbsp; Microtubos de 2,0 ml transparentes</td><td>VWR Scientific</td><td>10011-742</td><td>Tubos de reconstituição</td></tr><tr><td>Tubo de vidro de reconstituição</td><td>VWR Scientific</td><td>53283-800</td><td>Tubos de vidro de reconstituição</td></tr><tr><td>Zetasizer&nbsp;</td><td>Malvern&nbsp;</td><td></td><td>Dls</td></tr></tbody></table>

um ensaio baseado em fluorescência de fosfolípido scramblase atividade

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases fosfolípidos translocar através da bicamada de membrana bidireccionalmente de uma forma independente de ATP. A primeira a ser identificada scramblase bioquimicamente e verificou-se opsina, a apoproteína da rodopsina dos fotorreceptores. A rodopsina é um receptor acoplado a proteína G localizado em membranas de discos haste fotorreceptoras da retina, onde é responsável pela percepção da luz. Atividade scramblase da rodopsina não depende do seu ligando 11- cis-retinal, ou seja, a opsina apoproteína também atua como um scramblase. Embora fosfolípido constitutiva e regulada scrambling desempenhar um papel importante na fisiologia da célula, apenas alguns scramblases de fosfolípidos foram identificados até agora, além de opsina. Descrevemos aqui um ensaio baseado em fluorescência de actividade scramblase de opsina. Opsina é reconstituído em grandes lipossomas unilamelares compostos por fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol e uma quantidade traço de fluorescente marcado com NBD PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) amino] hexanoil} - sn-glicero-3-fosfocolina). scramblase actividade é determinada medindo a extensão em que as moléculas de NBD-PC localizados no folheto interno da vesícula é capaz de aceder ao folheto exterior, onde a sua fluorescência é eliminado quimicamente por um agente de redução que não pode atravessar a membrana. Os métodos que descrevem têm aplicabilidade geral e podem ser utilizados para identificar e caracterizar as actividades scramblase de outras proteínas de membrana.

Descreve-se a reconstituição de opsina em LUV para caracterizar a sua actividade scramblase usando um ensaio baseado em fluorescência. Analisamos os resultados para colocar um limite inferior na taxa de fosfolípido mediada por opsina cifragem e para determinar o estado oligomérico em que opsina reconstitui funcionalmente para as vesículas. Para identificar as condições óptimas de reconstituição, é necessário determinar empiric...

Descrevemos um ensaio baseado em fluorescência para medir o embaralhamento de fosfolipídios em grandes lipossomas unilamelares reconstituídos com opsina.

Um ensaio baseado em fluorescência de Fosfolípido scramblase Atividade

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

O objetivo geral deste procedimento é reconstruir um receptor acoplado à proteína G típico em vesículas unilamelares grandes e medir sua capacidade de realizar a translocação independente de 80p de fosfolipídios através de uma bicamada lipídica utilizando um ensaio baseado em fluorescência. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo do transporte lipídico intercelular, como qual é a identidade molecular das proteínas que podem redistribuir lipídios e qual é o seu mecanismo. A principal vantagem desta técnica é que ela é muito confiável e robusta.Uma vez que o seu procedimento de reconstrução esteja estabelecido para uma determinada composição lipídica e um detergente preferido. Para iniciar este procedimento, utilize uma seringa de vidro para adicionar 1435 microlitros de uma solução de 25 miligramas por mililitro de POPC e clorofórmio a um frasco de fundo redondo. Adicione 160 microlitros de uma solução de 25 miligramas por mililitro de POPG e clorofórmio para obter 52,5 micromols de lipídios em uma proporção molar de nove para um de POPC para POPG.Em seguida, seque os lipídios por 30 minutos utilizando um evaporador rotativo ajustado a 145 RPM. Após a conclusão da secagem, transfira o frasco para um dessecador a vácuo por três horas à temperatura ambiente. Então, adicione 10 mililitros do tampão A para hidratar o filme lipídico seco.Agite suavemente o frasco até que uma suspensão turva homogênea seja formada. Sonique a suspensão em uma frequência de 40 kilohertz em banho-maria à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, utilizando um extrusor, passe a amostra através de uma membrana com tamanho de poro de 400 nanômetros, 10 vezes.Em seguida, realize um segundo ciclo de extrusão, passando a amostra através de uma membrana com poros de 200 nanômetros, quatro vezes. Reserve a suspensão resultante, visualmente mais clara, que contém vesículas unilamelares grandes de fosfolipídios com cerca de 175 nanômetros de diâmetro. Após a conclusão da extrusão, prepare os padrões em tubos de vidro de 13 por 100 milímetros conforme descrito no protocolo no texto.Em seguida, adicione 10 microlitros de cada amostra de LUV e proteolipossomo a um tubo de vidro distinto e dilua com 40 microlitros de água destilada desionizada. Adicione 300 microlitros de ácido perclórico a cada tubo e aqueça por uma hora a 145 graus Celsius em um bloco de aquecimento. Coloque uma bolinha de vidro em cada tubo para evitar evaporação.Em seguida, deixe os tubos esfriarem até a temperatura ambiente e adicione um mililitro de água destilada desionizada a cada um. Adicione 400 microlitros de uma solução recém-preparada contendo 12 gramas por litro de molibdato de amônio e 50 gramas por litro de ascorbato de sódio a cada tubo, e agite em vórtex para homogeneizar. Aqueça os tubos por 10 minutos a 100 graus Celsius usando bolinhas de vidro para prevenir a evaporação.Em seguida, retire os tubos do bloco de aquecimento e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Usando um espectrômetro ajustado em 797 nanômetros, obtenha uma curva de calibração utilizando os padrões. Em seguida, meça a absorbância das amostras em relação ao branco e determine o teor de fosfato.Inicie pipetando 800 microlitros de cada suspensão de LUV extrudidos em um tubo microfusível de dois mililitros distinto. Adicione 5,3 microlitros do tampão A e 34,7 microlitros de DDM a 10% massa por volume, dissolvido no tampão A, a cada tubo. Em seguida, incube as amostras por três horas à temperatura ambiente com mistura por inversão contínua.Enquanto as amostras estão em incubação, pese 400 miligramas por amostra de esferas em um béquer de vidro. Lave as esferas com cinco mililitros por amostra de metanol, agitando lentamente por 10 minutos. Repita essa lavagem uma vez com metanol, três vezes com água e uma vez com tampão A. Durante os últimos 30 minutos de incubação das amostras, seque 9,5 microlitros por amostra de fosfolipídio marcado com NBD em um tubo de vidro com tampa rosqueável sob fluxo de nitrogênio.Em seguida, adicione 45 microlitros por amostra de DDM a 0,1% massa por volume em tampão A para dissolver o fosfolipídio seco. Após a conclusão da incubação, adicione a solução de fosfolipídio marcado com MBD dissolvida a cada amostra. Em seguida, adicione DDM a 0,1%, tampão A e a opsina solubilizada com DDM na quantidade desejada, nessa ordem, para obter um volume final de um mililitro com uma concentração de sete milimolar de DDM.A reconstituição de uma proteína de membrana é realizada tratando vesículas com detergente suficiente para que o inchaço não dissolva. Nessas condições, que devem ser determinadas empiricamente para cada composição lipídica e detergente, a proteína será integrada aos lipossomos. Incube as amostras por uma hora à temperatura ambiente.Em seguida, adicione 80 miligramas das esferas de poliestireno preparadas a cada tubo e incube novamente por uma hora à temperatura ambiente com mistura em rotação end-over-end. Adicione mais 160 miligramas de esferas de poliestireno a cada amostra e incube por duas horas à temperatura ambiente com mistura em rotação end-over-end. Ao final da incubação, transfira as amostras, deixando as esferas para trás, para tubos de vidro limpos, cada um contendo 160 miligramas de esferas frescas.Misture de ponta a ponta durante a noite a quatro graus Celsius, protegido da luz. Em seguida, transfira as amostras, sem as microesferas, para tubos microfusão individuais. Coloque os tubos sobre gelo em preparação para o ensaio de atividade da scramblase.Inicie adicionando 1950 microlitros do tampão A a uma cubeta de plástico, contendo um bastão de agitação de plástico. Em seguida, adicione 50 microlitros da amostra de proteolipossoma preparada. Deixe a amostra equilibrar no espectrômetro de fluorescência com agitação constante durante cinco segundos.Enquanto a amostra está em equilíbrio, prepare uma solução de ditionito um molar em tris não tamponado 0,5 molar. Inicie o monitoramento da fluorescência com uma excitação de 470 nanômetros, uma emissão de 530 nanômetros e uma largura de fenda de 0,5 nanômetro. Registre por 50 segundos para obter um sinal estável.Em seguida, adicione 40 microlitros de uma solução um molar de ditionito à cubeta. Registre a fluorescência por pelo menos 500 segundos. Por fim, analise os dados conforme descrito no protocolo textual.Para uma análise completa dos dados de fluorescência, quando se deseja determinar a fração de vesículas que não podem ser reconstruídas. A recuperação de proteínas e lipídios nas vesículas reconstruídas e também a distribuição de tamanho das vesículas. Neste estudo, a opsina é reconstruída em vesículas unilamelares grandes para caracterizar sua atividade de scramblase utilizando um ensaio baseado em fluorescência.As vesículas são reconstruídas com NBD-PC, que se distribui igualmente entre as folhetos externo e interno. O ditionito reduz o grupo nitro do NBD na parte externa da vesícula a grupos amino não fluorescentes, resultando em uma redução de 50% da fluorescência em lipossomos livres de proteínas. No entanto, quando a opsin facilita o movimento do NBD entre o folheto interno e externo, ocorre uma perda completa da fluorescência.Os resultados representativos dessa abordagem em diferentes proporções de proteína para fosfolipídio podem ser vistos aqui. O grau de redução da fluorescência aumenta com a quantidade de opsin reconstruída em vesículas, que varia de zero a 4,95 microgramas. O ditionito foi adicionado no tempo indicado, e a fluorescência do NBD foi monitorada por 400 segundos.A redução da fluorescência é mais acentuada em razões mais altas de proteína para fosfolipídio, sendo a maior redução de 85%. A redução da fluorescência no ponto final é então utilizada para determinar a probabilidade de atividade de scramblase, ou seja, a probabilidade de as vesículas possuírem ao menos uma scramblase, utilizando a estatística de Polson. A curva vermelha representa um ajuste monoexponencial para a opsin. Já as linhas cinza tracejadas representam ajustes monoexponenciais para a reconstrução da opsin em vesículas como monômeros, dímeros pré-formados ou tetrâmeros pré-formados.O método que descrevemos pode ser facilmente adaptado a diferentes necessidades. Os procedimentos são versáteis e podem ser utilizados para identificar e caracterizar a atividade de fosfolipídio scramblase de outras proteínas de membrana no futuro. O procedimento de reconstituição pode ser aplicado a qualquer proteína de membrana.Essa técnica nos permitiu identificar a opsin como a primeira scramblase de fosfolipídios bioquimicamente verificada e nos possibilitou, então, caracterizar a atividade de diferentes estados conformacionais da proteína, bem como sua capacidade de transportar diferentes lipídios.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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