Name: Visualizando os estágios iniciais da fagocitose (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprenda a visualizar os estágios iniciais da fagocitose usando microscopia confocal com células DC 2.4. Este método simples permite monitorar em tempo real a entrada de patógenos como Candida albicans em células hospedeiras.

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Agradecemos Wendy Salmon e Nicki Watson da instalação Keck no Instituto Whitehead, do MIT para a imagem latente.

1. Preparação de DC2.4 e RAW Lines 264,7 celulares NOTA: A linha de células semelhantes a macrófagos RAW 264.7 e o DC2.4 linha de células dendríticas são tanto de origem murina, e as seguintes condições foram usadas para crescer as células. <ol><li> Cultivar células RAW 264.7 em DMEM (meio de Eagle mínimo de Dulbecco) suplementado com 10% de soro bovino fetal inactivado (FBS) a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2. </li><li> Cultivar células DC2.4 em condições semelhantes com o de células RAW 264.7, excepto meio de utilização de RPMI (Roswell Park Memorial Institute) suplementado com L-glutamina em vez de DMEM. </li></ol> 2. Preparação de fluorescentes conjugados Partículas: Beads C. albicans, zimosano, IgG-revestidas <ol><li> Crescer Candida albicans <ol><li> Inocular C. albicans estirpe SC5314 a partir de um stock de glicerol congelado em 25 ml de YPD suplementado com Uri (2% de Bacto-peptona, 1%extracto de levedura, 2% de glucose e 80 ug / ml de uridina) durante a noite a 30 ° C. NOTA: Evite a crescer a cultura Candida mais do que uma OD 600 de 12. </li><li> Tomar 1 ml da C. albicans e girá-lo para baixo a 2.000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet com 1 ml de PBS. </li><li> Recolhe-se o sedimento por centrifugação a 2000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Repita o passo 2.1.4. </li><li> Calcula-se a multiplicidade de infecção (MOI) de C. albicans em relação ao número de fagócitos e prosseguir com o ensaio de fagocitose, como descrito na secção 3. um OD 600 de 1 é equivalente a 2,5 x 10 7 Candida albicans por 1 ml. NOTA: Geração de Candida-BFP é descrito na referência 13. </li></ol></li><li> Preparação de Zymosan e grânulos de IgG-revestidas NOTA: Zymosan é um contendo β-glucana-preparação de hidratos de carbono em partículas fúngica que derivada a partir de Saccharomyces cerevisiae. Zymosan é conhecido por provocar sinais inflamatórios em macrófagos e células dendríticas, e tem sido amplamente utilizado em estudos de fagocitose 13, 14, 15. <ol><li> Resumidamente vortex do tubo que contém as partículas, e aliquotar numa quantidade suficiente para um experimento em um tubo de 1,5 ml. NOTA: Normalmente usamos 1:10 (para uma célula, adicionar 10 partículas de zimosan ou contas de IgG-revestidas). </li><li> Adicionar 1 ml de PBS gelado, e recolher as partículas por centrifugação durante 1 min a 10.000 x g. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em PBS 1 ml de gelo-frio. </li><li> Repita os passos 2.2.2-2.2.3 NOTA: Vá para a etapa 2.2.5 ou guarde o tubo a 4 ° C até o uso. </li><li> Sonicar as partículas durante 10 s em sonicador de banho de ultra-sons (120 V, 50-60 kHz), a fim de evitar umaNY agregação das partículas. </li></ol></li></ol> 3. A fagocitose NOTA: A fagocitose é um processo complexo que começa com a ligação das partículas na superfície celular dos fagócitos através da interacção de PRRs com ligandos sobre a superfície da partícula. A ligação é seguida pela montagem de actina e das suas proteínas associadas na local de contacto, e a formação de um copo fagocitária. A desmontagem actina subsequente ocorre no fagossoma e resulta na imersão completa do particulado. Abaixo descrevemos as diferentes fases de fagocitose. <ol><li> Ensaio de Ligação NOTA: O objectivo desta experiência é monitorar o primeiro passo de fagocitose que envolve a interacção entre os ligandos alvo nas partículas e os receptores nos fagócitos. <ol><li> Semente de cerca de 5 x 10 4 células em uma lâmina de câmara de modo que eles são de 60-70% confluentes no momento da experiência. Alterntivamente, células da placa em lamelas (24 ou em formato de 12 poços) ou placas de 96 poços com fundo de vidro. Incubar as células durante a noite a 37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO 2. NOTA: As células podem ser contadas usando hemocitômetro ou uma técnica semelhante. </li><li> Colocar a lâmina da câmara (ou placa) a 10 ° C durante 10 min. </li><li> Remova cuidadosamente o meio de cada poço com uma pipeta ou aspirador. ATENÇÃO: Execute esta etapa com cuidado como cada poço de um sistema lamela câmaras é pequeno; é fácil de perturbar as células com a ponta de uma pipeta ou um forte fluxo de ar de um aspirador. </li><li> Misturar as partículas marcadas com fluorescência com um meio de cultura de células (preparado como descrito acima). Adicionar -BFP Cândida (a uma MOI de 10), fluorescentemente grânulos-coelho conjugado com zimosano ou látex de IgG-FITC (10 partículas por célula) das células. Utilizar um volume final de 200 ul de meios de comunicação uma câmara bem para garantir que todas as células são cobertas. </li><li> Gire para baixo o slide câmara a 277xg durante 3 min a 10 ° C. NOTA: Este passo de centrifugação ajuda a aumentar o contato entre as partículas e as células, e sincroniza o processo de ligação. </li><li> Imediatamente Transferir as lâminas para uma câmara incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 5 min. </li><li> Remover o slide câmara da incubadora e aspirar os meios de comunicação. </li><li> Lavam-se as células 3x com PBS gelado. NOTA: Verifique a presença de partículas livres, com um microscópio de luz e lavar mais vezes com PBS, se necessário. É essencial para remover as partículas não ligadas a partir do bem para minimizar o ruído de fundo durante a análise. </li><li> Fixar as células por adição de 500 ul de paraformaldeido a 4% (PFA) diluída em PBS, por incubação durante 30 min à temperatura ambiente. CUIDADO: Este passo requer o uso de PFA a 4%, que é altamente tóxico, corrosivo e potencial cancerígeno. cuidado apropriado deve ser tomado ao usar este líquido. Além disso, proteger as amostras da luz. </li><li&gt; Lavam-se as células por adição de 500 ul de PBS para dentro da câmara e aspirar a solução suavemente. </li><li> Repita 3.1.9 etapa duas vezes. NOTA: Nesta etapa, encher cada frasco imediatamente após a remoção do PBS anterior. </li><li> Pare a fixação por incubação com 500 ul de 50 mM de NH 4 Cl em PBS, durante 10 min. </li><li> Lavar as células duas vezes com PBS como descrito no passo 3.1.10. </li><li> Permeabilizar as células por adição de 250 uL de tampão de ligação (0,1% de saponina, 0,2% de BSA em PBS) durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Mancha F-actina por adição de faloidina conjugada fluorescentemente (diluído 1: 500 em tampão de ligação). Incubar as células durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Lave as células três vezes com PBS como descrito no passo 3.1.10. </li><li> Capturar imagens usando um microscópio confocal (objetiva 63X e 402 nm e 488 nm do laser) e analisar as imagens usando ImageJ 16. NOTA: A ligação Uma partícula de sucesso é caracterizada pela presença de um cu fagocitáriap no local onde o contacto da célula fagocítica partículas (Figura 1). Veja o passo 3.2.5. </li></ol></li><li> Fagocitose de Captação de Ensaio NOTA: Este experimento é projetado para monitorar a internalização completa das partículas marcadas fluorescentes pelos fagócitos meio de microscopia confocal (Figura 2). <ol><li> Semente de cerca de 5 x 10 4 células em uma lâmina de câmara de modo que eles são de 60-70% confluentes no momento da experiência. Alternativamente, células da placa em lamelas (24 ou em formato de 12 poços) ou placas de 96 poços com fundo de vidro. Incubar as células durante a noite a 37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO 2. NOTA: As células podem ser contadas usando hemocitômetro ou uma técnica semelhante. </li><li> Manter as lâminas de câmara (ou placa) a 10 ° C durante 10 min. NOTA: Arrefecimento é necessário, a fim de bloquear a endocitose, bem como a fagocitose indesejados, e, subsequentemente, ter uma fagocitose sincronizado. </li><li> perfpassos ORM de 3.1.3 a 3.1.5 </li><li> Transferir as lâminas para uma câmara de 37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO 2, e incubar por diferentes pontos de tempo. Fix células após a infecção 30, 60 e 90 min post. Observe C. albicans começam a se formar hifas na infecção pós 60 min; fagócitos começam a mostrar a morte celular (pyroptosis) após 90 min 8. NOTA: Este é uma recomendação, e optimização é essencial, dependendo do tipo de célula e as partículas usadas. </li><li> Execute os passos a partir 3.1.7 a 3.1.15. Analisar imagens usando ImageJ 16. NOTA: uma implantação bem sucedida é caracterizado por uma internalização completa de um material em partículas dentro do citoplasma de um fagócito (Figura 2). A coloração dos fagócitos com marcador da superfície celular, tais como faloidina ajuda a delinear o contorno das células. É também essencial para realizar z pilhas a fim de determinar se as partículas são obrigadas a superfície celular ou completely internalizado. </li></ol></li><li> Imagens ao vivo da fagocitose NOTA: Neste protocolo, descrevem a utilização de microscopia confocal para capturar as diferentes fases de fagocitose usando zimosan conjugado fluorescente. Usamos a linha de células dendríticas DC2.4 que expressa estavelmente mCherry marcada com F-actina 8, um biossensor que mostra a distribuição de actina filamentosa em células vivas. Desde a fagocitose é um processo orientado a actina a imagens ao vivo nesta célula não só nos permite captar o movimento ea dinâmica da rede de F-actina, mas também para visualizar os diferentes eventos fagocíticas no interior das células vivas (Figura 3, Movie 1). <ol><li> Semente de cerca de 5 x 10 4 células em uma lâmina de câmara com uma concentração de modo que eles são de 60-70% confluentes no momento da experiência. Incubar as células durante a noite a 37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO 2. NOTA: As células podem ser contadas usando hemocitômetro ou umtécnica similar. </li><li> Manter as lâminas de câmara em gelo durante 10 min. NOTA: Arrefecimento é necessário, a fim de bloquear a absorção indesejável, e tem uma fagocitose sincronizado. </li><li> Execute as etapas de 3.1.3 a 3.1.5 </li><li> Pré-aquecer o estágio de microscópio de 37 ° C e equilibrar a câmara com 5% de CO 2. Espera 30-45 min para a temperatura e o CO 2 a estabilizar antes de iniciar a geração de imagens. NOTA: Uma vez que os CO 2 e temperatura níveis são críticos para a fagocitose, é importante ligar o aquecedor do microscópio antes do experimento para equilibrar a câmara ambiental. </li><li> Colocar a lâmina câmara contendo as células no recinto microscópio incubador equilibrado a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Realizar imagem ao vivo 17, 18. NOTA: As definições para a potência do laser (ganho, do furo de pino, etc.) podem variar, dependendo do tipo de the microscópio e sonda fluorescente usada. Portanto, recomendamos consultar o manual do microscópio para a condição ideal para a sua imagem ao vivo 17,18. <ol><li> Use microscópio confocal de varredura a laser (eo software associado) para geração de imagens ao vivo. Use objectivo óleo 63X 1.4NA com um furo de 1-1,1 unidades arejado. </li><li> Para iniciar a criação de imagens, utilizado o campo brilhante para encontrar uma região representativa no slide câmara. Em seguida, selecione o campo clicando na opção Posição sobre o software. Para detectar GFP na Pista 1 usado o conjunto de filtro para 488 nm do laser com um divisor de feixe de 582 nm, para detectar comprimentos de onda entre 488 e 582 nm. </li><li> No Track 2 selecionar um conjunto de filtros ideal para mCherry (RFP), utilizando um divisor de feixe de 578 nm e detectar comprimentos de onda entre 578 e 600 nm. Use 488 nm e 578 nm lasers com potência de laser de 50% e uma saída de ganho de 600-700. Obtenção de imagens a cada 30 seg para um total de 90 min. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

fagócitos profissionais, tais como macrófagos e células dendríticas, engolir e eliminar agentes patogénicos invasores, portanto, fazer a fagocitose um componente importante do sistema de defesa do hospedeiro. Durante este processo de submeter a fagócitos extensa reorganização da membrana e o rearranjo do citoesqueleto na sua superfície celular 8, 19, 20. Para entender melhor este processo dinâmico, a visualização das diferentes...

Apesar de a exposição contínua a agentes patogénicos, tais como bactérias, vírus e fungos, o corpo está bem equipado com o mecanismo imunitário que proporcionam protecção contra a infecção. O sistema imune inato é a primeira linha de defesa contra agentes patogénicos invasores e baseia-se principalmente em células fagocíticas que reconhecem e internalizam alvos estranhos. A fagocitose é um processo celular evolutivamente conservada que engloba o englobamento de partículas não desejadas superiores a 0,5 uM. As células fagocíticas expressar uma vasta gama de receptores imunes (também conhecidos como receptores de reconhecimento de padrões, PRRs) na superfície da célula que lhes permitam reconhecer padrões moleculares associados a agentes patogénicos (PAMPs) presentes sobre os agentes patogénicos anteriores para imersão 3. A ligação patógeno é seguido por agrupamento de receptores na superfície da célula e desencadeia a formação de um copo fagocitária. Isso resulta em remodelação membrana impulsionado-actina que se projeta em torno deo alvo, eventualmente, envolvendo-o e beliscando-off para formar um vacúolo phagosomal discreta 2, 5. O fagossomo então amadurece e acidifica por fusão posterior com endossomas tardios e lisossomas que formam fagolisossomo 6. Embora a fagocitose é descrito como um evento mediado por receptores e orientada para a actina, este processo também depende de modificação espacial-temporal de lípidos que compõem a membrana plasmática, como fosfoinositídeos (IPs) e esfingolipídeos 7, 8. Embora a polimerização da actina é ditada por uma acumulação local de fosfoinositol-4,5-bifosfato (PI (4,5) P 2) na base do copo fagocitária, actina despolimerização depende da conversão de (PI (4,5) P 2 a fosfoinositol-3,4,5-bifosfato (PI (3,4,5) P 3) 3, 9. Ambas as modificaçõessão essenciais como os antigos leva a extensão bem sucedida de pseudopods ao redor do alvo e este último permite afundar de partículas no citosol da phagocyte 10. As células que possuem a capacidade de fagocitar ou são fagócitos profissionais, como macrófagos / monócitos, granulócitos neutrófilos, / e células dendríticas (CDs) ou os fagócitos não profissional, tais como fibroblastos e células epiteliais 11. A fagocitose realizada por todos os fagócitos desempenha um papel central na manutenção e remodelação de tecidos, enquanto que a fagocitose realizada pelos fagócitos profissionais é responsável pela coordenação da resposta imune inata e adaptativa contra os agentes patogénicos. fagócitos profissionais que não apenas engolir e matar o patógeno, mas também apresentam antigénios às células linfóides do sistema imunitário adaptativo. Isso contribui para a liberação de citocinas pró-inflamatórias e ao envolvimento de células linfóides, portanto, levando ao bloqueio de sucesso de infecção de 12. técnicas bioquímicas convencionais têm sido fundamentais para ganhar conhecimento sobre o mecanismo molecular de diferentes processos celulares durante a fagocitose, tais como modificações pós-translacionais e diversas associações de alta afinidade entre proteínas. No entanto, é difícil a obtenção de informações sobre as dinâmicas temporais e espaciais de eventos fagocíticas usando os métodos bioquímicos convencionais. imagens de células vivas não só nos permite monitorar eventos celulares de uma forma sensível tempo, mas também nos permite obter informações em um nível única célula. Descrevemos aqui um método para investigar os diferentes estágios de fagocitose, bem como para analisar todo o processo de espaço-temporalmente utilizando microscopia confocal.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Tecnologia de sinalização celular&nbsp;</td><td>9998</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilindo, dilactato)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP-231-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s Águia Mínima' s meio)</td> <td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x (solução salina tamponada com fosfato)</td> <td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>Contas de látex revestidas com IgG acopladas a FITC</td><td>Cayman</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM (100x)</td> Solução de paraformaldeído <td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>(4% em PBS)</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-penicillin-streptomycin-10-000-u-ml-3/15140122">15-140-122</a></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 células</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (Roswell Park Memorial Institute)</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Solução azul de tripano (0,4% (p/v) em PBS)</td><td>Corning cellgro</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (1x) (0,05%)</td><td>Solução Detergente ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Surfact-Amps</td><td>ThermoFisher</td><td>&nbsp; 85114</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan-Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>Z23374</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Cobertura de Borosilicato com Câmara 1.0 (8 câmaras)</td><td>ThermoFisher</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de vidro 10 com grades</td><td>Hycor</td><td>87144</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizando os estágios iniciais da fagocitose

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

O corpo dos mamíferos está equipado com várias camadas de mecanismos que ajudam a defender de invasões de patógenos. Fagócitos profissionais do sistema imunitário - neutrófilos, tais como células dendríticas, macrófagos e - manter a capacidade inata para detectar e eliminar tais agentes patogénicos invasores através de fagocitose 1. Fagocitose envolve eventos coreografia de reorganização da membrana e remodelação da actina na superfície da célula 2, 3. Fagócitos internalizar com sucesso e erradicar moléculas estranhas somente quando todas as fases de fagocitose são cumpridas. Estas etapas incluem o reconhecimento e a ligação do patogénio pelos receptores de reconhecimento de padrões (SRRS) residem na superfície celular, formação de copo fagocítica através de saliências membranosas enriquecido-actina (pseudópodes) para envolver as partículas, e cisão do fagossoma seguida de maturação fagolisossomo que resulta namatando do patógeno 3, 4. Imagem e quantificação de vários estágios de fagocitose é instrumental para elucidar os mecanismos moleculares deste processo celular. O presente manuscrito relata métodos para estudar as diferentes fases de fagocitose. Nós descrevemos uma abordagem baseada em microscópio para visualizar e quantificar a, formação de copo fagocitária de ligação, ea internalização de partículas pelos fagócitos. Como fagocitose ocorre quando os receptores inatos em células fagocíticas encontrar ligandos-alvo numa partícula maior do que 0,5 fim, os ensaios aqui apresentados compreendem a utilização de fungos patogénicos Cândida albicans e outras partículas, tais como grânulos zimosano e IgG-revestidos.

método baseado em microscópio para monitorizar as diferentes fases da fagocitose é apresentada. Os diferentes eventos durante a fagocitose de várias partículas fluorescentes por células DC2.4 são mostrados. Utilizando as técnicas descritas aqui, foram investigados o papel de esfingolípidos nas fases iniciais de fagocitose. Para este fim, células dendríticas DC2.4 geneticamente deficientes em Sptlc2, a enzima que catalisa o primeiro e limitante da velocidade passo na via de biossíntese dos esfingolípidos, foram usadas. E...

Aqui descrevemos uma técnica baseada em microscópio para visualizar e quantificar as primeiras cascatas de eventos durante a fagocitose de patógenos como os fungos Candida albicans e partículas maiores que 0,5 μm, incluindo zimosana e grânulos revestidos de IgG.

Visualizando os estágios iniciais da fagocitose

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

O objetivo desta técnica é monitorar os diferentes estágios da fagocitose usando um microscópio confocal. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das interações entre patógenos. Principalmente para entender como os patógenos entram nas células hospedeiras durante a infecção.A principal vantagem dessa técnica é que ela é simples e nos permite obter informações sobre a célula do vírus de nossos eventos que ocorrem durante a fagocitose de maneira sensível ao tempo. Para começar, prepare o zimosano conjugado com fluorescência conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. No dia anterior, semeie cerca de cinco vezes 10 elevado à quarta célula DC 2,4 em uma lâmina de câmara, de modo que os poços estejam 60 a 70% confluentes no momento do experimento.Quando as células estiverem em uma densidade adequada, coloque a lâmina da câmara a 10 graus Celsius por 10 minutos. O resfriamento das células é necessário para bloquear a endocitose, bem como quando alternar a citose. E, posteriormente, ter uma fagocitose sincronizada.Em seguida, remova suavemente o meio de cada poço usando uma pipeta ou aspirador. Em seguida, misture o zimosano conjugado fluorescentemente com o meio de cultura de células em uma multiplicidade de uma infecção de 10. Em seguida, adicione 500 microlitros de meio em cada poço da câmara para garantir que todas as células sejam cobertas.Em seguida, gire a lâmina da câmara para aumentar os contatos entre as partículas nas células e sincronizar o processo de ligação. Após a centrifugação, transfira a lâmina da câmara para uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de CO2. Após cinco minutos a 37 graus Celsius, remova a lâmina da câmara da incubadora e aspire o meio.Em seguida, lave as células três vezes com PBS gelado. Após a lavagem final, verifique a presença de partículas não ligadas com um microscópio óptico e faça lavagens adicionais, se necessário. É essencial remover partículas não ligadas dos poços para minimizar o ruído de fundo durante a análise.Em seguida, fixe as células adicionando 500 microlitros de paraformaldeído a quatro por cento em PBS aos poços e incubando-as por 30 minutos em temperatura ambiente. Depois de fixar as células, lave-as adicionando 500 microlitros de PBS em cada câmara e, em seguida, aspirando suavemente a solução. Repita a etapa de lavagem mais duas vezes.Após a terceira rodada de lavagem, interrompa a reação adicionando 500 microlitros de cloreto de amônio 50 milimolar em PBS às células e incubando-as por 10 minutos. Em seguida, lave as células em 500 microlitros de PBS em temperatura ambiente. Em seguida, permeabilize as células adicionando 500 microlitros de tampão de ligação a cada poço e incubando as células por 30 minutos em temperatura ambiente.O próximo passo é corar para F-actina adicionando faloidina conjugada fluorescentemente às células e incubando-as por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, lave as células três vezes com 500 microlitros de PBS. Por fim, capture imagens usando um microscópio confocal e analise as imagens usando o ImageJ.Para medir a captação de zimosana, prepare lâminas de câmara com células, conforme mostrado no ensaio de ligação. Após as etapas de resfriamento e rotulagem, transfira a lâmina da câmara para uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com cinco por cento de CO2. E incubar as células para diferentes pontos de tempo.Corrija as células após 30, 60 e 90 minutos após a infecção. Certifique-se de otimizar esses pontos de tempo com base no respectivo tipo de célula e partículas fluorescentes usadas. Em seguida, analise as imagens usando o ImageJ.A captação bem-sucedida é caracterizada por uma internalização completa de uma partícula dentro do citoplasma de um fagócito. Para começar, prepare uma câmara ambiental de estágio de microscópio aquecendo-a a 37 graus Celsius e equilibrando a câmara com 5% de CO2. Aguarde de 30 a 45 minutos para que a temperatura e o CO2 se estabilizem antes de fazer a imagem.Ver o CO2 e os níveis de temperatura é fundamental para a fagocitose, pois é importante ligar o aquecedor do microscópio antes do experimento para equilibrar o ambiente dessa câmara. Em seguida, prepare lâminas de câmara com células DC 2.4 que estabilam expressam mCherry F-actina conforme mostrado no ensaio de ligação. Seguindo as etapas de arrulho e rotulagem, transfira a lâmina da câmara da centrífuga diretamente para um estágio de microscópio pré-aquecido.Finalmente, realize imagens ao vivo usando um microscópio confocal de varredura a laser, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha, não apenas para capturar o movimento e a dinâmica da rede de F-actina, mas também para visualizar os diferentes eventos fagocíticos dentro das células vivas. As células mostradas aqui em verde são uma célula DC 2.4 do tipo selvagem que está sendo infectada com BFP canadense, que é mostrada em vermelho. A imagem de lapso de tempo é usada para visualizar os estágios iniciais da fagocitose e é mostrada aqui em intervalos de 30 segundos.Os locais indicados pelo asterisco são onde a remodelação da actina está ocorrendo. Todo o processo ocorre em questão de minutos. Aqui, o papel dos esfingolipídios foi avaliado por seu papel nos estágios iniciais da fagocitose.Usando essa técnica, os esfingolipídios foram considerados essenciais para a ligação de candida albicans às células e reduziram a fagocitose geral. Essa redução da ligação fagocitótica também foi demonstrada para a ligação das células DC 2.4 aos zimosanos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar imagens ao vivo para estudar o estágio inicial da fagocitose.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma a duas horas se for executada corretamente. Após esse procedimento, a fagocitose de outros patógenos, incluindo bactérias e parasitas, pode ser realizada para entender a intrincada relação entre as células imunes e esses patógenos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia celular explorarem a endocitose mediada por receptores, incluindo fagocitose e macropinocitose em células imunes.

visualizing-the-early-stages-of-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra um ensaio para monitorar eventos independentes de fagocitose de glóbulos vermelhos mediados por macrófagos. As hemácias humanas opsonizadas com imunoglobulina G (IgG) de camundongo são incubadas com macrófagos de camundongo e observadas em microscópio confocal. As hemácias são engolfadas por macrófagos por meio de uma formação de copo fagocítico e direcionadas para degradação lisossômica.

Imagem em tempo real da fagocitose de macrófagos de glóbulos vermelhos opsonizados por IgG

Este vídeo demonstra uma técnica de microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) de alta resolução para visualização em tempo real da formação e fechamento de fagossomos durante a fagocitose mediada por macrófagos de glóbulos vermelhos opsonizados (RBCs) opsonizados por IgG presos à superfície de um prato de fundo de vidro. Os macrófagos estendem os pseudópodes ao redor das hemácias e os engolfam dentro dos fagossomos, destacando-os da superfície do vidro.

Visualização baseada em microscopia TIRF da formação e fechamento de fagossomos

Descrevemos métodos para live-célula vídeo de...

Live-célula Microscopia vídeo de Fagocitose patógeno fúngico

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Estudo da fagolisossomo Biogenesis em macrófagos ao vivo

Aqui apresentamos um protocolo para quantificar a fagocitose de partículas fluorescentes por linhagem celular de macrófagos aderentes usando um método fluorométrico. Este método facilita uma quantificação de alto rendimento da internalização de partículas, bem como a polimerização de actina resultante.

Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização

Descrevemos uma configuração experimental para visualizar com alta resolução sem precedentes a formação e fechamento de fagossomos em três dimensões em macrófagos vivos, usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Permite o monitoramento da base do copo fagocítico, dos pseudópodes que se estendem, bem como do local preciso da cisão do fagossomo.

&quot;Fagossomo Encerramento Ensaio&quot; para Visualize Formação fagossomo em Três Dimensões Usando Total Internal Reflection Microscopia fluorescente (TIRFM)

Este manuscrito descreve um método simples para medir o pH e phagosomal área, bem como o pH citoplasmática de neutrófilos humanos e de rato utilizando o indicador de medida proporcional seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, ou S-1. Isto é conseguido usando microscopia de fluorescência confocal ao vivo de células e análise de imagem.

Imaging o neutrófilos fagossoma e citoplasma utilizando um indicador de pH Ratiometric

Aqui descrevemos os métodos usando microscopia confocal de fiação disco de imagem única fagocíticas eventos por macrófagos peritoneais residente do rato. Os protocolos podem ser estendidos a outras células fagocíticas.

Time-Lapse imagem em 3D da fagocitose por macrófagos de rato

O mecanismo associado à fagocitose na infecção por Leishmania permanece mal compreendido. Aqui, descrevemos métodos para avaliar os primeiros eventos ocorridos durante a interação da Leishmania com as células hospedeiras.

Investigando a Faagocytose da Leishmania usando Microscopia Confocal

Apresentado aqui é um protocolo para quantificar e produzir imagens dinâmicas de células-tronco mesenquimais (MSC) regulação mediada de fagocitose macrófago (MΦ) de partículas de levedura não opssonizada (zymosan) que são conjugadas a uma molécula fluorescente sensível ao pH.

Regulação de células-tronco mesenquimais da fagocitose macrófago; Quantitação e Imagem

Este estudo elucida o processamento fagocítico de partículas de Godanti Bhasma (GB) em células de mamíferos, caracterizando sua captação celular, dinâmica de vacúolos, acidificação e degradação. Essas descobertas não apenas avançam nossa compreensão dos mecanismos fundamentais de fagocitose, mas também estabelecem o GB como um sistema modelo promissor para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.

Explorando os eventos celulares sequenciais de fagocitose desencadeados por Godanti Bhasma em células de mamíferos

Aprenda a visualizar os estágios iniciais da fagocitose usando microscopia confocal com células DC 2.4. Este método simples permite monitorar em tempo real a entrada de patógenos como Candida albicans em células hospedeiras.

Visualizando os estágios iniciais da fagocitose

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