Name: Injecção Intrarenal de Escherichia coli Em um modelo de rato de peleonefrite (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Aprenda a injeção intrarrenal de Escherichia coli em um modelo cirúrgico de rato para pielonefrite sem refluxo renal. Este método permite estudar patogênese, inflamação e fibrose de forma confiável.

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Os autores gostariam de agradecer o apoio do NIH/NIDDK K12 DK100014 (Lan Lu), do Case Comprehensive Cancer Center (NIH/NCI P30 CA43703) e do Clinical and Translation Science Collaborative de Cleveland (NIH/NCATS UL1 TR000439).

Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados do Comitê de Uso e Cuidados de Animais Institucionais (IACUC) na Case Western Reserve University. A duração do procedimento cirúrgico descrito abaixo é de aproximadamente 45-60 min. O procedimento de ressonância magnética em si é de aproximadamente 15 min para cada ponto do tempo. 1. Anestesia <ol><li> Anestesiar o rato na câmara de isoflurano ajustada a 2% de isoflurano misturado com oxigênio para facilitar o manuseio e restrição de animais antes da administração de anestesia injetável intraperitoneal. </li><li> Após 3-5 minutos de exposição ao isoflurano, verifique se o animal é anestesiado e não exibe resposta à pitada do dedo do pé. </li><li> Mais rato sedado com injeção intraperitoneal de uma mistura de xilazina e cetamina: 75 mg / kg de cetamina / 10 mg / kg de xilazina. Ao realizar injeções intraperitoneais, retire a agulha para garantir que partes do intestino ou outros órgãos vitais não tenham sido perfurados. </li><li> EuNjeção 2 mg / kg de bupivacaína subcutaneamente no local da incisão para fornecer alívio da dor tópica. </li></ol> 2. Preparação da área cirúrgica <ol><li> Esterilizar instrumentos e suprimentos cirúrgicos antes de serem utilizados para cirurgia e colocar na almofada cirúrgica para esterilidade. A maioria dos instrumentos e suprimentos podem ser autoclavados e reutilizados. </li><li> Use luvas estéreis para todos os procedimentos cirúrgicos. </li><li> Use uma lâmina elétrica para raspar a pele do lado direito do animal. Raspar o animal do fundo da caixa torácica até o topo da perna traseira proporcionando uma grande área livre de cabelo para a incisão. </li><li> Coloque o animal em uma almofada cirúrgica estéril para isolar a área desinfectada das áreas circundantes. </li><li> Esfregue a pele com um desinfetante, como povidona iodo ou betadina. Comece a esfregar no centro do local cirúrgico e se mova para o exterior de forma circular. Repita pelo menos três vezes com uma nova limpeza de povidona iodo ou betadina. </Li&gt; <li> Esfregue o local cirúrgico com 70% de cotonete com álcool até a pele ficar clara, pois o iodo pode ser tóxico se for absorvido. </li></ol> 3. Procedimento cirúrgico <ol><li> Mantenha este procedimento em condições assépticas. </li><li> Posicione o animal anestesiado em uma cama de aquecimento quente na posição de decúbito lateral esquerdo com o flanco direito voltado para cima. NOTA: Deve-se ter cuidado para manter a temperatura corporal central do animal a 35-37 ° C para prevenir a hipotermia. Esta cama de aquecimento também deve ser esterilizada conforme necessário para manter condições assépticas. </li><li> Sinta-se para a caixa torácica e faça uma pequena incisão retroperitoneal dorsal direita de 2-3 cm usando uma lâmina de bisturi esterilizada de tamanho 10 começando no fundo da caixa torácica. </li><li> Coloque a gaze estéril longitudinalmente ao longo de cada lado da incisão. </li><li> Dissecte o tecido subcutâneo, gordura e músculos para visualizar e acessar a cavidade abdominal. Use tesoura de ponta curvada para permitir uma penetração mais profundaRacionar em ferida e cortar tecidos grossos. </li><li> Uma vez que o fígado é claramente visível e acessível, use fórceps sem corte para retrair o fígado para cima. </li><li> Usando outro par de fórceps contundentes, por outro lado, exponha o rim direito, então fica sentado fora da cavidade abdominal. </li><li> Use o ponteiro do dedo e o polegar da mão esquerda para segurar o rim na posição. Com a mão direita, injete lentamente e de forma constante 0,1 ml de solução de E. coli UTI89 (concentração entre 1 x 10 8 -1 x 10 9 ) de uma seringa estéril para a pelve renal (que aparece como uma bolha branca) 15 . NOTA: Prepare o título bacteriano conforme descrito na referência 15 . </li><li> Coloque uma tira de hemostato absorvível sobre a agulha para evitar a saída de inóculo no peritoneu. Puxe lentamente a agulha para fora da pelve renal. NOTA: Deve-se ter cuidado para não perfurar ou infectar os tecidos circundantes, resultando em infecções fora do alvoOns e / ou complicações. </li><li> Use uma seringa maior para enxaguar completamente o rim com solução salina normal antes de colocá-lo de volta na cavidade abdominal. </li></ol> 4. Suturas Nota: A sutura que será enterrada nos tecidos deve ser 4-0 sutura trançada não absorvível. Suturas absorventes ou monofilamentos podem ser utilizadas para superfícies do corpo. <ol><li> Coloque as suturas de forma uniforme e tão perto da borda do tecido quanto possível para evitar a obstrução do fluxo sanguíneo; Normalmente não é necessário mais de 0,3 cm da borda. </li><li> Segure a pele e evite-a ligeiramente usando um par de fórceps com dentes finos e gire o suporte da agulha em uma posição pronada em preparação para perfurar a pele. </li><li> Dirija a agulha através da espessura total da pele, supinando o pulso para girar a agulha e passá-la através da pele. </li><li> Repita este processo para a borda da pele mais próxima do indivíduo que executa o procedimento. </li><li> ApertarAs suturas são suficientes para se opor às bordas dos tecidos. Qualquer mais apertado irá obstruir o suprimento de sangue, cicatrização lenta e pode resultar em deiscência. </li><li> Amarre a sutura usando nós quadrados, como se fosse um simples ponto interrompido, exceto que apenas a corda curta é cortada, deixando cerca de uma cauda de 3-4 mm. </li><li> Após o primeiro ponto ter sido amarrado, prepare-se para colocar um segundo ponto a cerca de 3 mm de distância do primeiro e continue com a sutura em execução. </li><li> Uma vez que o fim da incisão é atingido, não puxe o último ponto completamente. Em vez disso, use o loop que está sendo mantido com o suporte da agulha aqui como a corda curta para amarrar a extremidade distal do fechamento da sutura. </li><li> Usando laços do instrumento, amarre a sutura usando nós quadrados. Isso resulta em 3 strands que sobrescrevem do nó preenchido na extremidade distal. </li></ol> 5. Recuperação de animais <ol><li> Injete 2,1 mg / kg de Yohimbina intraperitonealmente após a cirurgia para reverter a anestesia. UMAEspera-se que os nimais se recuperem completamente do procedimento cirúrgico após 3-5 horas. </li><li> Mantenha o animal em uma almofada de aquecimento (para evitar hipotermia) e roupa de cama suave absorvente após a cirurgia. </li><li> Fornecer reidratação com líquidos orais ou parenterais até que ele possa retornar à alimentação normal (dentro de 24 horas). Injetar aproximadamente 0,6 ml de solução salina normal peritonealmente imediatamente após a cirurgia para limitar os efeitos de desidratação. </li><li> Forneça analgesia conforme descrito no protocolo de uso e cuidado de animais aprovado pela IACUC. Injete 5 mg / kg de carprofen por via subcutânea para o tratamento da dor. </li><li> Monitorar incisões regularmente para inchaço, exsudato, dor ou deiscência. </li></ol> 6. Validação por imagem de Ressonância Magnética <ol><li> Realizar i n vivo em experiências MRI alto campo animal pequeno ressonância magnética. </li><li> Induzir anestesia com 3% de isoflurano em oxigênio e posicionar o animal com o rim direito no isocentro no scanner MRI e apropriadoComia bobina de radiofrequência. Fornecer animais com 1-2% de anestesia com isoflurano continuamente ao longo do procedimento de imagem por meio de uma nosecone. NOTA: Para as imagens de MRI in vivo mostradas na Figura 1 , utilizou-se uma bobina de volume de tamanho de rato (diâmetro interno = 72 mm). </li><li> Use um sistema de monitoramento e controle de animais para manter a taxa de respiração de cada animal (40-60 respirações / min) e temperatura corporal central (35 ± 1 ° C). </li><li> Use uma aquisição de MRI de eco de rotação multi-fatia e multi-eco para obter imagens ponderadas axiais de alta resolução de ambos os rins infectados e de controle. Os parâmetros típicos de aquisição de MRI são o tempo de repetição = 5,000 ms, tempo de eco = 40 ms, espessura da fatia = 2,0 mm, resolução espacial no plano = 200 μm, 3 médias de sinal e um tempo de aquisição de 8 min. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm outras divulgações.

A pielonefrite aguda ascendente em roedores (por exemplo, ratos e ratos) pode ser produzida por cateterismo transuretral. 16 , 17 , 18 Este método de infecção transuretral é vantajoso por não ser invasivo e simula a fisiopatologia humana da infecção ascendente. 17 , 18 , 19 , 20 No entanto, e...

Os modelos de roedores têm sido utilizados para estudar numerosas manifestações de doenças humanas, incluindo pielonefrite e infecções do trato urinário (UTI). As UTIs são um problema de saúde global e podem afetar crianças, homens e mulheres de todas as idades. 1 , 2 , 3 A manifestação inicial de UTIs inclui cistite, e se a infecção ascende ao longo do ureter, pode ocorrer uma infecção renal (pielonefrite). Ao mesmo tempo, a prevalência de diabetes está se aproximando de 400 milhões de pessoas em todo o mundo. 4 , 5 Importante, a incidência de UTI pode ser até 4 vezes maior em pacientes obesos ou com diabetes mellitus tipo 2, resultando em maior risco de infecção recorrente de UTI (rUTI), sepse, fibrose renal de pielonefrite e disfunção da bexiga. 6 , 7 , 8 RoedorOs modelos são importantes no estudo de UTI, porque as terapias antibióticas atuais produzem uma resposta preventiva sustentada somente em um subconjunto de pacientes com UTI. Para melhorar o atendimento clínico de UTI, os principais passos são compreender o mecanismo da rUTI e seus processos fisiopatológicos de infecção aguda a inflamação à fibrose, bem como o impacto do diabetes mellitus tipo 2. O objetivo de melhorar os modelos animais é desenvolver técnicas que permitam uma avaliação mais precisa da progressão da doença e das intervenções terapêuticas. Várias abordagens diferentes foram empregadas para induzir pielonefrite em ratos e / ou camundongos para estudar a fisiopatologia do dano renal, o efeito do tratamento antibiótico e outros aspectos do curso natural das UTIs. Uma abordagem comum para estabelecer UTI retrógrada é o cateterismo transuretral. 10 , 11 , 12 , 13 &lt;/ Sup&gt; Este método introduz bactérias através da uretra na bexiga urinária de animais anestesiados. Embora esta técnica simula de perto a pielonefrite humana, a incidência real e a magnitude da infecção por pielonefrite podem ser altamente variáveis ​​devido a múltiplos fatores, incluindo a falta de refluxo ureteriano espontâneo ou micção urinária durante ou imediatamente após a inoculação. 11 Como resultado, a variabilidade experimental na indução de uma infecção de pielonefrite ascendente pode limitar a utilidade deste modelo para estudar infecções renais, bem como estratégias terapêuticas. Este relatório descreve um modelo de rato de pielonefrite cirúrgico onde E. coli é diretamente injetado no rim do rato. Apesar de este modelo de rato ser invasivo, a quantidade de E. coli administrada ao rim pode ser efetivamente controlada, possibilitando uma infecção e inflamação robusta do rim. 14 Dentro deste procedimento, também descrevemosComo essas infecções renais induzidas podem ser monitoradas longitudinalmente com a Ressonância Magnética In vivo (MRI).

<table><tbody><tr><td>Absorvente</td><td>Fisher</td><td>14-127-47</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de Gaze de Algodão Estéril Fisher</td><td></td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Luvas Cirúrgicas de Látex</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>21540</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Mayo Curvada</td><td>Fisher</td><td>S17341</td><td></td></tr><tr><td>Reta Blunt Foreceps</td><td>Fisher</td><td>08-895</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de bisturi&nbsp;</td>Lâminas de Bisturi <td>Estéreis Fisher</td><td>08-913-5</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Luer-Lok</td><td></td><td></td> Fisher 53220 <td></td>1 ml BD Biosciences 309628 Para injeções bacterianas</tr><tr><td></td><td></td><td></td> Seringa Luer-Lok de 20 ml&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>301031</td><td>Para lavagem salina</td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Seneca Medical</td><td>240267</td><td></td></tr><tr><td>23 G 3/4 pol. Agulha&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>305143</td><td></td></tr><tr><td>30 G 1 pol. Agulha&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de Insulina U-100</td><td>Exel International&nbsp;</td><td>25846</td><td>Para injeções de medicamentos</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein Saúde Animal</td><td>050033</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Henry Schein Saúde Animal</td><td>33197</td><td>Injetar IP</td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Patterson Vetrinário&nbsp;</td><td>07-881-9413</td><td>Injetar IP</td></tr><tr><td>Yohimbine (Atipamezole)</td><td>Patterson Vetrinary&nbsp;</td><td>07-867-7097</td><td>Injetar IP após cirurgia</td></tr><tr><td>Bupivacaína (Marcaína)</td><td>Patterson Vetrinary&nbsp;</td><td>07-890-4584</td><td>Injete SQ no local da incisão&nbsp;</td></tr><tr><td>4-0 Sutura Intestinal Crômica</td><td>Ethicon Inc.</td><td>U203H</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Sutura Vicryl Trançada</td><td>Ethicon Inc.</td><td>J304H</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Seringa SubQ</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>E. coli&nbsp; UTI89 ou CFT073</td><td>ATCC</td><td>700928</td><td></td></tr><tr><td>Surgicel Hemostat Absorvível</td><td>Ethicon Inc.</td><td>ETH1951CS&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Biospec 9.4T MRI&nbsp;</td><td>Bruker&nbsp;</td><td>94/20 USR</td><td></td></tr></tbody></table>

injecção intrarenal de escherichia coli em um modelo de rato de peleonefrite

Intrarenal Injection of Escherichia coli in a Rat Model of Pyelonephritis

A pielonefrite é uma infecção bacteriana do rim e é mais comumente causada por Escherichia coli. Infecções recorrentes podem causar inflamação renal significativa e fibrose, resultando em declínio da função renal. Antes que o melhor manejo clínico e a prevenção da pielonefrite possam ser instituídos, um modelo animal confiável deve ser estabelecido para estudar os mecanismos de progressão, recorrência e eficácia terapêutica. O modelo de infecção transuretral imita de perto a pielonefrite humana, mas exibe uma variação considerável devido à sua dependência do refluxo uretral para transportar a bactéria para o rim. Aqui, um protocolo cirúrgico detalhado para a realização de injeções bacterianas na pelve renal de ratos é fornecido e confirmado por ressonância magnética (MRI) não invasiva. Usando este protocolo, os animais recebem exposição direta a uma concentração desejada de bactérias E. coli e podem se recuperar totalmente do procedimento cirúrgico com cuidados pós-operatórios adequados. Isso facilita as avaliações longitudinais subsequentes de ressonância magnética dos modelos animais experimentais para comparação com controles salinos (simulados). Usando essa abordagem de entrega direta, a gravidade da infecção é controlável e aplicável para estudos mecanicistas de progressão, bem como para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento.

As técnicas de imagem médica oferecem a oportunidade de avaliar de forma não invasiva UTI e eficácia terapêutica. Portanto, a RM foi utilizada para validar a indução de infecção aguda após a injeção de 1-2 x 10 7 UTI89 E. coli e para visualizar as alterações no rim antes e após a cirurgia. A Figura 1a-b mostra uma região progressivamente crescente de infecção renal (setas amarelas). As imagens de ressonância magnética obtidas para cada animal nos dias...

Este manuscrito descreve um modelo cirúrgico de pielonefrite em ratos usando infecção intra-renal direta por Escherichia coli na pelve renal. O procedimento experimental pode ser utilizado para estudar a patogênese da pielonefrite, bem como a inflamação e fibrose associadas.

Injecção Intrarenal de Escherichia coli Em um modelo de rato de peleonefrite

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal ...

O objetivo geral deste modelo cirúrgico de peilonefrite em ratos é fornecer um método que não exija refluxo renal, que é usado em outros modelos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo médico, como a melhor forma de administrar a antibioticoterapia, como podemos monitorar os efeitos de infecções recorrentes ou infecções residuais após a terapia que podem levar à recorrência. A principal vantagem dessa técnica é que esse modelo aplica bactérias diretamente ao rim em uma quantidade razoavelmente confiável, sem a necessidade de refluxo renal, o que pode adicionar alguma variabilidade em termos de infecção.Antes de iniciar este procedimento, prepare o bolus de injeção bacteriana contendo entre um milhão e 10 milhões de células. Depois de anestesiar o rato e preparar sua pele para a cirurgia, aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento. Posicione o rato em uma plataforma cirúrgica aquecida em decúbito esquerdo com o flanco direito voltado para cima.Esfregue a pele com um desinfetante. Repita três vezes e depois esfregue o local da cirurgia com troca de álcool a 70% até que a pele esteja limpa. Para iniciar a cirurgia, usando um bisturi número 10, faça uma pequena incisão retroperitoneal dorsal direita de dois a três centímetros, começando na parte inferior da caixa torácica.Continue dissecando o tecido subcutâneo, a gordura e os músculos para visualizar e acessar a cavidade abdominal. Quando o fígado estiver claramente visível e acessível, use uma pinça embotada para retraí-lo para cima. Em seguida, usando um segundo par de pinças embotadas, exponha o rim direito para que ele fique fora da cavidade abdominal.Agora, posicione o rim para injeção na mão não dominante. Usando a mão dominante, direcione com precisão a agulha de injeção na pelve renal. Em seguida, injete lenta e continuamente 0,1 mililitros de solução bacteriana ou salina.Aqui, a solução salina está sendo injetada. O bolo alimentar parecerá uma bolha branca no tecido. Antes de retrair a agulha, coloque uma tira de hemostático absorvível sobre o local da injeção para evitar que o inóculo saia para o peritônio.Em seguida, puxe lentamente a agulha para fora. Agora, usando uma seringa grande, enxágue bem o rim com solução salina normal. Em seguida, retorne o rim à cavidade abdominal.Para o fechamento do sítio cirúrgico, use suturas absorvíveis ou monofilamentares no tecido corporal e suturas trançadas 4-0 não absorvíveis nas superfícies corporais. Para colocar suturas, comece no local mais distante do operador, usando pinças de dentes finos para agarrar a pele e evitá-la ligeiramente. Em seguida, gire o porta-agulha para uma posição pronada e supine o pulso para girar a agulha e conduzi-la por toda a espessura da pele.Aperte a sutura apenas o suficiente para expor as bordas do tecido. Qualquer aperto obstruirá o suprimento de sangue e, assim, retardará a cicatrização da ferida e possivelmente resultará em deiscência. Em seguida, amarre a sutura com um nó quadrado, como se fosse um simples ponto interrompido, exceto que apenas o fio curto é cortado, deixando uma cauda de três a quatro milímetros.Agora, colocando cada ponto subsequente a cerca de três milímetros do anterior, continue a sutura contínua. Quando o final da incisão for alcançado, não puxe o último ponto completamente. Em vez disso, use o laço que está sendo segurado pelo porta-agulha como o fio curto e amarre a extremidade distal do fechamento da sutura.Agora, usando laços de instrumento, amarre a sutura usando nós quadrados. O resultado serão três fios saindo de um nó completo. Depois de fornecer analgésicos e uma injeção peritoneal de 0,6 mililitro de solução salina normal, observe o animal enquanto ele se recupera da anestesia em uma almofada de aquecimento com cama macia absorvente.Nas primeiras 24 horas de recuperação, reidratar o animal com fluidos orais ou parenterais até que ele possa retornar à alimentação normal. Depois disso, monitore regularmente a incisão quanto a inchaço, exsudato ou deiscência e forneça analgésicos para a dor, conforme necessário. Uma infecção aguda por peilonefrite foi induzida pela injeção de um milhão e 10 milhões de células UT189 E.coli no modelo de roedor.A ressonância magnética do rim mostrou um aumento progressivo na região da infecção de um a quatro dias após a injeção. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 30 minutos se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de verificar os animais após a cirurgia para observar sinais de infecção por E.Coli fora do rim, especialmente nos pontos de incisão, para garantir que os animais não se tornem excessivamente sépticos.Após esse procedimento, outros métodos, como ressonância magnética, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como: a infecção é viável, com que rapidez a infecção está crescendo e essa terapia é eficaz?

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fonte: Conover, M. S. et al., Estabelecimento e Caracterização de ITU e CAUTI em um Modelo de Camundongo. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra a detecção de comunidades bacterianas intracelulares (IBCs) em tecido bexiga de camundongos infectados com Escherichia coli que expressa β-galactosidase. Após fixação tecidual, permeabilização e coloração com X-gal, os IBCs aparecem como pontos azuis sob um microscópio dissecante, confirmando a invasão bacteriana durante infecção urinária.

Visualizando Comunidades Bacterianas Intracelulares em uma Bexiga de Camundongo Infectada

Fonte: Gupta, K., et al. Injeção intrarrenal de Escherichia coli em um modelo de rato para pielonefrite.  J. Vis. Exp. (2017).Este vídeo demonstra a injeção intrarrenal de E. coli na pelve renal de um rato anestesiado para induzir uma infecção renal localizada, modelando a pielonefrite aguda. Ele destaca etapas cirúrgicas chave e técnicas assépticas necessárias para estabelecer um modelo de infecção reprodutível in vivo para análise posterior.

Injeção Intrarrenal de E. coli na pelve renal de um rato

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Modelo de Geração de Infecção do Trato Urinário: Uma Técnica para Administrar Bactérias Uropatogênicas em Camundongos para Desenvolver Modelo de Infecção do Trato Urinário

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Cateterismo transuretral e inoculação bacteriana para gerar um modelo de infecção do trato urinário em camundongos machos

Estabelecimento de um Modelo de Infecção do Trato Urinário em Camundongos Fêmeas

Aqui, é descrito um procedimento para o estabelecimento de uma infecção sistémica no rato neonatal com culturas de Escherichia coli K1. Este procedimento não-invasivo permite a colonização do tracto gastrointestinal, a translocação do agente patogénico para a circulação sistémica, e invasão do sistema nervoso central no plexo coróide.

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Aprenda a injeção intrarrenal de Escherichia coli em um modelo cirúrgico de rato para pielonefrite sem refluxo renal. Este método permite estudar patogênese, inflamação e fibrose de forma confiável.

Injecção Intrarenal de Escherichia coli Em um modelo de rato de peleonefrite

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