Induzida Geração Stem Cell pluripotentes a partir de células de sangue com o vírus Sendai e centrifugação
21 de dezembro de 2016
Propomos um protocolo para reprogramação de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Ao plaquear as células sanguíneas transduzidas em placas revestidas com matriz com centrifugação, as iPSCs são induzidas com sucesso a partir de células flutuantes. Esta técnica sugere um protocolo de reprogramação simples e eficaz para células como PBMCs e CBMCs.
O objetivo geral deste estudo é reprogramar células mononucleares do sangue periférico em células-tronco pluripotentes induzidas, usando plaqueamento seriado por centrifugação. Originalmente, as iPSCs foram geradas pela reprogramação de fibroblastos. Hoje, vários são usados para reprogramação.
No entanto, devido à acessibilidade do sangue, as PBMCs podem ser uma fonte celular não aceita para aplicação adicional de iPSCs, na triagem de drogas, modelagem de teses e desenvolvimento de medicina regenerativa. Por meio do estudo, compartilharemos um protocolo sobre a reprogramação de iPSCs usando PBMCs adicionando força centrífuga. Este protocolo fornecerá outra opção ao reprogramar células flutuantes.
Demonstrando o procedimento, usaremos Nam, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para isolar as células monocíticas, primeiro obtenha pelo menos dez mililitros de sangue fresco de uma coleta de sangue em um tubo de preparação de células. Em seguida, transfira o sangue para um novo tubo cônico de 50 mililitros e dilua-o com PBS estéril na proporção de um para quatro.
Depois, adicione dez mililitros de meio de gradiente de densidade a um novo tubo cônico de 50 mililitros e coloque cuidadosamente o sangue diluído em cima do meio de gradiente de densidade. Em seguida, centrifugue a amostra a 750 vezes g por 30 minutos à temperatura ambiente, sem interrupção da centrifugação. Após 30 minutos, transfira cuidadosamente a camada buffy para um novo tubo cônico de 50 mililitros.
Adicione 30 mililitros de PBS e lave as células. Em seguida, centrifugue as células a 515 vezes g por cinco minutos à temperatura ambiente. Depois, descarte o PBS e ressuspenda as células em 0,5 mililitros de meio de células sanguíneas.
Em seguida, conte as células e coloque-as em uma placa de 24 poços. Adicione PBS aos poços circundantes para evitar a evaporação. Em seguida, estabilize as células por cinco dias a 37 graus Celsius antes da transdução.
Adicione mais 0,5 mililitros de meio de células sanguíneas frescas no terceiro ao quarto dia, sem perturbar as células. Neste procedimento, transfira as células sanguíneas para um tubo cônico de 15 mililitros e conte-as usando um hemacistômetro. Em seguida, prepare três vezes dez elevado à quinta célula para transdução e centrifugue as células a 515 vezes g por cinco minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, descarte o sobrenadante por sucção e ressuspenda as células em 0,5 mililitros de meio de células sanguíneas. Em seguida, transfira as células para um poço de uma placa de 24 poços não revestida. Descongele a mistura do vírus Sendai no gelo e adicione-a às células suspensas.
Sele a placa com uma película de vedação e centrifugue-a a 1.150 vezes g por 30 minutos a 30 graus Celsius. Após a centrifugação, incube as células a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono durante a noite. Para revestir uma placa de 24 poços com vitronectina, no dia seguinte, dilua a solução de vitronectina em PBS para obter uma concentração final de cinco microgramas por mililitro.
Em seguida, adicione um mililitro de vitronectina a um poço e incube-o em temperatura ambiente, por pelo menos uma hora. Em seguida, remova a solução de revestimento e transfira todos os meios contendo as células e o vírus para o poço revestido. Em seguida, colete as células restantes com mais 0,5 mililitros de meio de células sanguíneas frescas e adicione-as ao poço que contém células.
Em seguida, centrifugue a placa a 1.150 vezes g por dez minutos a 35 graus Celsius e, em seguida, mantenha as células a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono durante a noite. Para a segunda transferência de células, cubra o poço com cinco microgramas por mililitro de vitronectina, conforme descrito anteriormente. Use um poço da placa para cada transdução e transfira a suspensão celular da primeira placa para a placa de vitronectina recém-revestida.
Enquanto isso, adicione um mililitro de meio iPSC a um poço da primeira placa para manutenção e incube-o a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono, com uma troca diária de meio com meio iPSC novo. As colônias aparecerão no dia 14 ao 21, após a transdução. Centrifugar a placa recém-revestida, contendo as células em suspensão, a 1.150 vezes g a 35 graus Celsius durante dez minutos.
Após a centrifugação, incube as células a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono, durante a noite. No dia seguinte, remova o sobrenadante e substitua-o por meio de células-tronco pluripotentes induzidas frescas. Mantenha as células anexadas com a troca diária de meios, até que 80% de confluência seja atingida.
Uma semana antes da colheita da colônia, semeie uma vez dez elevado à quarta célula em um prato de 100 milímetros revestido com vitronectina. Em seguida, prepare um prato de 60 milímetros revestido com vitronectina, adicionando dois mililitros de solução de vitronectina e incube-o em temperatura ambiente por pelo menos uma hora. Observando através de um microscópio, marque as colônias na parte inferior da placa com limites claros usando uma caneta marcadora.
Remova a solução de vitronectina da nova placa e adicione seis mililitros de meio de células-tronco pluripotentes induzidas, suplementado com dez milimolares RHO quinase. Em seguida, remova o meio de cultura das células e lave-as com três mililitros de PBS. Em seguida, adicione um mililitro de solução de desprendimento de colônias iPSC e incube-os por 30 segundos em temperatura ambiente.
Depois disso, remova a solução da placa e incube-a em temperatura ambiente por mais 30 segundos. Após 30 minutos, retire 200 microlitros de mídia da placa e retire as colônias alvo pipetando. Em seguida, transfira as colônias espalhadas para um novo prato de 60 milímetros.
Incubar e manter as células a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono até atingirem a passagem dez. No estágio inicial de reprogramação, as iPSCs foram misturadas com as células diferenciadas não reprogramadas anexadas. Antes da expansão, as iPSCs e outras células eram diferentes para discriminar.
Ao semear as células em baixa densidade, foram obtidas colônias grandes o suficiente para serem colhidas. Após o isolamento da colônia, os aglomerados de células foram dissociados em células únicas e cultura. Colônias puras de iPSC foram vistas posteriormente.
Depois que as células-tronco pluripotentes induzidas puras se expandiram, a qualidade das células foi testada. As células foram coradas com fosfatase alcalina para confirmar o estado indiferenciado das células-tronco pluripotentes induzidas. Todas as colônias derivadas das células-tronco pluripotentes induzidas isoladas apresentaram coloração positiva.
Os marcadores pluripotentes foram confirmados por imunofluorescência. As células reprogramadas expressaram marcadores pluripotentes altamente expressos, como SSEA4, Oct4, Sox2, TRA-1-81, Klf4 e, mais importante, TRA-1-60, a expressão de marcadores pluripotentes foi confirmada por RTPCR. Usando chapeamento serial por centrifugação, a fixação do trânsito usa PBMC em uma placa revestida com métricas.
Os anexos estão pendentes e as colônias de iPSC são repetidas para purificação. Usando este protocolo, o iPSC pode ser gerado a partir de PBMCs dentro de um mês. Este protocolo reduz o tempo necessário para a ligação das células transduzidas e evita a perda de células reprogramadas que não foram capazes de se ligar por conta própria.
No entanto, a purificação de iPSCs formadoras de colônias totalmente reprogramadas pode ser crítica ao tentar este procedimento. Anteriormente, reprogramamos com sucesso PBMCs e células mononucleares usando este protocolo. Os iPCs derivados de células sanguíneas gerados podem ser amplamente utilizados em vários campos de pesquisa.
Este protocolo pode auxiliar no processo de reprogramação de outros tipos de células em suspensão flutuantes, para futuras aplicações e estudos.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para reprogramar células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) utilizando centrifugação. O método aumenta a acessibilidade das PBMCs como fonte viável para iPSCs, que podem ser utilizadas em diversas aplicações, como triagem de fármacos e medicina regenerativa.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Biologia de Células-Tronco
- Reprogramação Celular
- Medicina Regenerativa
Antecedentes
- Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) foram geradas pela primeira vez a partir de fibroblastos.
- Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) são uma fonte celular mais acessível.
- As iPSCs possuem aplicações na triagem de fármacos e na modelagem de doenças.
- Os métodos atuais para reprogramação de PBMCs são limitados.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo simples e eficaz para reprogramar PBMCs em iPSCs.
- Utilizar a força centrífuga para aprimorar o processo de reprogramação.
- Fornecer um método alternativo para trabalhar com células em suspensão.
Métodos Utilizados
- Reprogramação de PBMCs em iPSCs.
- Plaqueamento de células sanguíneas transduzidas em placas revestidas com matriz.
- Aplicação de centrifugação para facilitar a aderência celular.
- Indução de iPSCs a partir de células em suspensão.
Resultados Principais
- Indução bem-sucedida de iPSCs a partir de PBMCs utilizando o protocolo proposto.
- Demonstração da eficácia da centrifugação no processo de reprogramação.
- Potencial para aplicações mais amplas de iPSCs derivadas de PBMCs.
- Oferecimento de uma nova opção para pesquisadores em biologia de células-tronco.
Conclusões
- O protocolo oferece uma abordagem direta para reprogramar PBMCs em iPSCs.
- Este método pode aprimorar o uso de PBMCs em diversas aplicações biomédicas.
- Estudos futuros podem expandir a utilidade desta técnica na medicina regenerativa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a geração eficiente de iPSCs a partir de células mononucleares do sangue periférico, fornecendo uma fonte não invasiva e escalonável para modelagem de doenças e triagem de fármacos. Ao utilizar a centrifugação para aumentar a aderência celular, melhora a eficiência do reprogramamento e reduz a perda celular nas fases iniciais. O método apoia a validação de alvos e o desenvolvimento de modelos pré-clínicos utilizando células derivadas de pacientes, acelerando a pesquisa translacional em medicina regenerativa.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas utilizando iPSCs humanos geneticamente compatíveis derivados de fontes sanguíneas acessíveis.
- Valor Operacional: Fornece uma fonte renovável de células para esclarecimento de vias e validação funcional de alvos sem necessidade de biópsias invasivas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera populações padronizadas de iPSCs para triagem consistente de compostos e desenvolvimento de ensaios fenotípicos.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de plaqueamento serial por centrifugação, reduzindo a variabilidade na adesão celular e na eficiência de reprogramação.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a modelagem relevante para doenças ao produzir células pluripotentes capazes de diferenciação em linhagens relevantes para testes de toxicidade e eficácia de fármacos.
- Valor Operacional: Permite a expansão escalonável e o armazenamento de colônias de iPSCs para estudos pré-clínicos longitudinais e redução de riscos no mecanismo de ação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer uma fonte confiável e anterior de iPSCs para aplicações posteriores na validação de alvos, desenvolvimento de ensaios e testes pré-clínicos.
- Biologia da Descoberta: Facilita a verificação de hipóteses por meio da geração de iPSCs específicos do paciente que mantêm o background genético do doador para estudos mecanicistas.
- Triagem: Produz colônias de iPSCs aderentes e proliferativas adequadas para triagem de alto conteúdo e ensaios de resposta à dose após transdução e seleção.
- Análises: Permite a avaliação quantitativa da eficiência de reprogramação por meio de métricas de formação de colônias e expressão de marcadores de pluripotência (por exemplo, SSEA4, Oct4, TRA-1-60) para decisões de prosseguimento ou interrupção.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade do descobrimento à validação pré-clínica, fornecendo células com capacidade de diferenciação para ensaios tecido-específicos e farmacologia de segurança.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para geração de iPSCs em múltiplos projetos, reduzindo a dependência da reprogramação de fibroblastos e permitindo fluxos de trabalho paralelos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao utilizar iPSCs derivadas de humanos, geneticamente estáveis e que refletem a variabilidade do paciente.
- Valor Operacional: Melhora a padronização e escalabilidade da produção de iPSCs por meio de etapas definidas de centrifugação e plaqueamento em matriz revestida, minimizando a variabilidade manual.
- Valor Estratégico: Reduz o risco biológico na identificação de compostos líderes ao permitir a detecção precoce de fenótipos relacionados ao alvo em contextos celulares humanos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer leituras mecanicistas de modelos derivados de iPSCs que orientam decisões de avanço.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células-tronco, transdução viral e técnicas de manipulação celular baseadas em centrifugação.
- Depende do acesso a centrífugas refrigeradas, revestimentos de matriz (por exemplo, vitronectina) e meios especializados para manutenção de células sanguíneas e expansão de iPSCs.
- Necessita padronização entre equipes quanto à força g, tempo e temperatura durante as etapas de plaqueamento seriado para garantir reprodutibilidade.
- Requer considerações de adaptação ao ser aplicado a diferentes fontes de células derivadas de sangue (por exemplo, sangue do cordão umbilical versus sangue periférico), devido à variabilidade na viabilidade celular e eficiência de transdução.
- As limitações práticas incluem a necessidade de técnica asséptica durante múltiplas transferências e a variabilidade potencial na eficiência de reprogramação, conforme a qualidade das células doadoras e seu histórico de passagens.
