Name: Induzida Geração Stem Cell pluripotentes a partir de células de sangue com o vírus Sendai e centrifugação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprenda a reprogramar células mononucleares de sangue periférico em células-tronco pluripotentes induzidas usando centrifugação. Este protocolo eficiente utiliza vírus Sendai para gerar iPSCs acessíveis para medicina regenerativa.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Programa de Pesquisa Científica Básica da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiada pelo Ministério da Ciência, TIC e Planejamento Futuro (2013R1A1A1076125).

Declaração de Ética: Este protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Católica da Coreia (KC12TISI0861). 1. Isolamento de células monocíticas a partir de sangue <ol><li> Isolamento de células monocíticas (dia -5) <ol><li> Obter pelo menos 10 ml de sangue fresco a partir de uma colheita de sangue em um tubo de preparação de células (CPT). </li><li> Transferir o sangue para um novo tubo cónico de 50 ml e dilui-la com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) a uma proporção de 1: 4. NOTA: Uma maior razão de diluição pode ser usado para uma pureza mais elevada. </li><li> Adicionar 10 mL de meio de gradiente de densidade para um novo tubo cónico de 50 ml e cuidadosamente em camadas o sangue diluído em cima dos meios de gradiente de densidade. Centrifugar a 750 xg durante 30 min à temperatura ambiente (TA), sem um freio de centrifugação. </li><li> Transferir cuidadosamente a camada Buffy para um novo tubo cónico de 50 ml, adicionar 30 ml de PBS ao tubo, e lavar as células. </li><li> Centrifugar as células a 515 xg durante 5 min à TA. &lt;/ Li&gt; <li> Descartar o PBS e ressuspender as células em 0,5 ml de meio de células de sangue. </li><li> Contar as células e placa 1 x 10 6 células por poço de uma placa de 24 poços. Adicionar PBS aos poços circundantes para evitar a evaporação. </li><li> Estabilizar as células durante 5 dias a 37 ° C em 5% de CO 2 antes da transdução. Adicionar um adicional de 0,5 ml de meio de células do sangue fresco nos dias 3-4, sem perturbar as células. </li></ol></li></ol> 2. A transdução por vírus Sendai <ol><li> Transdução (Dia 0) <ol><li> Coletar e transferir as células do sangue para um tubo cônico de 15 ml e contá-los usando um hemocitômetro. </li><li> Preparar 3 x 10 5 células por transdução e centrifugar as células a 515 xg durante 5 min à TA. </li><li> Descartar o sobrenadante por aspiração e ressuspender as células em 0,5 ml de meio de células de sangue. </li><li> Transferir as células para um poço de uma placa não-revestido de 24 poços. </li><li> Descongelar a mistura de vírus Sendai em gelo e adicioná-lo ao sucélulas spended. Adicionar vírus Sendai para as células com base nas recomendações do fabricante. </li><li> Selar a placa com uma película de selagem e centrifugar que a 1.150 xg durante 30 min a 30 ° C. </li><li> Após centrifugação, as células incubar a 37 ° C em CO 2 durante a noite (O / N) 5%. </li></ol></li><li> transferência de células de matriz alimentador (Dia 1) <ol><li> No dia seguinte, revestimento de uma placa de 24 poços com vitronectina. Dilui-se a solução de vitronectina em PBS para uma concentração final / ml 5 ug. Adicionar 1 mL de vitronectina a um poço de uma placa de 24 poços e incuba-se que à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h. Remover a solução de revestimento antes da sua utilização. As placas revestidas podem ser armazenadas em TA durante 3 dias. </li><li> Transferir todos os meios contendo as células e os vírus para o poço revestido. </li><li> Recolher as células restantes com um adicional de 0,5 ml de meio de células de sangue fresco e adicioná-lo para a célula contendo bem. </li><li> Centrifugar a placa a 1150 xg durante 10 min a 35 ° C. </li><li> Depois centorifugation, remover o sobrenadante, adicionar 1 ml de meio CIPS, e manter as células a 37 ° C em 5% de CO 2 O / N. </li></ol></li><li> transferência de segunda célula (Dia 2) <ol><li> Revestir os poços de uma nova placa de 24 cavidades com 5 ug / mL de vitronectina, conforme descrito no passo 2.2.1. Utilize uma das cavidades da placa para cada transdução. </li><li> Transferir a suspensão de células a partir da primeira placa de placa de vitronectina recém-revestidos. NOTA: Se não for necessário, as células em suspensão podem ser descartados. O procedimento indicado no passo 2.3 pode ser repetido 2-3 vezes com as células em suspensão. Se as etapas serão repetidas, a colheita das células. </li><li> Enquanto isso, adicionar 1 ml de meio iPSC ao poço da primeira placa, para manutenção, e incuba-se que a 37 ° C em 5% de CO 2 O / N. </li><li> Manter as células ligadas a 37 ° C e 5% de CO 2 e efectuar uma mudança de meio ao dia com meios iPSC fresco. Colónias aparecerão nos dias 14-21 após a transdução. </li><li> Centrifuge a placa de recém-revestidos contendo as células em suspensão a 1.150 xg e 35 ° C durante 10 min. </li><li> Após centrifugação, as células incubar a 37 ° C em 5% de CO 2 O / N. </li><li> No dia seguinte, remover o sobrenadante e substituí-la por meios IPSC frescos. NOTA: O procedimento mencionado na etapa 2.3 pode ser repetido 2-3 vezes com as células em suspensão. Se as etapas serão repetidas, a colheita das células do sobrenadante e repetir o passo 2.3. </li><li> Manter as células unidas com mudanças de meio dia até 80% de confluência é atingido. </li></ol></li></ol> 3. Manutenção celular reprogramadas <ol><li> manutenção cedo após a cultura em placa de 24 poços <ol><li> 7-10 dias após a transdução, uma vez que as células estão confluentes, preparar, um prato de vitronectina-revestido de 60 mm. Diluir solução vitronectina em PBS para uma concentração final / ml 5 ug. Adicionar 1 mL de vitronectina para o prato e incubar-lo à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h. </li><li> Lava-se aas células com PBS e adicionar 1 ml de PBS EDTA / 1 mM para separar as células. </li><li> Incubar-los a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 2 min. </li><li> Colheita das células e centrifugar a 250 xg los e TA durante 2 min. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 3 ml de meio fresco IPSC. </li><li> Placa todas as células ressuspenso para o prato recém-revestida de 60 mm. </li><li> Adiciona-se 10 mM de inibidor de cinase RHO para as células e mantê-las a 37 ° C em 5% de CO 2 até que as células estão 80% confluentes. </li></ol></li><li> Dividir para o aparecimento de colónias (Subclonagem Preparação) <ol><li> Prepare, um prato revestido com vitronectina de 100 mm, tal como descrito no passo 3.1.2. </li><li> Lavam-se as células com PBS e adicionar 1 ml de EDTA PBS / 1 mM para separar as células. </li><li> Incubar-los a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 2 min. </li><li> Colheita das células e centrifugar a 250 xg los e TA durante 2 min. </li><li> Contar as células utilizando um hemocitómetro e preparar a 1 x 10 4 células por prato.</li><li> Centrifugar as células a 250 xg e TA durante 2 min. </li><li> Ressuspender 1 x 10 4 células em 6 ml de meios iPSC, placa-los sobre o prato revestido de 100 mm, e adicionar 10 RHO mM inibidor da quinase para a mídia. </li><li> Incubar as células a 37 ° C em 5% de CO 2 durante uma semana até grandes colónias aparecem. NOTA: manter e expandir as colônias para subclonagem. Subclonagem geralmente é feito em menos de 5 passagens. </li></ol></li><li> Colony escolher usando iPSC colónia solução destacando <ol><li> Uma semana antes de picking colônia, semente 1 x 10 4 células em uma, de 100 mm prato revestido de vitronectina, conforme mencionado na etapa 3.2.7. </li><li> Prepare, um prato revestido de vitronectina de 60 mm por adição de 2 ml de solução de vitronectina e incubou-se à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h. </li><li> Ao observar através de um microscópio (40X ou 100X), marque as colónias com limites claros usando uma caneta. Remover a solução de vitronectina a partir da nova placa feita no passo 3.3.2 e adicionar 6 mliPSC de meio suplementado com 10 mM de RHO quinase. </li><li> Remover o meio de cultura das células e lavá-los com 3 ml de PBS. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de retirar iPSC colónia e incubar durante 30 segundos a temperatura ambiente. </li><li> Remover a solução a partir da placa e incubar-lo à TA durante mais 30 seg. </li><li> Com uma pipeta P200, desenhe 200 mL de mídia da placa e retire as colônias alvejados por pipetagem. Transferir as colônias espalhadas ao novo prato de 100 mm. </li><li> Incubar e manter as células a 37 ° C em 5% de CO 2. NOTA: Depois de obter uma colónia iPSC pura, as células foram mantidas até que chegaram passagem 10. Caracterização foi feito depois de pelo menos 10 passagens. Diluições de anticorpos e informações iniciador são mostrados nas Tabelas 1 e 2. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+engineering+of+human+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application.</a> Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+and+personalized+medicine%3A+current+progress+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives.</a> Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).</li>
<li>Seki, T., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+induced+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application.</a> World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).</li>
<li>Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+iPSCs+from+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+non-integrative+Sendai+virus+in+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions.</a> Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).</li>
<li>Ohmine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+GMP-grade+hematopoietic+progenitor+cells+and+mononuclear+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).</li>
<li>Mae, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+robust+induction+of+nephrogenic+intermediate+mesoderm+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells.</a> Nat Commun. 4, 1367(2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Dado que as células estaminais embrionárias (CES) mostrou várias deficiências, foi necessária a necessidade de uma ferramenta alternativa. Portanto, o desenvolvimento de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) por Yamanaka ficou sob os holofotes internacionais. Tem sido quase uma década desde Yamanaka descobriu que pluripotência pode ser induzida pela adição de apenas quatro genes em células somáticas adultas. Desde iPSCs são &quot;induzidos&quot; a partir de células somáticas adultas, eles podem fugir questões é...

As células-tronco têm sido um dos materiais mais atraentes da terapia clínica durante os últimos várias décadas 1. As propriedades atraentes de células-tronco são pluripotência ea capacidade de auto-renovação. Em 1981, as primeiras células estaminais embrionárias (CES) foram isolados a partir do embrião de rato 2. No entanto, quando a técnica foi aplicada a embriões humanos, enfrentou vários problemas éticos. Em 2006, quando o Dr. Yamanaka e sua equipe reprogramou a primeira célula pluripotente a partir de células somáticas de rato, o campo de células-tronco recuperou a sua possibilidade e interesse foi reavivado 3. Ao entregar vários fatores definidos, as células-tronco pluripotentes foram com sucesso &quot;induzida&quot; a partir de células somáticas adultas, e foram assim chamado &quot;células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs).&quot; Em 2007, esta técnica foi aplicada às células humanas 4, as células com as características exactas do CES rendendo mas nenhum do debate ético. Teoricamente, iPSCs pode ser gerado a partir de qualquer tipo de célula obtido a partir de um indivíduo ou paciente. iPSCs específicos do paciente estão subindo como uma ferramenta potencial que pode simular os fenótipos da doença e condições epigenéticas de cada paciente individual. Usando edição gene ou outros métodos que podem reverter a condição patogénica, iPSCs específicos do paciente também pode ser usado em medicina personalizada 5. Além disso, são menos iPSCs associada com a rejeição imunitária porque eles têm a mesma identidade imune como doador, tornando auto-transplante mais viável 6. Portanto, iPSCs tornaram-se a plataforma mais promissora na modelagem de doença, o rastreio de drogas e terapias regenerativas. Tendo em conta estes benefícios, melhores protocolos que podem dar mais puro e rendimentos mais elevados no menor espaço de tempo a partir da fonte de células menores são constantemente em desenvolvimento. Uma consideração importante de encontrar o protocolo mais eficaz para aplicação no futuro é o tipo de célula primária. A maioria dos primeiros geração proto iPSCcols são otimizados para células aderentes uma vez que as linhas de IPSC originais foram induzidas a partir de fibroblastos da pele 4. No entanto, o isolamento e a preparação destas células são trabalho intensivo. Além disso, o isolamento de fibroblastos da pele inclui procedimentos cirúrgicos invasivos que podem se tornar uma grande falha de aplicação mais ampla. Portanto, para a continuação da utilização de iPSCs, uma fonte de células com a aquisição conveniente é necessária. O sangue é considerado como uma fonte de células ideal, uma vez que é obtido através de um procedimento minimamente invasivo, em vez de 7-9. Neste estudo, foi desenvolvida uma modificação simples de gerar o protocolo hiPSCs de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Sem o difícil processo de expansão de um tipo de células específico, tais como as células CD34 +, células de sangue completo ou PBMC foram serialmente plaqueadas em placas revestidas com matriz por centrifugação após transdução com vírus Sendai contendo factores Yamanaka. Este método reduz o tempo necessário para ofixação de células flutuantes transduzidos e diminuiu a perda de células reprogramadas que não foram capazes de anexar por conta própria.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>100 mm Prato</td><td>TPP&nbsp;</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Cornical de 50 ml</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Cornical de 15 ml</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Descartável de 10 ml</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Descartável de 5 ml</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 poços</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>TPP</td><td>92024</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">PBMC Materiais de Isolamento</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9805</td><td>Meio de célula sanguínea</td></tr><tr><td>CC110</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>8697</td><td>Sangue suplemento de mídia celular (100x)</td></tr><tr><td colspan="4">iPSC Materiais de Geração e Cultura</td></tr><tr><td>CytoTune-iPSC Kit de Reprogramação Sendai</td><td>Life Technologies</td><td>A16518</td><td></td></tr><tr><td>TeSR-E8 Mídia</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5940</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectina</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de ROCK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express (TrypLE)</td> <td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>12604-039</td><td>Solução</td></tr><tr> de desprendimento de colônias<td colspan="4">Materiais de controle de qualidade</td></tr><tr><td>18 mm Vidro de cobertura</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Innovation</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino&nbsp;</td><td>Laboratório de Vetores</td><td>SP-5050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-SSEA4</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-TRA-1-60</td><td>Anticorpo Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-TRA-1-81</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Klf4</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-mouse de cabra IgG (H+L) anticorpo</td><td>Molecular Probe</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 cabra anti-coelho IgG (H+L) anticorpo</td><td>Molecular Probe</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probe</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolongar ouro anti-fade reagente</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Vidro Deslizante, Revestido&nbsp;</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalcohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA Polimerase</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10X TBE Buffer&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>estrela de carregamento</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1kb (+) Marcador de escada de DNA</td><td>Enzynomics</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatase alcalina</td><td>Millipore</td><td>SCR004</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Tampão</td><td></td> de enxágue Fisher Scientific <td>BP152-1</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0520.1000</td><td>Tampão de Enxágue</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td>Tampão de Enxágue</td></tr><tr><td>Ácido Clorídrico</td><td>Duksan</td><td>1129</td><td>Tampão de Enxágue</td></tr></tbody></table>

induzida geração stem cell pluripotentes a partir de células de sangue com o vírus sendai e centrifugação

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

O recente desenvolvimento de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs) provou que células somáticas maduras podem voltar a um estado indiferenciado, pluripotentes. Agora, a reprogramação é feito com vários tipos de células somáticas adultas: queratinócitos, células de urina, f ibroblastos, etc. experiências iniciais foram normalmente feito com fibroblastos da derme. No entanto, isto requer um procedimento cirúrgico invasivo para se obter fibroblastos de pacientes. Portanto, as células em suspensão, tais como células de sangue e urina, foram considerados ideais para a reprogramação por causa da conveniência de obtenção de células primárias. Aqui, nós relatamos um protocolo eficiente para a geração de iPSC a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Por plaqueamento das PBMC transduzidas em série para um novo, placa utilizando centrifugação revestido de matriz, este protocolo pode facilmente fornecer colónias IPSC. Este método é também aplicável a células mononucleares de sangue do cordão umbilical (CBMCs). Este estudo apresenta um prot simples e eficienteOCOL para a reprogramação de PBMC e CBMCs.

Este protocolo apresenta um método simples para reprogramar CMSPs isolados a partir de sangue. Usando a combinação de chapeamento de série e centrifugação, iPSCs foram geradas com sucesso. Com este método, iPSCs poderia ser gerado com uma pequena quantidade de células de sangue completo, sem isolamento ou a expansão de um tipo de célula específico. Nós com sucesso gerado iPSCs de apenas 1x10 4 células em uma placa de cultura de células pequenas. <p class="jove_content" fo:...

Propomos um protocolo para reprogramação de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Ao plaquear as células sanguíneas transduzidas em placas revestidas com matriz com centrifugação, as iPSCs são induzidas com sucesso a partir de células flutuantes. Esta técnica sugere um protocolo de reprogramação simples e eficaz para células como PBMCs e CBMCs.

Induzida Geração Stem Cell pluripotentes a partir de células de sangue com o vírus Sendai e centrifugação

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

O objetivo geral deste estudo é reprogramar células mononucleares do sangue periférico em células-tronco pluripotentes induzidas, utilizando plating serial por centrifugação. Originalmente, as iPSCs foram geradas por meio da reprogramação de fibroblastos. Hoje, diversos tipos celulares são utilizados para reprogramação.No entanto, devido à acessibilidade do sangue, os PBMCs podem não ser uma fonte celular aceita para aplicações futuras de iPSCs, na triagem de fármacos, modelagem de doenças e desenvolvimento da medicina regenerativa. Por meio do estudo, compartilharemos um protocolo sobre o reprogramamento de iPSCs utilizando PBMCs com a adição de força centrífuga. Este protocolo fornecerá outra opção ao reprogramar células em suspensão.Demonstrando o procedimento, usaremos Nam, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para isolar as células monocíticas, obtenha primeiro pelo menos dez mililitros de sangue fresco de uma coleta sanguínea em um tubo de preparação celular. Em seguida, transfira o sangue para um novo tubo cônico de 50 mililitros e dilua com PBS estéril na proporção de um para quatro.Em seguida, adicione dez mililitros de meio de gradiente de densidade a um novo tubo cônico de 50 mililitros e, cuidadosamente, sobreponha o sangue diluído ao meio de gradiente de densidade. Em seguida, centrifugue a amostra a 750 × g durante 30 minutos à temperatura ambiente, sem interrupção na centrifugação. Após 30 minutos, transfira cuidadosamente a camada de buffy para um novo tubo cônico de 50 mililitros.Adicione 30 mililitros de PBS e lave as células. Em seguida, centrifugue as células a 515 ×g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Depois disso, descarte o PBS e ressuspenda as células em 0,5 mililitros de meio para células sanguíneas.Em seguida, conte as células e plaque-as em uma placa de 24 poços. Adicione PBS aos poços ao redor para prevenir evaporação. Em seguida, estabilize as células por cinco dias a 37 graus Celsius antes da transdução.Adicione adicionalmente 0,5 mililitros de meio fresco para células sanguíneas no terceiro ao quarto dia, sem perturbar as células. Neste procedimento, transfira as células sanguíneas para um tubo cônico de 15 mililitros e conte-as utilizando um hemocitômetro. Em seguida, prepare três vezes dez à quinta potência células para transdução e centrifugue as células a 515 × g durante cinco minutos à temperatura ambiente.Em seguida, descarte o sobrenatante por sucção e ressuspenda as células em 0,5 mililitros de meio para células sanguíneas. Depois, transfira as células para um poço de uma placa de 24 poços não revestida. Deixe a mistura do vírus Sendai descongelar no gelo e adicione-a às células suspensas.Selar a placa com uma película adesiva e centrifugá-la a 1.150 × g durante 30 minutos a 30 °C. Após a centrifugação, incubar as células a 37 °C em 5% de dióxido de carbono durante a noite. Para revestir uma placa de 24 poços com vitronectina, no dia seguinte, diluir a solução de vitronectina em PBS para obter uma concentração final de 5 µg/mL.Em seguida, adicione um mililitro de vitronectina a um poço e incube-o em temperatura ambiente por pelo menos uma hora. Depois, remova a solução de revestimento e transfira todo o meio contendo as células e o vírus para o poço revestido. Em seguida, colete as células restantes com um volume adicional de 0,5 mililitro de meio fresco para células sanguíneas e adicione-o ao poço que contém as células.Posteriormente, centrifugue a placa a 1.150 × g durante dez minutos a 35 °C e, em seguida, mantenha as células a 37 °C em 5% de dióxido de carbono durante a noite. Para a segunda transferência celular, recubra o poço com cinco microgramas por mililitro de vitronectina conforme descrito anteriormente. Utilize um poço da placa para cada transdução e transfira a suspensão celular da primeira placa para a nova placa recoberta com vitronectina.Enquanto isso, adicione um mililitro de meio de iPSC a um poço da primeira placa para manutenção e incube-a a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono, com troca diária do meio por meio fresco de iPSC. Colônias aparecerão entre o dia 14 e o 21, após a transdução. Centrifugue a placa recém-revestida, contendo as células suspensas, a 1.150 × g a 35 graus Celsius por dez minutos.Após a centrifugação, incubar as células a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono, durante a noite. No dia seguinte, remover o sobrenadante e substituí-lo por meio fresco de células-tronco pluripotentes induzidas. Manter as células aderidas com troca diária de meio, até que seja atingida confluência de 80%.Uma semana antes da seleção de colônias, semeie um vezes dez à quarta potência de células em uma placa de 100 milímetros revestida com vitronectina. Em seguida, prepare uma placa de 60 milímetros revestida com vitronectina, adicionando dois mililitros de solução de vitronectina e incubando-a à temperatura ambiente por pelo menos uma hora. Observando ao microscópio, marque as colônias na parte inferior da placa com limites bem definidos usando uma caneta marcadora.Remova a solução de vitronectina da nova placa e adicione seis mililitros de meio de células-tronco pluripotentes induzidas, suplementado com dez milimolares de RHO quinase. Em seguida, remova o meio de cultura das células e lave-as com três mililitros de PBS. Então, adicione um mililitro de solução de desanexação de colônias de iPSC e incube por 30 segundos à temperatura ambiente.Depois disso, remova a solução da placa e incube-a em temperatura ambiente por mais 30 segundos. Após 30 minutos, retire 200 microlitros de meio da placa e desprenda as colônias-alvo por pipetagem. Em seguida, transfira as colônias dispersas para um novo recipiente de 60 milímetros.Incube e mantenha as células a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono até atingirem a décima passagem. No estágio inicial do reprogramamento, as iPSCs foram misturadas com as células diferenciadas não reprogramadas aderidas. Antes da expansão, era difícil distinguir as iPSCs das demais células.Sequestrando as células em baixa densidade, obtiveram-se colônias com tamanho suficiente para serem selecionadas. Após o isolamento da colônia, os agregados celulares foram dissociados em células individuais e cultivados. Posteriormente, observaram-se colônias puras de iPSCs.Após a expansão das células-tronco pluripotentes induzidas puras, a qualidade das células foi testada. As células foram coradas com fosfatase alcalina para confirmar o estado indiferenciado das células-tronco pluripotentes induzidas. Colônias derivadas das células-tronco pluripotentes induzidas isoladas apresentaram todas coloração positiva.Os marcadores de pluripotência foram confirmados por coloração imunofluorescente. As células reprogramadas expressaram altos níveis de marcadores de pluripotência, como SSEA4, Oct4, Sox2, TRA-1-81, Klf4 e, mais importante, TRA-1-60; a expressão dos marcadores de pluripotência foi confirmada por RTPCR. Utilizando plating serial por centrifugação, a adesão de PBMC de uso transitório a uma placa revestida com matriz.As aderências ocorrem conforme pendentes, e as colônias de iPSC são repetidas para uma purificação. Utilizando este protocolo, iPSCs podem ser geradas a partir de PBMCs dentro de um mês. Este protocolo reduz o tempo necessário para a adesão de células transduzidas e evita a perda de células reprogramadas que não foram capazes de aderir por si próprias.No entanto, a purificação de iPSCs totalmente reprogramadas com capacidade de formar colônias pode ser crítica ao tentar este procedimento. Anteriormente, reprogramamos com sucesso PBMCs e células mononucleares utilizando este protocolo. As iPSCs derivadas de células sanguíneas geradas podem ser amplamente utilizadas em diversas áreas de pesquisa.Este protocolo pode auxiliar o processo de reprogramação de outros tipos de células em suspensão flutuantes, para aplicações e estudos adicionais.

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