Name: Ensaios para estudar o papel do vitronectina na adesão bacteriana e resistência de soro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Aprenda ensaios de citometria de fluxo e ELISA para estudar a interação entre vitronectina humana e proteínas bacterianas. Este método ajuda pesquisadores a investigar mecanismos de adesão e resistência a soro em patógenos.

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Este trabalho foi financiado por doações da Fundação de Anna e Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. e Edla Johansson Foundation, o sueco Medical Research Council (conceder o número K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), a Fundação de câncer da Universidade Hospital em Malmö, a sociedade Physiographical (Fundação do Forssman) e o Conselho de Condado de Skåne pesquisa e Fundação para o desenvolvimento.

1. análise de Vn como um ligante de proteína de superfície bacteriana
<ol><li>
Deteção de Vn-ligação na superfície bacteriana usando citometria de fluxo Nota: Em citometria de fluxo, costumávamos lado scatter e dispersão frente portão eventos positivos. Para examinar as interações com Vn, Hif clínico isolados (n = 10)7 foram selecionados juntamente com Escherichia coli BL21 (DE3) como um controle negativo (Figura 1A).<ol>
<li>Cultura Hif clínico isolados em suplementado com 10 µ g/mL NAD e hemina a 37 ° C com agitação a 200 rpm (BHI) de infusão cérebro-coração. Use meio de Luria-Bertani à cultura de Escherichia coli14. Colheita de Hif cada fase log de mid (OD600 = 0.3)15e ressuspender as bactérias em tampão fosfato salino (PBS), pH 7.2, contendo 1% (p/v) albumina de soro bovino (BSA) (tampão de bloqueio; PBS-BSA). Ajustar a suspensão para 109 UFC/mL.</li>
		<li>Transferir as alíquotas que contém 5 x 106 UFC para tubos de fundo redondo de 5 mL poliestireno (12 x 75 mm2) e adicione 1 mL de tampão de bloqueio. Centrifugar a suspensão de 3.500 × g em temperatura ambiente (RT)16 por 5 min para as bactérias de pelotas e, em seguida, Aspire cuidadosamente para remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento.</li>
		<li>Resuspenda as pelotas bacterianas com 50 μL de tampão de bloqueio contendo 250 nM Vn e incubar as amostras por 1h no RT sem tremer. Após a incubação, as bactérias de pelotas por centrifugação a 3.500 x g durante 5 min e, em seguida, lave as pelotas três vezes usando PBS e etapas de centrifugação semelhantes.</li>
		<li>Ao pellet bacteriana, adicione 50 μL de ovelhas primário anti-humano Vn Anticorpos policlonais de (pAbs) na diluição de 1: 100 em PBS-BSA. Incube a suspensão por 1h no RT e, em seguida, lavar as bactérias três vezes com PBS para remover anticorpos desacoplados (conforme descrito na etapa 1.1.3).</li>
		<li>Em seguida, adicione 50 μL de PBS-BSA contendo isotiocianato de fluoresceína (FITC)-conjugados burro anti-ovelha pAbs (diluição de 1: 100) e incubar a RT por 1h no escuro.</li>
		<li>Prepare um controle em branco incubando bactérias com o bloqueio de buffer apenas e pAbs sem Vn.</li>
		<li>Lavar as bactérias três vezes com 1 mL de tampão de bloqueio e a suspensão de pelotas por centrifugação, conforme descrito na seção 1.1.2. Finalmente, resuspenda o pellet bacteriano com 300 µ l de PBS e analisar por citometria de fluxo7.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise de ELISA da interação entre PH recombinante e Vn Nota: Controles precisam ser incluídos para excluir a ligação inespecífica. Proteína humana fator H (FH) ou ligação C4b (C4BP) são usados como controles positivos e negativos, respectivamente.<ol>
<li>Diluir cada uma das proteínas humanas (Vn, FH e C4BP) separadamente a 50 nM em Tris-HCl, pH 9.0 (tampão de revestimento). Dispense a 100 µ l de solução de proteína em cada poço de uma placa de microtitulação de Polysorp. Feche as placas com a tampa e armazenar a 4 ° C durante a noite (16 h) para facilitar a imobilização de proteínas para os poços da microplaca placa.</li>
		<li>Descartar a solução da placa de microtitulação pela inclinação de cabeça para baixo na pia e lavar os poços três vezes com 300 µ l de PBS/poço. Bloquear os Poços revestidos por 1h no RT com PBS contendo 2,5% (p/v) BSA (PBS-BSA).</li>
		<li>Depois de remover a solução de bloqueio, lave os poços três vezes com 300 µ l de PBS contendo 0,05% (v/v) Tween 20 (PBST) por poço. Adicione 100 µ l de 50 recombinante nM com sua tag PH de cada amostra bem e incubar durante 1 h em RT Em poços de controle, adicione 100 µ l de PBS-BSA. Nota: O gene lph codificação PH de Hif foi amplificado por PCR e clonado no vetor de expressão pET26b que adiciona uma 6 × sua marca no C-terminal da proteína expressa. O vetor recombinante foi transformado em Escherichia coli BL21(DE3) para expressão. NI-NTA resina foi usada para purificar a proteína recombinante15.</li>
		<li>Descartar a solução de proteína e remover as proteínas unbound lavando os poços três vezes com 300 µ l de PBST por bem. Adicione 100 µ l de PBS-BSA contendo peroxidase de rábano silvestre (HRP)-conjugado antisua pAbs (01:10, 000 diluição) e incube por 1h no RT</li>
		<li>Prepare a solução de 20 mM A dissolvendo tetrametilbenzidina em uma solução de 5% de acetona e 45% de metanol. Para preparar a solução B, dissolver 19,2 g de ácido cítrico em 1.000 mL de H2O, ajustar o pH a 4,25 adicionando-se KOH e, em seguida, adicione µ l 230 de 30% H2O2. Armazenar as duas soluções no escuro no RT Apenas antes de usar, misture 500 µ l da solução B com 9,5 mL da solução A preparar o reagente de detecção de ELISA.</li>
		<li>Lavar os poços três vezes com 300 µ l de PBST por alvéolo e detectar complexos antígeno-anticorpo, adicionando-se 100 µ l de reagente de detecção de ELISA a cada poço.</li>
		<li>Adicionar 50 µ l de 1 M H2então4pois para parar a reação. Medir a densidade óptica dos poços a 450 nm, utilizando um leitor de microplacas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estudo sobre a cinética de interação de recombinação PH e Vn usando BLI
	<ol>
<li>Imobilize Vn humana nos sensores amina reativos, usando a amina acoplamento método, de acordo com orientações11 do fabricante.</li>
		<li>Usando o PBS, serialmente diluir o ligante (recombinante PH) de 0 a 4 µM e transferir as soluções resultantes de uma placa de microtitulação 96 poços preto, de fundo plano. Execute o experimento a 30 ° C, usando um instrumento BLI17.</li>
		<li>Carrega a pasta de dados do software de análise de dados BLI. Selecione a opção 'Seleção de sensor' . Em seguida, selecione 'referência bem' (Vn-revestido sensor em PBS) para subtração.</li>
		<li>Selecione 'alinhar o eixo y para a linha de base' e 'interstep correção e alinhar a associação'. Pressione 'dados processo' que automaticamente irão abrir o guia de análise.</li>
		<li>Na guia de análise, selecione a opção 'associação e dissociação' em encaixe de curva. Selecione o modelo ' 1:1 ligação e montagem global'. Pressione 'ajustar curva' e exportação encaixe dados17.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. caracterização do papel da Vn na aderência bacteriana
<ol><li>
Estudo de aderência bacteriana às superfícies de vidro revestido Vn
	<ol>
<li>Prepare uma solução de 2 µ g/mL de Vn em PBS e pipetar 10 µ l desta solução em um microscópio de vidro deslizam como uma única gota. Permita a entrega secar no slide por 30 min em RT. Coat um slide com albumina de soro humano (HSA) como controlo negativo.</li>
		<li>Lave as lâminas de vidro revestido proteína três vezes mergulhando os slides por dois segundos em um béquer contendo PBS para remover o excesso da proteína sem revestimento. Adicionar 20 mL de cultura recente do Hif (descrita na etapa 1.1.1) em um prato de petri de plástico estéril e submergir o Vn - vidro revestido HSA slides em meio de cultura. Incube os pratos a 37 ° C, durante 1 h com agitação a 20 rpm. Nota: Hif M10 e Hif M10Δlph foram cultivadas em meio líquido BHI ou em placas de agar chocolate. O meio para o mutante lph foi suplementado com 10 µ g/mL canamicina15.</li>
		<li>Após a incubação, remova qualquer bactéria desacoplada submergindo os slides três vezes em um copo cheio de PBS. Visualize as bactérias por coloração de Gram, conforme descrito.<ol>
<li>Remova excesso PBS de cada slide inclinando-a e tocando a borda no papel de tecido. Secar as lâminas durante 3-5 min à RT e corrigir as bactérias aderidas por passar cada slide três vezes sobre uma chama.</li>
			<li>Segure o slide pelas bordas com dois dedos em uma bandeja de coloração, em seguida, adicione 3-4 gotas (200 – 300 µ l) da solução de violeta de cristal de 2,3%. Espere 60 s e, em seguida, lave os slides sob uma ligeira corrente da torneira de água para 3 – 4 s.</li>
			<li>Adicione 3-4 gotas de solução de iodo de 0,33% sobre os slides. Espere 1 minuto e, em seguida, lave o slide em um fluxo suave de água da torneira. Seca cuidadosamente os slides por papel mata-borrão.</li>
			<li>Adicione 3-4 gotas de solução de descoloração contendo álcool isopropílico 75% e 25% de acetona para o slide. Após 5 a 10 s, lave o slide sob uma ligeira corrente de água da torneira.</li>
			<li>Adicione 3-4 gotas (200 – 300 µ l) de solução de carbolfuchsin básica. Espere 1 minuto e, em seguida, lave os slides em um fluxo suave de água da torneira. Seque os slides usando papel mata-borrão.</li>
			<li>Visualize as bactérias sob um microscópio de luz, selecionando uma lente objetiva de imersão de óleo em 100 X ampliação de18. Compare a aderência do Hif WT e bactérias mutantes nas superfícies de vidro Vn e HSA-revestido.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estudo da aderência de Vn-dependente de bactérias às células epiteliais Nota: Este ensaio de aderência eficiente foi usado em nossos anteriores estudos4,7.<ol>
<li>Cultura A549 células (tipo II alveolar epiteliais) em um frasco de cultura de tecidos de 75cm2 com F12 suplementado com 10% de soro fetal bezerro (vol/vol) (FCS) (médio completo) e 5 µ g/mL gentamicina. Incubar o frasco em uma incubadora com 5% CO2 a 37 ° C durante 3 dias até 80% de confluencia (confluência pode ser estimada através da visualização de cobertura de superfície pelas células usando microscópio invertido). As quatro etapas a seguir descrevem como preparar as células epiteliais para o ensaio de19,20.<ol>
<li>Lave a monocamada de células no frasco duas vezes com 20 mL de PBS e agitando suave. Para separar as células da superfície do balão, adicionar 2 mL de solução de enzima de desprendimento de célula e incubar o frasco por 5 min a 37 ° C. Toque o balão com a palma da mão para retirar todas as células da superfície do plástica. Pipetar para cima e para baixo algumas vezes para dispersar grupos de célula.</li>
			<li>Adicionar 18 mL de meio completo F12 no balão e transfira a suspensão de toda a célula a um tubo estéril de Falcon 50 mL. Centrifugar a suspensão de eritrócitos por 5 min a 200 x g em RT e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células em 10 mL de meio completo F12.</li>
			<li>Remover 10 µ l da suspensão celular e colocá-lo em um tubo de Eppendorf, em seguida, adicione 90 µ l de solução de azul de Tripan. Carregar a amostra em um hemocytometer (profundidade de 0,1 mm) depois de colocar a lamela.</li>
			<li>Contar todas as células viáveis em áreas A, B, C e D (cada campo é composto por 16 quadrados e cada quadrado tem uma área de 0,0025 mm2), em seguida, calcule o número médio de células ([A + B + C + D] / 4). Calcule o número de células por mililitro, utilizando a seguinte equação: Viável de células/mL = média célula contagem × 104 × diluição fator20. Nota: Aqui, o factor de diluição é 10.</li>
			<li>Dilua a suspensão de células para 5.0 x 103 células/mL, usando completo médio contendo gentamicina de 5 µ g/mL. Dispense a 500 µ l de suspensão de células em cada poço de uma placa de cultura de células 24 poços. Incube a placa a 37 ° C em 5% CO2 até que as células são 90% de Confluencia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Antes da infecção bacteriana, remover o meio dos poços e adicionar F12 médio (sem FCS) e incubar durante uma noite a 37 ° C.</li>
		<li>Lave a monocamada celular três vezes com 500 µ l de PBS em RT. lugar a placa no gelo e adicionar 100 µ l de pre-refrigerados F12 médio contendo 10 µ g/mL de placa Vn. Incubar a 4 ° C, durante 1 h. Para poços de controle, adicione apenas F12 médio.</li>
		<li>Após a incubação, descartar a solução pipetando e lave a camada celular duas vezes com 1 mL de PBS em RT. Ressuspender uma cultura de recém crescido Hif M10 (etapa 1.1.1) no meio de F12 (2 × 108 UFC/mL). Adicione 100 µ l da suspensão bacteriana a cada poço e incubar a placa por 2 h a 37 ° C. Nota: Cada bem contém cerca de 2 x 105 A549 de células. Para a infecção, 2 x 107 UFC bacteriana foram adicionados, correspondendo a uma multiplicidade de infecção de 100.</li>
		<li>Retire o meio pipetando e lave as células epiteliais A549 três vezes com PBS. Adicionar 50 µ l/poço de solução de desprendimento de célula e incubar a placa por 5 min a 37 ° C.</li>
		<li>Em seguida, adicione 50 µ l de meio completo F12 por alvéolo para parar a reação enzimática. Transferi as células epiteliais (≈100 μL [ou seja, todo o volume]) de cada poço para um tubo de vidro de 6 mL contendo quatro esferas de vidro. Lise as células em RT vortexing por 2 min.</li>
		<li>Diluir 10 µ l do lisado celular 100-fold, adicionando 10 µ l de lisado a 990 µ l de meio F12. Placa de 10 µ l da amostra diluída em uma placa de ágar chocolate.</li>
		<li>Incubar a placa de ágar chocolate a 37 ° C durante a noite e, em seguida, contar as colônias. Cada colônia representa um UFC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. análise de Vn-dependente, resistência à atividade bactericida do soro humano
<ol><li>NHS de compra de uma fonte comercial. Prepare-se como descrito anteriormente12VDS. Reabastecer o VDS com 180 nM Vn que é equivalente a Vn presente no NHS.</li>
	<li>Prepare soro inativado por calor (HIS), NHS de aquecimento a 56 ° C durante 30 min para inativar proteínas do complemento. Nota: A concentração sérica ideal (5%) e o tempo de incubação (15 min) para o ensaio descrito nos passos 3.3 – 3.7 foram determinados empiricamente para Hif15; esses parâmetros podem variar para outros patógenos bacterianos.</li>
	<li>Cultura de bactérias (no caso, Hif M10 e o mutante Hif M10Δlph) para fase log de mid (OD600 = 0,3). Bactérias de pelotas por centrifugação a 3.500 x g durante 10 minutos.</li>
	<li>Resuspenda o pellet bacteriano com 1 volume de gelatina dextrose Veronal tampão (DGVB ++; pH 7,3) contendo 2,5% (p/v) de glicose, 2 mM MgCl2, 0,15 mM CaCl2e gelatina de 0,1% (wt/vol).</li>
	<li>Adicionar 1,5 x 103 UFC de bactérias para 100 µ l de DGVB ++ contendo 5% de soro (NHS, dele, VDS, ou VDS + 180 nM Vn). Incube a amostra a 37 ° C por 15 min com agitação a 300 rpm.</li>
	<li>Retire uma alíquota 10 µ l da mistura reacional em 0 min (amostra de T0 ) e 15 min (amostra det T) e placa de ágar chocolate. Incube a placa a 37 ° C durante a noite.</li>
	<li>Após a incubação, contam-se as colônias que aparecem na placa. Calcular a percentagem de bactérias matou12 usando a seguinte equação: (CFU em Tt) / (CFU em T0) × 100.</li>
</ol>

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<li>Su, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemophilus+influenzae+P4+Interacts+With+Extracellular+Matrix+Proteins+Promoting+Adhesion+and+Serum+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance.</a> J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).</li>
<li>Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+structure+of+Haemophilus+influenzae+protein+E+reveals+multiple+binding+sites+for+host+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors.</a> Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).</li>
<li>Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+as+a+tool+for+exploring+bacterial+proteins%3A+model+of+RickA+in+Rickettsia+conorii%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiolog%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii.</a> New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).</li>
<li>Pinne, M., Haake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-fluorescence+assay+of+leptospiral+surface-exposed+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.+JoVE%22%5BJournal%5D)">Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).</li>
</ol>

Os autores têm sem conflitos de interesses financeiros.

Patógenos bacterianos recrutam Vn à superfície da célula e utilizam este regulador de complemento para impedir a deposição de factores do complemento e conclusão da membrana ataque complexo2. Vn também funciona como uma molécula de ponte entre proteínas de superfície bacterianas e receptores de superfície celular hospedeiro, permitindo assim a patógenos de aderir à superfície das células epiteliais e posteriormente mediar a internalização. Neste estudo, descrevemos os protocolos que podem ser usad...

Vitronectina (Vn) é uma importante glicoproteína humana envolvido na manutenção da homeostase através de regulamentação do sistema fibrinolítico. Vn também funciona como um regulador de complemento inibindo o caminho de complemento terminal durante a formação do complexo C5b6-7 e polimerização C9. Vários patógenos bacterianos foram mostrados para recrutar Vn à superfície da célula, como um meio de resistir ao complemento deposição1,2,3. Além disso, Vn funciona como uma molécula de "sanduíche" entre bactérias e receptores de células epiteliais anfitrião, assim, promover a adesão e interiorização de patógenos2,4,5. Vinculação de Vn à superfície da célula bacteriana é mediada por outras proteínas atualmente não identificadas. Totalmente elucidar o papel funcional de Vn-ligação na evasão da resposta imune mangueira, portanto, exigirá a identificação das proteínas Vn-recrutamento.
O passo inicial na identificação de proteínas Vn é testar se um patógeno de interesse pode vincular purificada Vn. fluxo cytometry é um método conveniente e simples para determinar se o Vn é vinculado às células do patógeno. Neste estudo, avaliamos a ligação do Vn a vários Haemophilus influenzae tipo f (Hif) isolados clínicos6. O método descrito neste documento é quantitativo e pode ser usado para distinguir a capacidade de ligação de uma grande variedade de estirpes de bactérias. Em um estudo anterior, caracteriza-se proteína H (PH) de Hif como um Vn-ligação proteína7. Portanto, no presente estudo, o potencial de Vn-vinculação de mutantes de tipo selvagem (WT) Hif e Hif M10Δlph foram comparados usando os protocolos descritos.
Assim que for determinado que um patógeno vincula Vn, o segundo passo é caracterizar o proteome superfície a fim de identificar potenciais Vn-proteínas. Uma variedade de abordagens pode ser usada para este propósito8,9, mas essas metodologias não são descritas neste relatório. O método mais apropriado para examinar interações da proteína-proteína é recombinantes expressam proteínas de superfície bacterianas selecionadas em e. coli e purificar por cromatografia de afinidade. Aqui, nós usamos o PH e sua interação molecular com Vn para ilustrar o método. Interações entre recombinante PH e Vn foram caracterizadas usando uma enzima-lig da imunoabsorção ensaio (ELISA)7 e uma técnica livre de etiqueta desenvolvida recentemente conhecido como bio-camada interferometria (BLI)10,11. Considerando que o Elisa pode ser usada para confirmar as interações da proteína-proteína, BLI fornece dados detalhados sobre os parâmetros cinéticos das interações.
Para estudar o papel funcional de Vn na adesão bacteriana, podem ser utilizados dois ensaios diferentes. O primeiro ensaio descrito aqui é uma medição direta de aderência bacteriana Vn-revestido em superfícies de vidro, Considerando que o segundo ensaio examina aderência à superfície das células epiteliais. Para o primeiro ensaio, lâminas de vidro foram revestidas com Vn, e a ligação do WT ou estirpes mutantes de Hif foi avaliada pela coloração de Gram e microscopia. Esta técnica distingue prontamente bactérias baseadas na capacidade para vincular Vn12. Aderência bacteriana às células dos mamíferos foi então analisada pela adição de bactérias cultivadas em uma monocamada de células alveolares tipo II; fixação bacteriana foi avaliada pela contagem do número de formadoras unidades (CFUs). Bactérias aderidas e interiorizadas podem ser distinguidas na presença ou ausência de Vn4,13.
O papel da aquisição de Vn em resistência bacteriana soro foi avaliado usando um ensaio de matança de soro (ou seja, atividade bactericida do soro). Para avaliar a importância da aquisição de Vn na resistência do soro, a atividade bactericida do soro Vn-esgotada (VDS) foi comparada com o de soro humano normal (NHS). O método usado prontamente distingue Vn-ligação contra bactérias não-vinculativa com base na resistência do soro. Nós usamos este método para estudar o papel do Vn da resistência de soro de vários patógenos bacterianos4,12.
Inúmeros métodos têm sido relatados para estudar interações patógeno-hospedeiro. Aqui, descrevemos um conjunto de protocolos que pode facilmente ser adaptado para o estudo de qualquer agente patogénico a fim de avaliar o papel de Vn na patogênese. Nós testamos estes protocolos utilizando vários patógenos e Hif foi escolhido como um exemplo para este relatório.

<table><tbody><tr>Aquecedor <td>e resfriador de bloco seco</td><td>Eppendorf</td><td>5355</td> de <td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>60819-138</td><td>12 &vezes; 75 mm estilo</td></tr><tr><td>5% CO2 incubadora fornecida&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>BBD6220</tr><tr><td>tubo de fundo redondo de poliestireno de 6 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89000-478</td><td>Estilo 12 &vezes; 75 mm com tampa</td></tr><tr><td>Placas de 24 poços</td><td>BD Falcon</td><td>08-772-1H</td><td>Grau de cultura de células</td></tr><tr><td>30% Peróxido de hidrogénio (H2O2) Solução</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td>Grau de análise laboratorial</td></tr><tr><td>75 cm2 frasco de cultura de tecidos</td><td>BD Falcon</td><td>BD353136</td><td>Vented</td></tr><tr><td>Placa de fundo plano preta de 96 poços</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655090</td><td>Tratamento para cultura de tecidos &micro; Placas pretas claras</td></tr><tr><td>A549 Linha celular humana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86012804-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de desprendimento celular (Accutase)&nbsp;</td><td>Sensores Sigma-Aldrich</td><td>A6964-500ML</td><td>Grau de Cultura de Células</td></tr><tr><td>AR2G</td><td>Pall Life Science</td><td>18-5095</td><td>Sensor para proteína imobilizada por acoplamento de aminos&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>VWR</td><td>97064-786</td><td>Grau de análise</td></tr> de <tr><td>albuminas de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td>Adequado para cultura de células</td></tr><tr><td>Papel bibuloso&nbsp;</td><td>VWR</td><td>28511-007</td><td></td></tr><tr><td>Interferômetro de biocamada</td><td>Pall Life Science</td><td>FB-50258</td><td>Equipamento de medição de interferometria de bicamada</td></tr><tr><td>Solução violeta de cristal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT90132-1L</td><td></td></tr><tr><td>C4BP (proteína de ligação C4b)</td><td>Complement Technology, Inc.</td><td>A109</td><td>Comprado como forma líquida congelada</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Solução de carbol-fucsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT8018-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275-500G</td> Solução descolorante <td>de grau da American Chemical Society (ACS)</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75482-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>E. coli hospedeiro (E. coli BL21)</td><td>Novagen</td><td>69450-3</td><td>Expressão de proteína</td></tr><tr><td>hospedeiro F12 médio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421</td><td>Citômetro de fluxo de grau de cultura celular</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>651154</td><td>Grau de análise celular para aplicações de pesquisa&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro (FCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td>Adequado para cultura de células</td></tr><tr><td>Soro humano normal (NHS)</td><td>Complement Technology, Inc.</td>Anticorpos anti-ovinos conjugados com FITC <td>de soro humano combinado</td> <td>do NHS</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>STAR88F</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td> Policlonal <td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>Grau de cultura de células</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td>Adequado para cultura de células</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Marienfeld</td><td>640210</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos anti-His tag conjugados com HRP</td><td>Abcam</td><td>ab1269</td><td>Fator humano policlonal</td></tr><tr><td>H</td><td>Complement Technology, Inc.</td><td>A137</td><td>Comprado como Congelado forma</td></tr><tr><td>líquida C4BP</td><td>Complement Technology, Inc.</td><td>A109</td><td>Solução congelada</td></tr><tr><td>Albumina de soro humano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1653-10G</td><td>pó liofilizado</td></tr><tr><td>Coluna de resina de afinidade de histidina (HisTrap HP)</td><td>GE Health Care Life Science</td><td>17-5247-01</td><td>Colunas pré-embaladas com Ni Sepharose</td></tr><tr><td>PH marcado com His</td><td></td><td></td><td>Recombinantemente expresso e purificado em nosso laboratório</td></tr><tr><td>Solução de iodo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT902-8FOZ</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135-1LP</td><td>Análise de grau</td></tr><tr><td>&nbsp; Microscópio</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td>Microscópio invertido</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8902</td><td>simples, tamanho 25 mm & vezes; 75 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo contendo terminal C 6x His-tag na espinha dorsal (pET26(b))</td><td>Novagen</td><td>69862-3</td><td>DNA vector</td></tr><tr><td>Polysorb microtitre plates&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9410</td><td>Para ELISA</td></tr><tr><td>Hidróxido de Potássio (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6009</td><td>American Chemical Society (ACS) grau</td></tr><tr><td>Ovelha anti-anticorpos Vn</td> humanos <td>AbD Serotec</td><td>AHP396</td><td>Polyclonal</td></tr><tr><td>Shaker&nbsp;</td><td>Stuart Scientific</td><td>STR6</td><td>Agitador de plataforma</td></tr><tr><td>Cantil de cultura de tecidos</td><td>BD Falcon</td><td>3175167</td><td>75 cm2</td></tr><tr><td>&nbsp; Termomisturador&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3317</td><td>Agitador de aquecimento e resfriamento de bloco seco</td></tr><tr><td>Tetrametilbenzidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>860336-100MG</td><td>Grau ELISA</td></tr><tr><td>Vitronectina (Vn) de plasma humano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V8379-50UG</td><td>grau de cultura de células</td></tr></tbody></table>

ensaios para estudar o papel do vitronectina na adesão bacteriana e resistência de soro

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

As bactérias utilizam reguladores de complemento como um meio de evasão da resposta imune do hospedeiro. Aqui, descrevemos os protocolos para avaliar a aquisição de vitronectina papel em peças de superfície da célula bacteriana em resistência para o sistema imunológico do hospedeiro. Experimentos de citometria de fluxo identificaram vitronectina plasma humano como um ligante para a proteína de membrana externa bacteriana do receptor H de Haemophilus influenzae tipo f. Um ensaio enzima-lig da imunoabsorção foi empregado para caracterizar as interações da proteína-proteína entre proteína recombinante purificada H e vitronectina, e vinculação afinidade foi avaliada usando interferometria de bio-camada. A importância biológica da vinculação da vitronectina a proteína H na superfície da célula bacteriana em evasão da resposta imune do hospedeiro foi confirmada usando um ensaio de resistência de soro com soro humano normal e vitronectina empobrecido. A importância da vitronectina na adesão bacteriana foi analisada usando lâminas de vidro com e sem revestimento vitronectina, seguido de coloração de Gram. Finalmente, a adesão bacteriana em monocamadas de células epiteliais alveolares humana foi investigada. Os protocolos descritos aqui podem ser facilmente adaptados para o estudo de todas as espécies bacterianas de interesse.

Vn-vinculação à superfície de bactérias foi determinada por citometria de fluxo. Hif todos os isolados clínicos testados neste estudo recrutou Vn à superfície da célula. Nenhuma interação de Vn com superfície celular foi observada para a tensão de controle negativo de e. coli (Figura 1A). Como mostrado na Figura 1B, PH é uma major Vn-proteína na superfície das células de Hif. Vinculação ...

Este relatório descreve protocolos para caracterizar as interações entre proteínas de membrana externa bacteriana e a vitronectina regulador do complemento humano. Os protocolos podem ser usados para estudar as reacções de vinculação e função biológica da vitronectina em qualquer espécie bacteriana.

Ensaios para estudar o papel do vitronectina na adesão bacteriana e resistência de soro

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de interação hospedeiro-patógeno, como como patógenos bacterianos causam doenças em humanos utilizando proteínas humanas. A principal vantagem desta técnica é que ela pode responder se algum patógeno pode utilizar a Vitronectin para estabelecer a infecção do hospedeiro. Vamos focar na Vitronectin, uma proteína hospedeira que participa da matriz extracelular, mas também funciona como um inibidor complementar na via determinante da ativação complementar.Esses fatos são muito importantes e altamente atraentes para patógenos que causam doenças em humanos. Para se preparar para a citometria de fluxo, resuspenha as pelotas bacterianas com 50 microliters de tampão de bloqueio contendo 250 nanomolars vitronectina. Em seguida, incubar as amostras por uma hora em temperatura ambiente sem tremer.Após a incubação, pelota as bactérias por centrifugação a 3.500 g por cinco minutos. Em seguida, lave as pelotas três vezes usando PBS e passos de centrifugação semelhantes. Após a lavagem, adicione 50 microlitadores de anticorpos policlonais de vitronectina vitronectina primária à pelota bacteriana em uma diluição de 1 a 100 na PBS BSA.In

assays-for-studying-role-vitronectin-bacterial-adhesion-serum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este protocolo é um ensaio de adesão bacteriana simples que consiste na contagem do número de unidades formadoras de colônia de bactérias que são aderidos em células em cultura. O ensaio é robusto, independente da adesina estudado, e inúmeras variações são usadas na maioria dos laboratórios que trabalham com patogênese bacteriana.

Ensaio in vitro da adesão bacteriana em mamíferos Células Epiteliais

Este vídeo descreve uma técnica baseada em ELISA que detecta interações proteína-proteína entre duas proteínas, medindo a ligação da segunda proteína à primeira proteína imobilizada. A segunda proteína ligada é detectada usando anticorpos específicos marcados com uma enzima, como a peroxidase de rábano.

Método baseado em ELISA para analisar interações entre proteínas de isca e presa

Neste vídeo, demonstramos um ensaio para estudar o papel da vitronectina na adesão de Haemophilus influenzae às células epiteliais do hospedeiro.

Um ensaio para estudar o papel da vitronectina na adesão bacteriana às células epiteliais do hospedeiro

Este vídeo demonstra o papel da vitronectina, uma glicoproteína sérica humana, na resistência bacteriana. Os anticorpos no soro interagem com as proteínas da superfície bacteriana, ativando as proteínas do complemento e formando o complexo de ataque à membrana, causando lise celular bacteriana. A ligação da vitronectina à proteína da membrana bacteriana impede a formação do complexo de ataque à membrana, resultando na sobrevivência bacteriana.

Determinando o papel da vitronectina na resistência bacteriana à atividade bactericida do soro humano

Neste vídeo, demonstramos um ensaio utilizando microscopia de fluorescência para detectar a adesão de células cancerígenas a armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs). Nos poços de teste, há um aumento notável no número de células cancerígenas marcadas com fluorescência que aderem aos TNEs, enquanto os poços tratados com DNase exibem adesão reduzida de células cancerígenas aos TNEs.

Ensaio de adesão in vitro para detectar a adesão de células cancerígenas a armadilhas extracelulares de neutrófilos

Este vídeo demonstra a detecção da interação da vitronectina com proteínas de superfície bacteriana. A análise por citometria de fluxo mede o sinal de fluorescência de anticorpos marcados com fluorescência ligados à vitronectina, confirmando sua presença na superfície bacteriana. Essa técnica fornece informações sobre as interações patógeno-hospedeiro e possíveis terapias de infecção bacteriana.

Detecção de ligação de vitronectina a superfícies bacterianas usando citometria de fluxo

A aderência de neutrófilos ao endotélio activado em locais de infecção é um componente integral da resposta inflamatória do hospedeiro. Descritos neste relatório é um ensaio de ligação de neutrófilos, que permite...

Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

Para estudar a interação das bactérias com os vasos sanguíneos sob tensão de cisalhamento, são descritas uma câmara de fluxo e um modelo de microscopia intravital mesentérica in vivo que permite dissecar os fatores bacterianos e hospedeiros que contribuem para a adesão vascular.

In Vitro e In Vivo modelo para estudar a adesão bacteriana para o Vaso de parede em condições de escoamento

A ligação bacteriana às células hospedeiras é uma etapa fundamental durante a colonização e infecção do hospedeiro. Este protocolo descreve a geração de adesinas recombinantes acopladas a polímeros como materiais biomiméticos que permitem a análise da contribuição de adesinas individuais para esses processos, independentemente de outros fatores bacterianos.

Materiais biomiméticos para caracterizar as interações bactérias hospedeiras-

Um método é descrito aqui para a determinação da associação e competição entre reinos (bacterianas e fúngicas) pela adesão a monocamadas de células HeLa infectadas por vírus. Este protocolo pode ser estendido a várias combinações de procariontes, eucariotos e vírus.

Determinação do biofilme Iniciação em células infectadas por vírus por bactérias e fungos

Um protocolo detalhado para imagens de plaquetas migratórias únicas usando amarras avidina-biotina funcionalizadas por RGD com densidade ajustável é fornecido, revelando que as plaquetas geram força suficiente para romper a ligação avidina-biotina.

Um ensaio in vitro para estudar a migração plaquetária usando amarras Avidina-Biotina Funcionalizadas por RGD

Aprenda ensaios de citometria de fluxo e ELISA para estudar a interação entre vitronectina humana e proteínas bacterianas. Este método ajuda pesquisadores a investigar mecanismos de adesão e resistência a soro em patógenos.

Ensaios para estudar o papel do vitronectina na adesão bacteriana e resistência de soro

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