Name: Modelo Animal avançado de Colorectal metástase no fígado: técnicas de imagem e Propriedades de metastáticos Clones (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Aprenda a modelar a colonização hepática por clones de tumores metastáticos de câncer colorretal usando linhagens celulares duplamente marcadas. Este método permite visualizar a heterogeneidade metastática e identificar genes associados a padrões oligometastáticos e polimetastáticos.

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Nós gostaríamos de agradecer ao Dr. Geoffrey L. Greene (Universidade de Chicago) para o plasmídeo Luc2-tdTomato ea linha de células HCT116, Mr. Ani Solanki (Animal Resource Center) para a gestão ratos, e Dr. Lara Leoni pela assistência com a DLIT. Quantificações de intensidades fluorescentes e luminescentes foram realizados no Resource Research imagem Small Animal Integrado da Universidade de Chicago, em um espectro IVIS (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Este trabalho foi apoiado pela Virgínia e Fundo Ludwig DK para Pesquisa do Câncer, a Fundação Lung Cancer Research (LCRF), a Fundação do Câncer de Próstata (PCF), e o Centro de Suporte Grant Câncer (P30CA014599). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Chicago (Protocolo # 72213-09) e realizado em condições estéreis. 1. Preparações <ol><li> Adicione 500 mL de meio para a cultura de células tumorais HCT116: Modified Eagle Médium da Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), 100 U / mL de penicilina, e 100 mg / ml de estreptomicina. </li><li> Autoclave os instrumentos a serem utilizados para o modelo de injecção baço, incluindo 3 - 4 toalhas cirúrgicas, gazes, dois captadores Adson pequenas, um controlador de agulha, dois pares de tesouras, uma pequena braçadeira, e 3 microclips, a 251 ° F durante 20 min . </li><li> Prepare anestesia pós-operatório para os ratinhos, a ser administrada por via subcutânea, após a injecção do baço. Dilui-se 2-4 ug de buprenorfina em 500 ul de solução salina normal a 0,9 por ratinho. </li><li> Preparar alíquotas de 150 mg / 150 mL de luciferina de pirilampo para injecções intraperitoneais During os ensaios de bioluminescência. Armazenar a -20 ° C e protegido da luz. </li></ol> 2. Geração de luciferase / tdTomato-rotulados monoclonais celular Lines 10,11 <ol><li> Descongelar e manter as células HCT116 do cancro colo-rectais humanos e 293FT células de rim embrionário humano em DMEM com 10% de FBS, 100 U / mL de penicilina, e 100 mg / ml de estreptomicina. Manter em cultura em 5% de CO 2 e 37 ° C. </li><li> Produção de um lentivírus de título elevado. <ol><li> Em D 1, a placa 10 - 12 x 10 6 293FT células entre a passagem 3 e 10 em placas de cultura celular de 15 cm em 18 ml de DMEM completo (cDMEM) com 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina e aminoácidos não essenciais 1% . Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Em D 2, transfectar as células com a seguinte solução de transfecção: <ol><li> Para cada prato, utilizar o seguinte: uma mistura de ADN de 37,5 ug de pFUG lentiviral vector inserido com a luciferase (Luc2) e tdTomatoconstrói 11 (uma oferta do Dr. Geoffrey Greene na Universidade de Chicago), 25 ug de pCMVΔ8.74, e 12,5 ug de pMD2.G ressuspensas num total de 1062 mL de H 2 O. estéril Adicionar 188 uL de 2 M de CaCl2. </li><li> Adicionar 1250 mL de solução salina 2x tamponada com Hepes (HBS, Hepes 50 mM, 1,5 mM de Na 2 HPO 4, e NaCl 180 mM, pH 7,12) para a solução de ADN / CaCl2, uma gota de cada vez, enquanto se fazia borbulhar bolhas através do solução com uma pipeta. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 20 min, e em seguida, adicionar 15,5 mL de RT cDMEM e cloroquina para fazer uma concentração final de 25 uM. </li></ol></li><li> Aspirar a mídia em cada prato de 293FT células e substituir com a solução de transfecção. Adicionar 16 ml da solução de transfecção lentamente, como as células plaqueadas desalojar facilmente. </li><li> Em D 3, após 8-16 h, remover a solução de transfecção e lave as células uma vez com fosfato de Dulbecco tamponado com solução salina (DPBS), novamente Taking cuidado para não desalojar as células. Substituir a mídia com 18 mL de cDMEM fresco com Hepes 10 mM. NOTA: mova lentamente pratos, aspirar a solução de transfecção, e adicionar os meios de comunicação através da parede lateral de placas de modo a não desalojar as células. </li><li> Em D 4, às 48 h desde o momento da transfecção, recolher os meios de comunicação a partir das placas por aspiração lentamente com uma pipeta, de modo a não desalojar as células. Centrifugar os meios recolhidos a 300 xg durante 5 minutos para precipitar o grande detritos celulares. </li><li> Filtra-se o sobrenadante viral utilizando um filtro de 0,45 um balão e centrifugação utilizando um rotor SW-28 durante 2 h a 50000 xg e 4 ° C com baixa ligação às proteínas. Decantar o sobrenadante imediatamente após a conclusão da centrifugação e secar o interior do tubo com o limpa pára-brisas. </li><li> Ressuspender o sedimento viral em 50 uL de meio de soro reduzido (RSM) com 1% de FBS. As aliquotas podem ser guardadas a -80 ° C para uso futuro (estoque viral). </li></ol></li><li> Transduzir o lentivírusES em células HCT116 e gerar um painel de clones tdTomato-positivos. <ol><li> Placa as células HCT-116 a uma densidade de 1 x 10 5 em placas de 24 poços 1 d antes da infecção viral. </li><li> Diluir 40 uL de vírus ressuspenso (a partir de 2.2.7) em 4 ml de RSM (diluição 1: 100) com 1% de penicilina / estreptomicina e 8 ug / mL de polibreno (CRSM). </li><li> No dia da infecção, lavar as células uma vez com DPBS, e então adicionar 250 ul de vírus diluído a partir do passo 2.3.2 a cada poço. Incuba-se durante 4 h a 37 ° C e CO2 a 5% e, em seguida, adicionar 1 ml de cDMEM a cada poço; incubar a 37 ° C e 5% de CO2 durante 48-72 h. </li><li> Ressuspender as células com 1 ml de tripsina a 0,05% e EDTA 0,53 mM, e em seguida adicionar 1 ml de cDMEM para neutralizar a tripsina. Transferir as células para um tubo de microcentrífuga e pelete a 300 xg durante 4 min. Lava-se a pelete 3x em 1 mL de Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS) mais 2% de FBS. </li><li> Ressuspender o sedimento do passo 2.3.4com tampão FACS (2% ECF e EDTA 2 mM em PBS) a uma suspensão de uma única célula a 1 x 10 6 células / ml. </li><li> Ordenar as células HCT116 tdTomato-positivos usando um classificador de células, gating para células PE-positivas (excitação / emissão: 556/585 nm). Crescer as células recolhidas em cerca de 10 cm de placa em 5% de CO 2 e 37 ° C para gerar células HCT116 tdTomato-positiva parentais (Figura 1A). </li><li> Ressuspender as células HCT116 tdTomato-positiva parentais de 2.3.6 com 8 ml de tripsina a 0,05% e EDTA 0,53 mM, durante 3-5 min, e em seguida, adicionar 8 mL de cDMEM para neutralizar a tripsina. <ol><li> Transferir as células para um tubo de 50 mL e de pelotas a 300 xg durante 4 min. Remover o sobrenadante e diluir as células HCT116 tdTomato-positiva parentais para uma célula por 200 uL no cDMEM (Figura 1B). </li></ol></li><li> Placa de uma única célula (200 uL da diluição) por poço numa placa de 96 cavidades, com 5% de CO 2 e 37 ° C (Figura 1C). </li><li> Cresça monoclones individuais em frascos de 5% de CO 2 e 37 ° C. (Figura 1D). </li></ol></li></ol> 3. A calibração da intensidade de fluorescência de sinal em função do número de células <ol><li> Placa as células HCT-116 transfectadas, agora referidos como HCT116-L2T, a uma densidade de 0, 10 3, 2 x 10 4, 3 x 10 5, 5 x 10 4, 7 x 10 4, 9 x 10 4 e 10 5 células / poço em placas de 96 poços em triplicado para cada densidade. </li><li> Após 5 horas de incubação, as quantificar tdTomato intensidades fluorescentes utilizando IVIS 10. <ol><li> Clique no ícone do software de imagem na área de trabalho para iniciar o software. Clique no botão &quot;Iniciar&quot; para inicializar o sistema de imagem. Depois de terminar a inicialização (que leva cerca de alguns minutos), selecione &quot;fluorescência&quot;, &quot;4 segundos&quot; tempo de exposição, binning &quot;Medium&quot;, &quot;2&quot; F / stop &quot;, 535&quot; filtro de excitação,e &quot;580&quot; filtro de emissão. </li><li> Coloque a placa de 96 poços na estação de imagens e clique em &quot;Adquirir&quot; para iniciar a geração de imagens. Depois que a imagem é adquirida, clique em &quot;Ferramentas de ROI&quot; na paleta de ferramentas e selecione 12 x 8 a partir do ícone de fenda. </li><li> Criar 12 x 8 fendas para cobrir a área de sinal na imagem da placa de 96 poços e clique na guia medições. Observe uma janela com uma tabela de medições de ROI com unidades de fótons por s por esterradiano por centímetro quadrado (fótons / s / sr / cm 2). </li></ol></li><li> Construir um gráfico de dispersão com o argumento (eixo X) igual ao número de células e a função (eixo Y) que representa a intensidade do sinal. Calcular curvas de regressão utilizando um software de análise de dados para calcular a quantidade de células correspondentes à unidade de intensidade fluorescente (Figura 2) 10. </li></ol> 4. Modelo Animal de metástases hepáticas <ol><li> Uma vez que as células HCT116-L2T chegar a 70- 80% de confluência, prepará-los aproximadamente 1 h antes da injecção de baço. Dissociar as células usando tripsina a 0,05% em EDTA 0,53 mM durante 3 - 5 minutos, e, em seguida, neutralizá-los com uma quantidade igual de cDMEM. Certifique-se de pipetar cuidadosamente para evitar aglomeração. </li><li> Contar as células com um contador de células automático. </li><li> Ressuspender as células em 1X DPBS para uma concentração de 1,2 - 2 x 10 6 células / 100 ul. Certifique-se de pipeta e voltar a suspender as células cuidadosamente para evitar aglomeração. </li><li> Manter as células em gelo até injecção, ocasionalmente, ressuspendendo-as no tubo. </li><li> Antes de se anestesiar os ratos, fornecer um anestésico pré-operatória e de bolus fluido por injecção subcutânea de 500 ul da mistura de buprenorfina descrito no passo 1.3. Administrar a mesma dose de mistura buprenorfina adicional duas vezes por dia até que os sinais de dor (mobilidade reduzida, estatura curvada, a falta de noivo, vocalização quando manuseado) ter resolvido. </li><li> Anestesiar de 6 a 8 semanasratinhos atímicos fêmea -old nu com 2% de isoflurano em oxigênio em uma câmara de anestesia. Confirmar que os ratos estão completamente sob anestesia por beliscar a cauda. Use vet pomada sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia. Transfira cada rato anestesiado a um cone do nariz individual para a injeção baço. Antes da incisão, cada rato deve ser coberta com uma cortina cirúrgica estéril. </li><li> Identificar o baço como uma área de roxo visto externamente através da pele no flanco esquerdo dos ratinhos nus. Com uma tesoura de microdissecção, fazer uma incisão 8 milímetros flanco esquerdo sobre a pele um pouco acima do baço. <ol><li> Em seguida, levante a parede abdominal e fazer uma pequena incisão. Permitir que o ar no interior da cavidade abdominal, de modo a que os órgãos internos afastar-se do local da incisão. Aumentar a incisão da parede abdominal para aproximadamente 5 mm. </li><li> Expor o baço através da aplicação de pressão suavemente em torno da incisão com um cotonete. Se necessário, a gordura pancreático pode ser suavemente homemipulated para ajudar com a exposição de modo a não prejudicar o baço. </li></ol></li><li> Lentamente, injectar 100 ul de células usando uma seringa de 1 ml com uma agulha G 27, para a ponta do baço exposta. Injectar-se lentamente, ao longo de um período de pelo menos 30 - 60 s, para evitar tumores extra-hepáticas. </li><li> Coloque um microclipe no baço antes de remover a agulha no final da injecção para evitar a fuga da suspensão de células injectadas. </li><li> Deixe o microclipe no local por 5 min. </li><li> 5 min após a injecção, realizar uma esplenectomia usando um cautério de mão para hemostasia. Dissecar o hilo do baço, a partir do lado anterior. Ao dissecar grandes vasos, pré-coagulação do lado proximal do recipiente com o tecido adiposo adjacente, utilizando cautério para evitar o sangramento excessivo. NOTA: Os métodos para hemostasia: coagular o ponto de sangramento diretamente com cautério, aplicar pressão para o ponto de sangramento por 3-5 min, ou sutura-ligadura o ponto de sangramento com um empate 5-0 seda. </li&gt; <li> Fechar a incisão de flanco de cada murganho em duas camadas. Em primeiro lugar, fechar a parede abdominal com uma sutura absorvível 5-0 entrançada (por exemplo, Vicryl) num ponto horizontal. Em seguida, fechar a pele usando um 4-0 não absorvíveis sutura monofilamento (por exemplo, prolene), novamente com um único ponto horizontal. </li><li> Limpe todos os instrumentos por pulverização 70% isopropanol para manter condições estéreis entre cada procedimento. NOTA: Certifique-se os animais são aquecidos enquanto eles despertar da anestesia. Monitorar todos os ratos pós-operatório até se tornarem ambulatorial e voltar à atividade normal. Tipicamente, o tempo de recuperação é de aproximadamente 3-5 min. Não deixar os animais sem vigilância até que tenham recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que ele se recuperou totalmente. </li></ol> 5. In Vivo de Imagiologia bioluminescente <ol><li> Realizar imagem emsemanalmente para medir e quantificar alterações na bioluminescência ao longo do tempo. </li><li> Coloque os ratos em uma câmara de anestesia e anestesiar-los com 2% de isoflurano em oxigênio. Confirmar que os ratos estão completamente sob anestesia por beliscar as caudas. Use vet pomada sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia. </li><li> Em seguida, intraperitoneal injetar cada rato com 150 mL da preprepared pirilampo luciferina a partir do passo 1.4. </li><li> Coloque a ratos em um IVIS com cones do nariz individuais administração de isoflurano. Coloque a ratinhos em posição supina com espaçadores entre eles para minimizar o sinal de ratinhos adjacentes. Um máximo de cinco ratinhos pode ser trabalhada de uma só vez. </li><li> Medir e analisar intensidades bioluminescentes 3 min após a injeção luciferina. <ol><li> Depois de inicializar o IVIS como descrito no passo 3.2.1, selecione &quot;Luminescent&quot;, &quot;um segundo&quot; tempo de exposição e binning &quot;Medium&quot;. </li><li> Clique no botão &quot;Adquirir&quot; para iniciar imaging. Certifique-se de executar cada imagem em um tempo consistente (3 min) após a injeção luciferina. </li><li> Depois que a imagem é adquirida, uma janela de imagem e paleta de ferramentas irá aparecer. Ferramentas clique &quot;ROI&quot; e selecionar &quot;1&quot;, &quot;2&quot;, &quot;3&quot;, &quot;4&quot; ou &quot;5&quot;, a partir do ícone de círculo, que corresponde ao número de ratinhos trabalhada. </li><li> Para definir regiões de interesse (ROI), circule a área do sinal do sinal luminescente na cavidade abdominal do mouse e clique em &quot;medidas&quot; do ROI como uma unidade arbitrária de eficiência radiante ((fótons / s / cm 2 / esferorradiano) / (uW / cm2)). Certifique-se de ter um círculo ROI adicional do fundo. </li></ol></li><li> No pós-injecção e antes de sacrifício de animais de quatro semanas, execute difusa luminescentes tomografia (DLIT) usando IVIS para avaliar a carga tumoral e distribuição usando em tempo real reconstrução 3D de intensidades bioluminescentes de colónias tumorais individuais. <ol&gt; <li> Anestesiar os ratos e injectar luciferina, tal como descrito no passo 5.2.4. DLIT é realizada em um rato de cada vez. </li><li> Depois de inicializar o IVIS, conforme descrito na etapa 3.2.1, selecione &quot;Assistente de Imagem&quot;, &quot;bioluminescência&quot;, e clique em &quot;Next&quot;. Selecione &quot;DLIT&quot; e clique em &quot;Next&quot;. Escolha sondas &quot;Firefly&quot; e clique em &quot;Next&quot;. Selecione &quot;mouse&quot; assunto de imagem, parâmetro de exposição &quot;Auto&quot;, o campo &quot;C-13 cm&quot; de vista, e &quot;0,5 cm&quot; height assunto, e clique em &quot;Next&quot;. Clique no botão &quot;Adquirir&quot; para iniciar a geração de imagens. </li><li> Depois que a imagem é adquirida, selecione a guia &quot;DLIT Reconstrução 3D&quot; e &quot;Analisar&quot; e clique em &quot;Reconstruir&quot; para gerar a imagem reconstrução 3D. </li><li> Clique em &quot;Ferramentas&quot; e &quot;Animação 3D&quot;. Selecione &quot;CCW rotação no eixo Y&quot; na janela de animação 3D. Clique em &quot;Record&quot; e &quot;Salvar&quot; em um arquivo de formato .mov. </li></ol></li></ol> 6. Ex Vivo Fluorescent Imagem <ol><li> Sacrificar os ratos por deslocamento cervical, enquanto anestesiados, ou de acordo com as diretrizes institucionais em 4 - 6 semanas após as injecções de baço. </li><li> Colher o fígado. Faça uma incisão horizontal da esquerda para o flanco direito. Agarrando o processo xifóide com um captador, dissecar o falciforme, a veia hepática e da veia cava inferior. <ol><li> Dissecar o ligamento direito hepato-renal, o ligamento hepatoduodenal, eo ligamento hepato-renal esquerda, tomando cuidado para não ferir o lobo caudado, enquanto dissecando o ligamento hepatoduodenal. Após a colheita do fígado, remover a vesícula biliar, pois isso irá exibir autofluorescência. Tome nota de quaisquer tumores extra-hepáticas adicional presente. </li></ol></li><li> Tome nota dos números e tamanhos de tumores hepáticos presente macroscopicamente, e colocar os fígados colhidos em DPBS. NOTA: Os tumores são macroscopicamente visível a olho nucomo tumores branco (para um exemplo representativo, ver Figura 4). </li><li> Antes da colocação na folha de imagem, tome cada fígado e remova cuidadosamente o excesso de líquido borrando em uma toalha de papel. </li><li> Medem-se as intensidades de fluorescência de cada colónia tumor utilizando o IVIS. <ol><li> Selecione &quot;fluorescência&quot;, &quot;4 segundos&quot; tempo de exposição, binning &quot;Medium&quot;, &quot;2&quot; F / stop &quot;, 535&quot; filtro de excitação, e &quot;580&quot; filtro de emissão. Clique no botão &quot;Adquirir&quot; para iniciar a geração de imagens. </li><li> Depois de adquirir a imagem, localizar a janela de imagem e paleta de ferramentas. Clique em &quot;Ferramentas de ROI&quot; e selecione &quot;1&quot; a partir do ícone do círculo. Para definir ROIs, circule a área do sinal de colónias tumorais individuais sobre a imagem e clique em &quot;medidas&quot; do ROI como uma unidade arbitrária de eficiência radiante ((fótons / s / cm 2 / esterradiano) / (mW / cm 2) ). Certifique-se de ter um círculo ROI adicional do fundo. </li></ol&gt; </li><li> Calcule o volume total do tumor, assumindo que ela seja uma esfera. O volume do tumor = 4 x π XR 3/3 (r = radius). Calcula-se a fracção de células formadoras de colónias do tumor (Fc) como o número de tumores no fígado, dividido pelo número de células splenically injectado. </li><li> Calcule o número total de células por colónia (= X) a partir da aproximação linear a partir do passo 3.3. Calcule o número de divisões celulares (= Y) como Y = log 2 X eo Td como Td (dia) = 28 / Y. </li></ol>

<ol><li>Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+score+for+predicting+recurrence+after+hepatic+resection+for+metastatic+colorectal+cancer%3A+analysis+of+1001+consecutive+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases.</a> Ann. Surg. 230 (3), 309-318 (1999).</li>
<li>Pawlik, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surgical+margin+status+on+survival+and+site+of+recurrence+after+hepatic+resection+for+colorectal+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases.</a> Ann. Surg. 241 (5), 715-722 (2005).</li>
<li>Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+Cancer%2C+Systemic+Inflammation%2C+and+Outcome%3A+Staging+the+Tumor+and+Staging+the+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host.</a> Ann. Surg. 263 (2), 326-336 (2016).</li>
<li>Veen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Follow-Up+and+Survivorship+After+Completing+Systematic+Surveillance+in+Stage+I-III+Colorectal+Cancer%3A+Who+Is+Still+at+Risk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastrointest.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk.</a> J. Gastrointest. Cancer. 46 (3), 259-266 (2015).</li>
<li>Siegel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+treatment+and+survivorship+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J.+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer treatment and survivorship statistics.</a> CA Cancer J. Clin. 62 (2), 220-241 (2012).</li>
<li>O'Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colon+cancer+survival+rates+with+the+new+American+Joint+Committee+on+Cancer+sixth+edition+staging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging.</a> J. Natl. Cancer Inst. 96 (19), 1420-1425 (2004).</li>
<li>House, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+after+hepatic+resection+for+metastatic+colorectal+cancer%3A+trends+in+outcomes+for+1%2C600+patients+during+two+decades+at+a+single+institution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Surg%22%5BJournal%5D)">Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution.</a> J. Am. Coll. Surg. 210 (5), 744-752 (2010).</li>
<li>Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+bioluminescence+imaging+of+colorectal+liver+metastases+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse.</a> J. Surg. Res. 122 (2), 225-230 (2004).</li>
<li>Rajendran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+bioluminescent+hepatic+tumour+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine bioluminescent hepatic tumour model.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li>
<li>Oshima, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+tumor+clones+with+differential+liver+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Imaging of tumor clones with differential liver colonization.</a> Sci. Rep. 5 (10946), (2015).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+from+human+breast+tumors+are+involved+in+spontaneous+metastases+in+orthotopic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (42), 18115-18120 (2010).</li>
<li>Wang, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analyses+identify+osteopontin%2C+LAMB3+and+ITGB1+as+critical+pro-metastatic+genes+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer.</a> PLoS One. 8 (2), e55714(2013).</li>
<li>Fidler, I. J., Kripke, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+results+from+preexisting+variant+cells+within+a+malignant+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor.</a> Science. 197 (4306), 893-895 (1977).</li>
<li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li>
<li>Khodarev, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT1+pathway+mediates+amplification+of+metastatic+potential+and+resistance+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy.</a> PLoS One. 4 (6), e5821(2009).</li>
<li>Langley, R. R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell-organ+microenvironment+interactions+in+the+pathogenesis+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis.</a> Endocr. Rev. 28 (3), 297-321 (2007).</li>
<li>Lussier, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligo-+and+polymetastatic+progression+in+lung+metastasis%28es%29+patients+is+associated+with+specific+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs.</a> PLoS One. 7 (12), e50141(2012).</li>
<li>Lussier, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+characterizes+oligometastasis%28es%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es).</a> PLoS One. 6 (12), e28650(2011).</li>
<li>Calon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+of+colorectal+cancer+on+a+TGF-beta-driven+program+in+stromal+cells+for+metastasis+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation.</a> Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).</li>
<li>Vanharanta, S., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+metastatic+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Origins of metastatic traits.</a> Cancer Cell. 24 (4), 410-421 (2013).</li>
<li>Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathways%3A+Interferon%2FStat1+Pathway%3A+Role+in+the+tumor+resistance+to+genotoxic+stress+and+aggressive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth.</a> Clin. Cancer Res. 18 (11), 3015-3021 (2012).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-stimulated+gene+15+%28ISG15%29+is+a+trigger+for+tumorigenesis+and+metastasis+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma.</a> Oncotarget. 5 (18), 8429-8441 (2014).</li>
<li>Cespedes, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+microinjection+of+human+colon+cancer+cells+in+nude+mice+induces+tumor+foci+in+all+clinically+relevant+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites.</a> Am. J. Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).</li>
<li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> J. Vis. Exp. (10), (2007).</li>
<li>Soares, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+murine+model+of+hepatic+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A preclinical murine model of hepatic metastases.</a> J. Vis. Exp. (27), e51677(2014).</li>
<li>Evans, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+mice+to+men%3A+Murine+models+of+colorectal+cancer+for+use+in+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncol.+Hematol%22%5BJournal%5D)">From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O modelo animal apresentado no relatório atual é baseada em duas abordagens principais. Em primeiro lugar, a fim de garantir a capacidade de observar os clones metastáticas com diferentes propensões para colonizar e proliferar no fígado, um painel de linhas celulares monoclonais altamente heterogénea foi estabelecida, ao invés de uma linha de células de cancro não fraccionada estabelecida 12,13. A abordagem monoclonal para o desenvolvimento de metástase é justificada por dados genômicos recentes 14...

Os pacientes com metástases do fígado a partir de cancros colorectais primários (CRC) são caracterizados por um mau prognóstico. A taxa de sobrevida em 5 anos para primários não-metastáticos CRC (fases I - III) é estimado como 75 - 88% 3,4, enquanto os pacientes com metástases hepáticas (estágio IV) têm uma taxa de sobrevivência de 5 anos de apenas 8 - 12% 5 , 6. No entanto, os doentes metastáticos representam um grupo heterogêneo, apresentando-se com diferentes números de metástases e diferentes tempos de recorrência. As observações clinicas indicam que o número de metástases (o qual pode ser proporcional à capacidade de colonização ou frequência de colonização) e o tamanho de uma única metástase (proporcional à taxa de crescimento local) constituem factores de risco independentes, 1,7. Em outras palavras, o sucesso de clones que colonizam metastáticos do fígado depende de duas propriedades importantes: a sua capacidade de crescer e a sua capacidade para difundir e sobreviver no microambiente do fígado. O designde modelos clínicos de sucesso com a capacidade de capturar e quantificar as propriedades metastáticas de clones pode melhorar drasticamente a nossa compreensão da biologia do fígado e metástases fornecer uma ferramenta eficaz para o desenho de potenciais abordagens terapêuticas. Todos os modelos de metástase hepática experimental foram previamente relatado 8,9, mas nenhum deles desde que a capacidade de capturar e descrever as propriedades dos clones metastáticos individuais tanto in vivo e ex vivo quantitativamente. Aqui, apresentamos um novo modelo, avançado de metástase do fígado que inclui a geração de clones de tumor com diferentes eficiências de colonização fígado e propriedades de crescimento. Utilizou-se uma combinação de dupla-marcação das células cancerosas com a luciferase e a proteína fluorescente tdTomato com a geração de linhas celulares monoclonais que têm diferenças intrínsecas na capacidade metastática. Neste modelo experimental, os dados indicam que o desenvolvimento demetástases do fígado pode ser descrito em termos de frequência e tempo de duplicação de colonização (Td), o que é consistente com as observações clínicas. A natureza quantitativa deste modelo torna facilmente adotáveis ​​para a descoberta de drogas e fins de diagnóstico.

<table><tbody><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo Sistema de imagem</td><td>Calibre Life Sciences</td><td>124262</td><td>In Vivo</td></tr><tr><td>Software LivingImage 4.0</td> Software de <td>imagem</td>de <td>128165</td> de ciências <td>da vida</td></tr><tr><td>VAD-MGX Máquina anestésica de pesquisa</td><td>Vetamac</td><td>VAD-MGX</td><td>Máquina de anestesia por inalação</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-118</td><td>Reagentes de cultura celular</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>Reagentes de cultura celular</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina, líquida (10.000 unidades de penicilina; 10.000 &mu; g estreptomicina)</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td>Reagentes de cultura de células</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>24020117</td><td>Reagentes de cultura de células</td></tr><tr><td>Injeção de Buprenex (0,3 mg/mL)</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.</td><td>12496-0757-5</td> Sistema de Cautério <td>Gemini de cloridrato de buprenorfina</td></tr><tr><td></td><td>Braintree Scientific</td><td>GEM 5917</td><td>Cautério portátil para esplenectomia</td></tr><tr><td>Micro Clip; Reto; 70 gramas de pressão; Largura do clipe de 1,5 mm; Mandíbula de 10 mm Comprimento</td><td>Roboz Instrumento Cirúrgico</td><td>RS-5426</td><td>Hemoclip: Instrumentos de hemostasia após injeção no baço</td></tr><tr><td>D-luciferina, sal de potássio Goldbio</td><td>Technology</td><td>LUCK-1G</td><td>Luciferina sal de potássio</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Meio de soro reduzido</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>Meio de soro reduzido</td></tr><tr><td>TC20 Contador de células automatizado</td><td>BIO-RAD</td><td>1450102</td><td>Contador automático de células</td></tr><tr><td>Software JMP10</td><td>SAS Institute</td><td></td><td>Software de análise de dados</td></tr><tr><td>BD FACSAria II classificador de células</td><td>BD Biocsiences</td><td>Classificador de células</td><td></td></tr></tbody></table>

modelo animal avançado de colorectal metástase no fígado: técnicas de imagem e propriedades de metastáticos clones

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Os pacientes com um número limitado de metástases hepáticas e taxas lentas de progressão podem ser tratadas com sucesso com o tratamento local se aproxima de 1,2. No entanto, pouco se sabe sobre a heterogeneidade das metástases do fígado, e modelos animais capazes de avaliar o desenvolvimento de colónias metastáticas individuais são necessários. Aqui, apresentamos um modelo avançado de metástases hepáticas que fornece a capacidade de visualizar quantitativamente o desenvolvimento de clones tumorais individuais no fígado e estimar sua cinética de crescimento e eficiência de colonização. Geramos um painel de derivados monoclonais de células de câncer colorretal humano HCT116 estavelmente marcadas com luciferase e tdTomato e possuindo diferentes propriedades de crescimento. Com a injecção do baço seguido de uma esplenectomia, a maioria destes clones são capazes de gerar metástases hepáticas, mas com diferentes frequências de colonização e taxas de crescimento diferentes. Usando o Syste In vivo de imagensm (IVIS), é possível visualizar e quantificar o desenvolvimento de metástase com luminescente in vivo e ex vivo imagiologia fluorescente. Além disso, difusa luminescentes tomografia (DLIT) proporciona uma distribuição 3D de metástases do fígado in vivo. Ex vivo imagem fluorescente de fígados colhidos fornece medições quantitativas de colónias metastáticas hepáticas individuais, permitindo a avaliação da frequência de colonização do fígado e as cinéticas de crescimento de metástases. Uma vez que o modelo é semelhante a metástases hepáticas clinicamente observados, pode servir como uma modalidade para a detecção de genes associados com a metástase do fígado e para testar potenciais tratamentos ablativos ou adjuvantes para a doença metastática fígado.

O objetivo deste trabalho foi estabelecer um modelo animal consistente e facilmente reproduzível com o potencial para a quantificação de série da carga tumoral metastático in vivo e para a estimativa da frequência de colonização e cinética de crescimento do desenvolvimento de metástases hepáticas. Figuras 2-6, com lendas, são fornecidos a partir de nossa publicação anterior sob uma licença Creative Commons CC-BY 10. <p class="jove_step" fo:keep-to...

A capacidade dos clones metastáticos de colonizar locais distantes depende de sua capacidade de proliferação e/ou de sua capacidade de sobreviver no microambiente hospedeiro sem proliferação significativa. Aqui, apresentamos um modelo animal que permite a visualização quantitativa de ambos os tipos de colonização hepática por clones metastáticos.

Modelo Animal avançado de Colorectal metástase no fígado: técnicas de imagem e Propriedades de metastáticos Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

O objetivo geral desta abordagem é modelar a colonização hepática por clones tumorais metastáticos gerados por cânceres colorretais e utilizar este modelo para aprimorar o diagnóstico e a terapia das metástases hepáticas. Observações clínicas indicam a heterogeneidade da doença metastática. Nosso modelo permite capturar essa heterogeneidade para detectar genes associados às doenças oligometastáticas e polimetastáticas.E utilizar esse conhecimento para aprimorar a detecção precoce e o tratamento de metástases. A principal vantagem da nossa técnica é que utilizamos linhagens celulares monoclonais duplamente marcadas derivadas de pacientes com câncer colorretal, podendo observar o desenvolvimento de metástases hepáticas tanto in vivo quanto ex vivo. As implicações dessa técnica estendem-se para o tratamento de doenças metastáticas.Isso nos dá a capacidade de testar qualquer fármaco potencial com estimativa quantitativa do número de lesões metastáticas e da cinética de crescimento de cada lesão. Após gerar células HCT116 marcadas com luciferase e tdTomato e preparar os meios, reagentes e instrumentos, de acordo com o protocolo descrito, plaque as células transfectadas nas seguintes densidades por poço, em triplicata, em placas de 96 poços. Após a incubação das células por cinco horas, quantifique as intensidades fluorescentes do tdTomato utilizando um sistema IVIS, iniciando o software de imagem no desktop.Clique no botão Inicializar para definir o tempo de aquisição de imagem, binning do meio, dois para F/Stop, 535 para o filtro de excitação e 580 para o filtro de emissão. Coloque a placa de 96 poços na estação de imagem e clique em Adquirir para iniciar a aquisição. Após a imagem ser obtida, na Paleta de Ferramentas, clique em Ferramentas de ROI e selecione 12x8 no ícone de fenda.Crie 12x8 cortes para cobrir a área do sinal na imagem da placa de 96 poços e clique na aba Medições. Observe uma janela com a tabela de medições de ROI com unidades de fótons por segundo, por esterorradiano, por centímetro quadrado. Quando as células atingirem 70 a 80 por cento de confluência, aproximadamente uma hora antes da injeção no baço, adicione tripsina a 0,05 por cento e EDTA 0,53 milimolar às células para dissociá-las.Após incubar as células por três a cinco minutos, use um volume igual de C-DMEM para neutralizar a tripsina. Pipete cuidadosamente as culturas para evitar agregação, e então utilize um contador automático de células para contá-las. Congele as células suspensas em DBPS 1x numa concentração de 1,2 a 2 x 10⁶ células por 100 microlitros, pipetando cuidadosamente para evitar agregação.Em seguida, mantenha as células no gelo até a injeção, ressuspendendo-as ocasionalmente no tubo. Após administrar analgésicos e anestesiar um camundongo nu atímico fêmea com seis a oito semanas de idade de acordo com o protocolo descrito, identifique o baço como uma área roxa visível externamente através da pele no flanco esquerdo e faça uma incisão de oito milímetros na pele do flanco esquerdo logo acima do órgão. Em seguida, levante a parede abdominal e faça uma pequena incisão.Permita a entrada de ar na cavidade abdominal para que os órgãos internos se afastem do local da incisão. Em seguida, amplie a incisão na parede abdominal para aproximadamente cinco milímetros. Os passos demonstrados para a injeção são essenciais para o procedimento.O vazamento de células tumorais durante a injeção pode levar a metástases extra-hepáticas. A injeção deve ser realizada lentamente, ao longo de 30 a 60 segundos, com não mais de 1,5 milhão de células para prevenir trombose da veia porta. Exponha o baço utilizando um cotonete para aplicar suavemente pressão ao redor da incisão.Se necessário, a gordura pancreática pode ser manipulada suavemente para auxiliar na exposição, sem lesionar o baço. Usando uma seringa de um mililitro com agulha de 27 graus, injete 100 microlitros de células na ponta do baço exposto ao longo de um período de 30 a 60 segundos. Ao final da injeção, coloque um microclipe no baço antes de retirar a agulha, para evitar vazamento da suspensão celular injetada, e mantenha-o no lugar por cinco minutos.Cinco minutos após a injeção, use um dispositivo de cauterização manual para realizar uma esplenectomia com fins de hemostasia. Comece pelo hilo esplênico no lado anterior, pré-coagulando o lado proximal dos vasos com o tecido adiposo adjacente. Pode ocorrer sangramento esplênico no local da injeção.O microclipe é aplicado no baço para prevenir a fuga de células tumorais e controlar o sangramento esplênico. Os métodos de hemostasia podem incluir cauterização, aplicação de pressão por três a cinco minutos e ligadura com sutura, se necessário. Feche a parede abdominal utilizando uma sutura trançada absorvível 5.0 e um único ponto horizontal.Em seguida, utilize um fio mono-filamento não absorvível 4.0 para fechar a pele, também com um único ponto horizontal. Monitore o animal no pós-operatório, de acordo com o protocolo descrito no texto. Para realizar a imagem de bioluminescência, após anestesiar os camundongos de acordo com o protocolo descrito no texto, injete intraperitonealmente nos animais 150 microlitros de luciferina de vaga-lume previamente preparada.Posicione os camundongos em um IVIS em posição supina, com espaçadores entre os animais para minimizar o sinal para camundongos adjacentes. Três minutos após a injeção de luciferina, após inicializar o IVIS, selecione luminescência, tempo de exposição de um segundo e binning médio. Clique no botão Adquirir para iniciar a aquisição de imagens, garantindo que a aquisição seja realizada consistentemente três minutos após a injeção de luciferina.Após a aquisição da imagem, quando uma janela de imagem e uma paleta de ferramentas forem exibidas, clique em ferramentas de ROI e selecione um número de um a cinco no ícone de círculo correspondente ao número de camundongos imageados. Para definir as ROIs, circule a área de sinal do sinal luminiscente na cavidade abdominal do camundongo e, em seguida, clique em medições da ROI como uma unidade arbitrária de irradiância. Inclua um círculo de ROI adicional para o fundo.Quatro semanas após a injeção, para realizar a tomografia de imagem luminiscente difusa, ou DLIT, após inicializar o IVIS, selecione Assistente de Imagem, Bioluminescência e clique em Avançar. Selecione DLIT e clique em Avançar. Selecione Firefly Probes e clique em Avançar.Selecione Rato como Assunto da Imagem, Automático para Parâmetro de Exposição C-13 Centímetro para Campo de Visão e 0,5 Centímetro como Tipo de Assunto e clique em Avançar. Em seguida, clique no botão Adquirir para iniciar a aquisição de imagem. Após adquirir uma imagem, selecione a aba Reconstrução 3D DLIT, na aba Analisar, e clique em Reconstruir para gerar a imagem de reconstrução 3D.Clique em Ferramentas e Animação 3D. Em seguida, na janela Animação 3D, selecione Girar CCW no Eixo Y. Clique em Gravar e Salvar para salvar o arquivo em um arquivo no formato mov.Para realizar a imagem fluorescente ex vivo, após colher e dissecar os fígados de camundongos de acordo com o protocolo descrito, meça as intensidades fluorescentes de cada colônia tumoral utilizando o IVIS. Selecione Fluorescência, Tempo de Exposição de quatro segundos, Binning Médio, 2 para F/Stop, 535 para o filtro de excitação e 580 para o filtro de emissão. Clique no botão Adquirir para iniciar a aquisição de imagens.Após adquirir a imagem, localize a janela Imagem na Paleta de Ferramentas. Clique em Ferramentas de ROI e selecione 1 no ícone de círculo. Para definir as ROI, circule a área de sinal de colônias tumorais individuais na imagem.Adquira um círculo adicional de ROI do fundo e, em seguida, clique em Medições do ROI como uma unidade arbitrária de radiância. Adquira um círculo adicional de ROI do fundo. Finalmente, realize os cálculos de acordo com o protocolo descrito no texto.Como mostrado aqui pela bioluminescência, três semanas após a injeção no baço, os clones P1 e P2 de HCT116 L2T apresentaram maior carga tumoral, em comparação com os clones O1 e O2. Esses dados indicaram que os clones O1 e O2 podem simular uma doença oligometastática, enquanto P1 e P2 representam uma colonização metastática agressiva e disseminada no fígado. A quantificação da fluorescência ex vivo do fígado, quatro semanas após a injeção no baço, confirmou que os fígados dos clones P1 e P2 tinham intensidades fluorescentes mais altas em comparação com os dos clones O1 e O2. A marcação fluorescente dos clones tumorais identificou o número e os tamanhos das colônias metastáticas individuais no fígado.No geral, as imagens fluorescentes ex vivo foram consistentes com os achados macroscópicos, mas colônias pequenas ocultas sob a superfície foram melhor detectadas pela imagem fluorescente. Como ilustrado aqui, os números e tamanhos das colônias metastáticas foram contados e medidos em cada fígado, e a imagem fluorescente ex vivo foi realizada em cada colônia metastática para cada monoclone. Como mostrado nestes gráficos, o número total de metástases em P1 foi maior em comparação com P2, O1 e O2, enquanto o tamanho médio das colônias individuais foi maior em P2 do que em P1, O1 e O2. Nosso modelo fornece uma abordagem para identificar novos genes de persuasão associados à heterogeneidade molecular da metástase.Esses genes podem ser utilizados como alvos para novas abordagens no tratamento da metástase. Nosso modelo também pode ser usado para a validação de diferentes genes codificadores e não codificadores de proteínas que surgem a partir de grandes bancos de dados clínicos atuais, mas que ainda não foram funcionalmente definidos no contexto de doenças metastáticas. Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, devido à delicadeza da cirurgia em animais.No entanto, com prática, é possível obter bons resultados em um curto espaço de tempo. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de seguir as diretrizes para cirurgia em animais, controlar cuidadosamente o sangramento e prevenir o vazamento da suspensão de células tumorais.

advanced-animal-model-colorectal-metastasis-liver-imaging-techniques

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Duas técnicas podem ser usadas para estabelecer esse modelo: injeção de uma suspensão de células de câncer na parede cecal ou transplante de um pedaço de tumor subcutâneo para o ceco. Este modelo é útil para estudar a progressão natural do câncer colo-retal e testes de novos agentes terapêuticos contra o câncer colorretal.

Modelo rato ortotópico de câncer colorretal

Este artigo descreve um procedimento para a indução de tumores de fígado ortotópico bioluminescentes em camundongos, e posterior análise do crescimento do tumor confinado ao fígado usando imagens de luminescência ao vivo de todo o corpo.

Modelo de tumor hepático murino Bioluminescent

Os modelos animais são freqüentemente utilizada para estudar metástase de câncer de osso. Neste protocolo, iremos descrever dois métodos comuns de inoculação do tumor para estudos de metástase óssea e descrever brevemente algumas das análises utilizadas para monitorar e quantificar esses modelos.

Modelos de metástase óssea

Este vídeo descreve o protocolo para estabelecer um modelo de camundongo com metástase espontânea de xenoenxertos derivados de pacientes com câncer colorretal ou PDXs. Esses modelos de xenoenxerto imitam parcialmente as características dos carcinomas humanos e entendem os aspectos críticos das malignidades humanas, incluindo invasão e metástase.

Modelos de camundongos com metástase espontânea: uma plataforma para estudar o potencial metastático de células de câncer colorretal injetadas ortotopicamente

A modelo pré-clínico, murino de metástases hepáticas realizado através de uma técnica de injeção hemispleen.

Um Modelo murino de metástases hepáticas pré-clínica

Um procedimento cirúrgico foi desenvolvido para entregar células tumorais mamárias ao fígado murino por meio de injeção na veia porta. Este modelo permite a investigação de estágios tardios de metástase hepática em um hospedeiro totalmente imunocompetente, incluindo extravasamento de células tumorais, semeadura, sobrevivência e crescimento metastático no fígado.

Um modelo de injeção da veia porta para o Estudo do Fígado metástase do câncer de mama

Descrevemos o estabelecimento de tumores colorretais ortotópicos através da injeção de células tumorais ou organoides no ceco de camundongos e o subsequente isolamento de células tumorais circulantes (CTCs) deste modelo.

Isolamento de células tumorais circulantes em um modelo de rato ortotópico de câncer colorretal

Este protocolo descreve a geração de modelos transplantação orthotopic do paciente-derivados do xenograft por intra-vesically incutir pilhas urotelial de primeira qualidade da carcinoma da pilha ou de injetar intra-rectal pilhas de cancro colorretal em não-obeso diabético/severo combinado ratos da imunodeficiência (NOD/SCID) para o crescimento preliminar do tumor e metástases espontâneas a influência de pilhas stromal do nó de linfa, que imita a progressão de doenças metastáticas humanas.

Modelos de xenoenxertos Ortotópicos derivados do paciente para Carcinoma de células urotelial humana e crescimento do tumor do câncer colorretal e metástase espontânea

Nós descrevemos em detalhe um modelo clinicamente relevante do tumor das metástases do fígado do cancro colorretal (crlm) e a influência do reperfusão da isquemia do fígado (I/R) no crescimento e na metástase do tumor. Este modelo pode ajudar a compreender melhor os mecanismos subjacentes à promoção cirurgia-induzida do crescimento metastático do fígado.

Modelo murino de tumores hepáticos metastáticos no cenário de lesão de reperfusão de isquemia

A abordagem descrita combina ensaios experimentais de metástase da veia da cauda com imagens de animais vivos in vivo in vivo para permitir o monitoramento em tempo real da formação e crescimento da metástase do câncer de mama, além da quantificação do número e tamanho da metástase nos pulmões.

Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

A injeção de veia portal de organoides de câncer colorretal (CRC) gera metástase hepática rica em estroma. Este modelo de camundongos de metástase hepática crc representa uma ferramenta útil para estudar interações tumorais-estroma e desenvolver novas terapêuticas dirigidas a estroma, como terapias genéticas mediadas por vírus associados ao adeno.

Portal Injeção de Veia de Organoides de Câncer Colorretal para Estudar o Estroma metástase hepática

Aprenda a modelar a colonização hepática por clones de tumores metastáticos de câncer colorretal usando linhagens celulares duplamente marcadas. Este método permite visualizar a heterogeneidade metastática e identificar genes associados a padrões oligometastáticos e polimetastáticos.

Modelo Animal avançado de Colorectal metástase no fígado: técnicas de imagem e Propriedades de metastáticos Clones

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