Modelo Animal avançado de Colorectal metástase no fígado: técnicas de imagem e Propriedades de metastáticos Clones

O objetivo geral desta abordagem é modelar a colonização hepática por clones tumorais metastáticos gerados por cânceres colorretais e utilizar este modelo para aprimorar o diagnóstico e a terapia das metástases hepáticas. Observações clínicas indicam a heterogeneidade da doença metastática. Nosso modelo permite capturar essa heterogeneidade para detectar genes associados às doenças oligometastáticas e polimetastáticas.

E utilizar esse conhecimento para aprimorar a detecção precoce e o tratamento de metástases. A principal vantagem da nossa técnica é que utilizamos linhagens celulares monoclonais duplamente marcadas derivadas de pacientes com câncer colorretal, podendo observar o desenvolvimento de metástases hepáticas tanto in vivo quanto ex vivo. As implicações dessa técnica estendem-se para o tratamento de doenças metastáticas.

Isso nos dá a capacidade de testar qualquer fármaco potencial com estimativa quantitativa do número de lesões metastáticas e da cinética de crescimento de cada lesão. Após gerar células HCT116 marcadas com luciferase e tdTomato e preparar os meios, reagentes e instrumentos, de acordo com o protocolo descrito, plaque as células transfectadas nas seguintes densidades por poço, em triplicata, em placas de 96 poços. Após a incubação das células por cinco horas, quantifique as intensidades fluorescentes do tdTomato utilizando um sistema IVIS, iniciando o software de imagem no desktop.

Clique no botão Inicializar para definir o tempo de aquisição de imagem, binning do meio, dois para F/Stop, 535 para o filtro de excitação e 580 para o filtro de emissão. Coloque a placa de 96 poços na estação de imagem e clique em Adquirir para iniciar a aquisição. Após a imagem ser obtida, na Paleta de Ferramentas, clique em Ferramentas de ROI e selecione 12x8 no ícone de fenda.

Crie 12x8 cortes para cobrir a área do sinal na imagem da placa de 96 poços e clique na aba Medições. Observe uma janela com a tabela de medições de ROI com unidades de fótons por segundo, por esterorradiano, por centímetro quadrado. Quando as células atingirem 70 a 80 por cento de confluência, aproximadamente uma hora antes da injeção no baço, adicione tripsina a 0,05 por cento e EDTA 0,53 milimolar às células para dissociá-las.

Após incubar as células por três a cinco minutos, use um volume igual de C-DMEM para neutralizar a tripsina. Pipete cuidadosamente as culturas para evitar agregação, e então utilize um contador automático de células para contá-las. Congele as células suspensas em DBPS 1x numa concentração de 1,2 a 2 x 10⁶ células por 100 microlitros, pipetando cuidadosamente para evitar agregação.

Em seguida, mantenha as células no gelo até a injeção, ressuspendendo-as ocasionalmente no tubo. Após administrar analgésicos e anestesiar um camundongo nu atímico fêmea com seis a oito semanas de idade de acordo com o protocolo descrito, identifique o baço como uma área roxa visível externamente através da pele no flanco esquerdo e faça uma incisão de oito milímetros na pele do flanco esquerdo logo acima do órgão. Em seguida, levante a parede abdominal e faça uma pequena incisão.

Permita a entrada de ar na cavidade abdominal para que os órgãos internos se afastem do local da incisão. Em seguida, amplie a incisão na parede abdominal para aproximadamente cinco milímetros. Os passos demonstrados para a injeção são essenciais para o procedimento.

O vazamento de células tumorais durante a injeção pode levar a metástases extra-hepáticas. A injeção deve ser realizada lentamente, ao longo de 30 a 60 segundos, com não mais de 1,5 milhão de células para prevenir trombose da veia porta. Exponha o baço utilizando um cotonete para aplicar suavemente pressão ao redor da incisão.

Se necessário, a gordura pancreática pode ser manipulada suavemente para auxiliar na exposição, sem lesionar o baço. Usando uma seringa de um mililitro com agulha de 27 graus, injete 100 microlitros de células na ponta do baço exposto ao longo de um período de 30 a 60 segundos. Ao final da injeção, coloque um microclipe no baço antes de retirar a agulha, para evitar vazamento da suspensão celular injetada, e mantenha-o no lugar por cinco minutos.

Cinco minutos após a injeção, use um dispositivo de cauterização manual para realizar uma esplenectomia com fins de hemostasia. Comece pelo hilo esplênico no lado anterior, pré-coagulando o lado proximal dos vasos com o tecido adiposo adjacente. Pode ocorrer sangramento esplênico no local da injeção.

O microclipe é aplicado no baço para prevenir a fuga de células tumorais e controlar o sangramento esplênico. Os métodos de hemostasia podem incluir cauterização, aplicação de pressão por três a cinco minutos e ligadura com sutura, se necessário. Feche a parede abdominal utilizando uma sutura trançada absorvível 5.0 e um único ponto horizontal.

Em seguida, utilize um fio mono-filamento não absorvível 4.0 para fechar a pele, também com um único ponto horizontal. Monitore o animal no pós-operatório, de acordo com o protocolo descrito no texto. Para realizar a imagem de bioluminescência, após anestesiar os camundongos de acordo com o protocolo descrito no texto, injete intraperitonealmente nos animais 150 microlitros de luciferina de vaga-lume previamente preparada.

Posicione os camundongos em um IVIS em posição supina, com espaçadores entre os animais para minimizar o sinal para camundongos adjacentes. Três minutos após a injeção de luciferina, após inicializar o IVIS, selecione luminescência, tempo de exposição de um segundo e binning médio. Clique no botão Adquirir para iniciar a aquisição de imagens, garantindo que a aquisição seja realizada consistentemente três minutos após a injeção de luciferina.

Após a aquisição da imagem, quando uma janela de imagem e uma paleta de ferramentas forem exibidas, clique em ferramentas de ROI e selecione um número de um a cinco no ícone de círculo correspondente ao número de camundongos imageados. Para definir as ROIs, circule a área de sinal do sinal luminiscente na cavidade abdominal do camundongo e, em seguida, clique em medições da ROI como uma unidade arbitrária de irradiância. Inclua um círculo de ROI adicional para o fundo.

Quatro semanas após a injeção, para realizar a tomografia de imagem luminiscente difusa, ou DLIT, após inicializar o IVIS, selecione Assistente de Imagem, Bioluminescência e clique em Avançar. Selecione DLIT e clique em Avançar. Selecione Firefly Probes e clique em Avançar.

Selecione Rato como Assunto da Imagem, Automático para Parâmetro de Exposição C-13 Centímetro para Campo de Visão e 0,5 Centímetro como Tipo de Assunto e clique em Avançar. Em seguida, clique no botão Adquirir para iniciar a aquisição de imagem. Após adquirir uma imagem, selecione a aba Reconstrução 3D DLIT, na aba Analisar, e clique em Reconstruir para gerar a imagem de reconstrução 3D.

Clique em Ferramentas e Animação 3D. Em seguida, na janela Animação 3D, selecione Girar CCW no Eixo Y. Clique em Gravar e Salvar para salvar o arquivo em um arquivo no formato mov.

Para realizar a imagem fluorescente ex vivo, após colher e dissecar os fígados de camundongos de acordo com o protocolo descrito, meça as intensidades fluorescentes de cada colônia tumoral utilizando o IVIS. Selecione Fluorescência, Tempo de Exposição de quatro segundos, Binning Médio, 2 para F/Stop, 535 para o filtro de excitação e 580 para o filtro de emissão. Clique no botão Adquirir para iniciar a aquisição de imagens.

Após adquirir a imagem, localize a janela Imagem na Paleta de Ferramentas. Clique em Ferramentas de ROI e selecione 1 no ícone de círculo. Para definir as ROI, circule a área de sinal de colônias tumorais individuais na imagem.

Adquira um círculo adicional de ROI do fundo e, em seguida, clique em Medições do ROI como uma unidade arbitrária de radiância. Adquira um círculo adicional de ROI do fundo. Finalmente, realize os cálculos de acordo com o protocolo descrito no texto.

Como mostrado aqui pela bioluminescência, três semanas após a injeção no baço, os clones P1 e P2 de HCT116 L2T apresentaram maior carga tumoral, em comparação com os clones O1 e O2. Esses dados indicaram que os clones O1 e O2 podem simular uma doença oligometastática, enquanto P1 e P2 representam uma colonização metastática agressiva e disseminada no fígado. A quantificação da fluorescência ex vivo do fígado, quatro semanas após a injeção no baço, confirmou que os fígados dos clones P1 e P2 tinham intensidades fluorescentes mais altas em comparação com os dos clones O1 e O2. A marcação fluorescente dos clones tumorais identificou o número e os tamanhos das colônias metastáticas individuais no fígado.

No geral, as imagens fluorescentes ex vivo foram consistentes com os achados macroscópicos, mas colônias pequenas ocultas sob a superfície foram melhor detectadas pela imagem fluorescente. Como ilustrado aqui, os números e tamanhos das colônias metastáticas foram contados e medidos em cada fígado, e a imagem fluorescente ex vivo foi realizada em cada colônia metastática para cada monoclone. Como mostrado nestes gráficos, o número total de metástases em P1 foi maior em comparação com P2, O1 e O2, enquanto o tamanho médio das colônias individuais foi maior em P2 do que em P1, O1 e O2. Nosso modelo fornece uma abordagem para identificar novos genes de persuasão associados à heterogeneidade molecular da metástase.

Esses genes podem ser utilizados como alvos para novas abordagens no tratamento da metástase. Nosso modelo também pode ser usado para a validação de diferentes genes codificadores e não codificadores de proteínas que surgem a partir de grandes bancos de dados clínicos atuais, mas que ainda não foram funcionalmente definidos no contexto de doenças metastáticas. Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, devido à delicadeza da cirurgia em animais.

No entanto, com prática, é possível obter bons resultados em um curto espaço de tempo. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de seguir as diretrizes para cirurgia em animais, controlar cuidadosamente o sangramento e prevenir o vazamento da suspensão de células tumorais.