Name: Microglia como um Biosensor Surrogate determinar nanopartículas neurotoxicidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a usar microglia como biosensor surrogate para avaliar neurotoxicidade de nanopartículas em modelo in vitro. Este método permite ativar microglia e determinar fatores secretores neurotóxicos sem estudos prolongados em roedores.

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Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Assuntos de Veteranos dos EUA BLR & D IK2 BX001686 (para TAB) e doações da Universidade de Minnesota Healthy Foods, Healthy Lives Institute (para CMD, JPN e TAB) e da Minnesota Veterans Medical Research & Education Foundation (para TAB). Agradecemos aos Drs. Philippe Marambaud (Instituto Feinstein de Pesquisa Médica, Manhasset, NY) e Weihua Zhao (Hospital Metodista, Houston, TX) por fornecer a linhagem celular BV2.

1. Manutenção Cultura de Células microglia <ol><li> meio de cultura de célula quente (Dulbecco Modified Eagle Médium; DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina / neomicina (PSN) a 37 ° C. </li><li> Obter massa congelada de células microgliais bv2 na passagem 18 - 25 a partir do armazenamento a -80 ° C. Rapidamente descongelar células em 37 ° C banho de água. </li><li> Suavemente transferir as células para um frasco de 75 centímetros ventilado 2 contendo meio de cultura de células de 10 ml. </li><li> Incubar balão em 5% de CO2 a 37 ° C. media aspirado após 24 horas e substituir por meios frescos. Crescer as células até cerca de 70 - 80% de confluência. </li></ol> 2. Contagem e Células chapeamento <ol><li> Em um banho de água a 37 ° C, e uma solução de DMEM morno-1x tripsina-EDTA. </li><li> Aspirar meios de células e adicionar 500 ul de tripsina. Incubar a 37 ° C durante 2-5 min. </li><li> Utilizando um raspador, remover as células do frasco e suspender em 5 mlde DMEM. Passar as células através de um filtro de 70 um para um tubo de 50 ml, três vezes. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro e semear 8000 células / cavidade em uma placa de fundo preto walled clear em um volume final de 200 ul de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de PSN. Incubar a placa em 5% de CO2 a 37 ° C durante 24 h. </li><li> Remover antigo DMEM e substituir com 200 mL de DMEM aquecido suplementado com 1% PSN ao soro fome microglia. Incubar a placa em 5% de CO2 a 37 ° C durante 24 h. </li></ol> 3. Ativação Microglia <ol><li> Em tubos separados, diluir AGNPS (0,01, 0,05 ou 0,1 ug / ml) e veículo / controlo neutro (citrato de sódio, 0,04 mM) em DMEM isento de soro suplementado com 1% de PSN para concentrações finais de trabalho. </li><li> Retirar 100 ul de meio de cada poço e substituir com 100 ul de composto de tratamento apropriado. </li><li> Incubar a placa em 5% de CO2 a 37 ° C durante 24 h. </li></ol> 4. Filtragem meios condicionados <ol><li> Recolhe 200 ul de sobrenadante de meio de cada poço e transferir para um filtro (corte de peso molecular de 10 kDa) com o tubo de recolha (1,5 a 2 ml de capacidade). </li><li> Centrifugar a 14000 xg à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Descartar o fluxo de passagem (sobrenadante com partículas) e colocar o filtro de cabeça para baixo para um novo tubo de recolha. </li><li> Centrifugar a 1000 xg à temperatura ambiente durante 2 min. NOTA: A mídia filtrado resultante (contendo citocinas secretadas) é concentrada por seis vezes. </li><li> Levar o volume do concentrado para 400 ul com DMEM fresco suplementado com FBS a 10% e PSN a 1% e armazenar em gelo. NOTA: Para garantir AGNPS residuais são removidos da mídia filtrados, gerar uma concentração AgNP com base no pico característico em cerca de 390-420 nm 10. Resumidamente, preparar alíquotas de AGNPS não filtradas (0, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, e 0,2 ug / ml tal como descrito no passo 3.1) e filtradacontrolo de veículo (citrato de sódio, 0,04 mM) em DMEM isento de soro. Alíquota de 50 ul de amostras e padrões filtrada para um preto murado placa de fundo claro. Usando um espectrofotômetro, medir a absorvância a 390-410 nm e comparar as leituras para a curva de concentração AgNP. Se as amostras filtradas têm o mesmo valor de absorvância como a amostra de controlo com veículo, pode-se supor AGNPS residuais são removidos. </li><li> Utilizar metade das meios filtrados para determinar seguintes instruções de secreção de TNF-α a partir de um kit disponível comercialmente. </li></ol> 5. hipotálamo Manutenção Cultura de Células <ol><li> meio de cultura celular DMEM morno, suplementado com 10% FBS e 1% de PSN para 37 ° C. </li><li> Obter massa congelada de células no hipotálamo passagem 18 (mHypo-A1 / 2) - 25 armazenados a 80 ° C. Rapidamente descongelar células em 37 ° C banho de água. </li><li> Suavemente transferir as células para um frasco de 75 centímetros ventilado 2 contendo meio de cultura de células de 10 ml. </li><li> Incubar balão em 5% de CO 2 </sUB&gt; a 37 ° C. media aspirado após 24 horas e substituir por meios frescos. Crescer as células até aproximadamente a 70 - 80% de confluência. </li></ol> 6. Determinar a toxicidade celular hipotálamo <ol><li> DMEM morno e solução 1x tripsina-EDTA em um banho de água a 37 ° C. </li><li> Aspirar meios de células hipotalâmicas e adicionar 500 ul de tripsina. Incubar a 37 ° C durante 2-5 min. Remover as células de balão usando um raspador tal como descrito acima no passo 2. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro e placa células hipotalâmicas a 5000 células / poço num preto walled placa de fundo claro, num volume final de 200 ul de DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de PSN e incubar durante a noite em 5% de CO2 a 37 ° C . </li><li> Retirar 100 ul de meios de idade, utilizando um pipetador multicanal e adicionar 100 ul de meios condicionados concentrados filtrada, para uma concentração final de 1x. </li><li> Incubar a placa em 5% de CO2 a 37 ° C durante 24 h. </li><li> Adicionar 221; L de reagente de resazurina e Incubar a placa durante 20 minutos em 5% de CO2 a 37 ° C. </li><li> Usando um espectrofotômetro multimodo, fluorescência registro (560 nm EX / 590 nm EM) para medir a viabilidade celular. Relatar os resultados como unidades de fluorescência relativas (RFU). </li></ol>

<ol><li>Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution%3A+mechanisms+of+neuroinflammation+and+CNS+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease.</a> Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos a divulgar.

Estudos recentes sustentam que a exposição ambiental contribui para a obesidade e outras doenças neurodegenerativas 11,12. No entanto, as técnicas usadas em estudos anteriores são demoradas e caras. Considerações econômicas, sistemas de entrega fisiologicamente relevantes, questões éticas com o uso extensivo de modelos animais in vivo e dificuldade em traduzir descobertas em recomendações de saúde significativas são alguns dos principais desafios que impediram os avanços no estudo da neurotoxicidade i...

Poluições ambientais, especialmente aqueles da gama de nanopartículas (NP) (1 - 20 nm de diâmetro), têm sido associadas com a obesidade e outras doenças neurodegenerativas, devido à capacidade de atravessar a barreira hemato-encefálica 1-3. Exposição elevada a poluição pode induzir a inflamação do sistema nervoso central, incluindo o hipotálamo 1. Um potencial mecanismo no qual isto ocorre pode ser através da activação induzida por nanopartículas de microglia (células imunes do cérebro) 4. Estudos anteriores têm utilizado em modelos in vivo para estudar os efeitos de NPs sobre a saúde do cérebro, que são consumidoras de tempo, é caro, e não responde directamente à questão de como o NPS influenciar microglia. Microglia desempenhar um papel multifacetado no sistema nervoso central, incluindo a manutenção do microambiente do cérebro e comunicando com circundante neurónios através da libertação de factores secretados e citocinas. Dependendo dos estímulos, microglia pode ser activado a uma pr M1o-inflamatória ou um estado anti-inflamatório M2. Por exemplo, a microglia activada M1 libertar citocinas pró-inflamatórias, tais como o factor de necrose tumoral alfa (TNF-α), enquanto M2 activado libertação microglia citocinas anti-inflamatórias, incluindo a interleucina-4 (IL-4). Para validar o nosso substituto no biossensor vitro para determinar a neurotoxicidade dos poluentes do ar, medimos microglial 20 nanopartículas de prata nm (AGNPS). O objetivo deste artigo é descrever como um in vitro linha de células microgliais pode ser usado como um marcador biossensor substituto para testar a resposta microglial murino para o NPS e como microglial ativação afeta as células do hipotálamo. A longo prazo aplicação pretendida para este modelo validado é testar efeitos dos poluentes do mundo real para a saúde do cérebro e doenças neurodegenerativas. Fornecemos uma descrição detalhada de um ensaio in vitro em formato de 96 poços para a medição da activação da microglia e sobrevivência das células do hipotálamo após a exposição de MIC<html> roglial meios condicionados. activação da microglia foi determinada após a exposição AgNP usando uma enzima de TNF-α linked immunosorbent assay (ELISA). Para determinar o efeito da microglia activada em células do hipotálamo, os AGNPS foram removidas a partir do sobrenadante da microglia (meio condicionado), utilizando um dispositivo de filtração. O dispositivo de filtração mantém citocinas, excluindo os AGNPS com base no tamanho. Resumidamente, o sobrenadante da microglia tratados com ou sem AGNPS foi recolhido, adicionado aos filtros, e centrifugado a 14000 xg durante 15 min. Foram então capaz de determinar a influência de citocinas secretadas microgliais sobre a viabilidade das células do hipotálamo. Toxicidade celular após a exposição ao meio condicionado (contendo citocinas) foi determinada através de um ensaio baseado em resazurina 5,6 como anteriormente descrito. Metabolicamente activas células reduzir resazurina e produzir um sinal fluorescente proporcional ao número de células viáveis 7. nt &quot;&gt; Existem várias vantagens de usar esta técnica em detrimento de outros (como co-cultura, configurações trans-bem, ou in vivo). O nosso modelo fornece a capacidade de ativar diretamente microglia e determinar se fatores secretados são tóxicos para os neurônios 8 . O protocolo atual usa imortalizado microglia BV2 estimulados com nanopartículas de 20 nm de diâmetro, e imortalizado células do hipotálamo murino (designado mHypo-A1 / 2) 9 para a determinação da resposta subseqüente. Embora este protocolo foi optimizado para essas condições específicas, os métodos podem ser alterada para ser usado em outros modelos de morte celular induzida por microglia, ou com outros tipos de células, incluindo neurónios e microglia primária.

<table><tbody><tr><td><forte>Células/Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linha celular microglial de camundongo (BV2)</td><td>Coleção de linha celular interlab (Gênova, Itália</td><td>)ATL03001</td><td></td></tr><tr><td>Linha celular de hipotálamo de camundongo adulto mHypoA-1/2&nbsp;</td><td>Cellutions Biosystems Inc.</td><td>CLU172</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia Modificada' s Medium</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino&nbsp;</td><td>PAA Labs</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina/Neomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15640-055</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Nanopartículas de prata (20 nm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>730793</td><td></td></tr><tr><td> PrestoBlue Reagente de viabilidade celular</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td></td></tr><tr><td>Mouse TNF- &alfa; ELISA Max Delux</td><td>Biolegend</td><td>430904</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 W Placa Inferior Óptica, Poliestireno Preto, Tratamento para Cultura de Células, com tampa, Estéril</td> Unidade de Filtro Centrífugo <td>Fisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 com membrana Ultracel-10</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC501008</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5 Microplaca Multimodo</td><td>Molecular Devices</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Centrífuga Cônica de 50 ml Tubos</td><td>Corning, Inc</td><td> 14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de Célula Falcon 70 &mu; m</td><td>Corning, Inc</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa 5430</td><td>Eppendorf</td><td>22620560</td><td></td></tr></tbody></table>

microglia como um biosensor surrogate determinar nanopartículas neurotoxicidade

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Nanopartículas encontradas em poluentes atmosféricos podem alterar perfis de neurotransmissores, aumentar a neuroinflamação e alterar a função cerebral. Portanto, o ensaio descrito aqui ajudará a elucidar o papel da microglia na neuroinflamação e doenças neurodegenerativas. O uso da microglia, células imunes residentes do cérebro, como um biossensor substituto fornece uma nova visão sobre como as respostas inflamatórias medeiam insultos neuronais. Aqui, utilizamos uma linha celular microglial murina imortalizada, designada BV2, e descrevemos um método para exposição a nanopartículas usando nanopartículas de prata (AgNPs) como padrão. Descrevemos como expor a microglia a nanopartículas, como remover nanopartículas do sobrenadante e como usar o sobrenadante da microglia ativada para determinar a toxicidade, usando a sobrevivência das células hipotalâmicas como medida. Após a exposição ao AgNP, a ativação microglial do BV2 foi validada usando um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α). O sobrenadante foi filtrado para remover o AgNP e permitir que citocinas e outros fatores secretados permanecessem no meio condicionado. As células hipotalâmicas foram então expostas ao sobrenadante da microglia ativada por AgNP e a sobrevivência dos neurônios foi determinada usando um ensaio fluorescente baseado em resazurina. Esta técnica é útil para utilizar a microglia como um biomarcador substituto da neuroinflamação e determinar o efeito da neuroinflamação em outros tipos de células.

Mostra-se que a função da microglia como um substituto para o biossensor resposta do cérebro com as nanopartículas utilizando o protocolo anterior. Os resultados incluem a medição dos efeitos tóxicos da activação microglial na morte celular neuronal jusante. A Figura 1 mostra um fluxo de trabalho do protocolo para ativar a microglia e determinar se as citocinas secretadas reduzir a viabilidade dos neurônios do hipotálamo. Secreção de TNF-α foi significativamente aumentad...

Microglia (células imunes do cérebro), são usadas como um biossensor substituto para determinar como as nanopartículas influenciam a neurotoxicidade. Descrevemos uma série de experimentos projetados para testar a resposta microglial a nanopartículas e a exposição de neurônios hipotalâmicos ao sobrenadante da micróglia ativada para determinar a neurotoxicidade.

Microglia como um Biosensor Surrogate determinar nanopartículas neurotoxicidade

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

O objetivo geral deste protocolo é descrever um biossensor simulado in vitro para testar a resposta das micróglias a nanopartículas. Em seguida, determinaremos a neurotoxicidade após exposição ao meio condicionado de micróglias estimuladas com nanopartículas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da neurociência, como a forma pela qual nanopartículas são ativamente testadas quanto à neurotoxicidade.A principal vantagem desta técnica é que nosso modelo oferece a capacidade de ativar diretamente a microglia e determinar se fatores secretados são neurotoxinas, sem a necessidade de estudos de longo prazo em roedores, que são onerosos. Embora este método possa fornecer informações sobre a morte celular induzida por microglia após exposição a micropartículas, ele também pode ser aplicado a outros modelos de doenças neurodegenerativas no contexto de testar possíveis poluentes ambientais neurotóxicos.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldade com a etapa de filtração do meio condicionado. Porque a eficiência da filtração pode variar dependendo do tamanho, forma e concentração das nanopartículas. Para o preparo, aqueça o DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de PSN a 37 graus Celsius.Em seguida, pegue células microgliais BV2 congeladas obtidas entre as passagens 18 e 25 e descongele-as rapidamente a 37 graus Celsius. Em seguida, transfira suavemente as células descongeladas para um frasco ventilado de 75 centímetros quadrados contendo 10 mililitros de meio e incube o frasco. Após 24 horas, substitua o meio e continue cultivando as células até que atinjam uma confluência de 70-80%. Neste ponto, aspire o meio e adicione 500 microlitros de solução quente de tripsina-EDTA 1x.Após deixar o frasco em incubação por mais alguns minutos, utilize um espátula para coletar as células em 5 mililitros de DMEM aquecido. Em seguida, filtre as células do frasco usando um filtro de 70 micrômetros. Repita essa filtração três vezes utilizando o mesmo filtro e colete as células em um tubo de 50 mililitros.Uma vez filtradas, conte as células e, em seguida, semeie uma placa com fundo claro e paredes pretas com 8000 células por poço em 200 microlitros de DMEM suplementado. Após 24 horas de incubação, substitua o meio nos poços por DMEM sem soro para privar as micróglias. Após mais 24 horas de incubação, prossiga com a ativação das micróglias.Para fazer isso, dilua primeiro as nanopartículas de prata em DMEM sem soro até a concentração de trabalho desejada. Em seguida, substitua 100 microlitros do meio pela solução do composto tratamento. Certifique-se de incluir um controle negativo com a solução veicular diluída, sem as nanopartículas.Agora, continue a incubação por 24 horas e prossiga com a análise. Para começar, colete 200 microlitros do meio sobrenadante de cada poço da placa e carregue-o em um filtro que removerá as nanopartículas colocadas sobre um tubo de microcentrífuga. É importante lembrar que, ao filtrar as nanopartículas, seu tamanho, forma e concentração são fatores para a eficiência de fusão.Portanto, é aconselhável testar a filtração previamente. Agora, centrifugue os tubos a 14000g em temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, descarte o fluxo passante, que contém as nanopartículas, e coloque os filtros de cabeça para baixo em novos tubos de coleta.Centrifugue os filtros invertidos a 1000g durante dois minutos para coletar o meio condicionado concentrado contendo citocinas. Em seguida, aumente o volume da coleta para 400 microlitros com DMEM suplementar recém-preparado e armazene os tubos no gelo. Para garantir a remoção de nanopartículas residuais de enxofre do meio filtrado, prepare padrões de nanopartículas não filtradas em uma faixa de concentração de branco até 0,2 microgramas por mililitro em DMEM sem soro.Em seguida, alíquotas de 50 mililitros das amostras filtradas e de cada padrão em uma placa com paredes pretas e fundo transparente e meça a absorbância de 390 a 410 nanômetros. Para medir a concentração de TNF-alfa nas amostras, utilize metade do volume restante em um kit comercialmente disponível. Para este ensaio, estabeleça células hipotalâmicas a partir de estoques congelados.Utilizando os mesmos métodos descritos para o estabelecimento de culturas de micróglias. Por fim, utilize-as para semear placas com fundo transparente e paredes pretas com 5000 células por poço em 200 microlitros de DMEM suplementado. Após 24 horas de cultivo, remova 100 microlitros do meio e substitua por 100 microlitros de meio filtrado e concentrado coletado das culturas de células micróglias ativadas, em seguida incube a placa por 24 horas em condições padrão.No dia seguinte, adicione 22 microlitros do reagente resazurina a cada poço e continue a incubação por 20 minutos. Em seguida, com um espectrofotômetro multifuncional, realize uma medida de fluorescência para estimar a viabilidade celular em termos de unidades de fluorescência relativa. Com o protocolo descrito, a função da micróglia pode ser utilizada como um biossensor substituto para a resposta do cérebro a nanopartículas.A secreção de TNF-alfa pela micróglia aumentou significativamente após a exposição a nanopartículas de prata. Quando neurônios hipotalâmicos foram expostos ao meio condicionado proveniente da micróglia ativada por nanopartículas de prata, a viabilidade desses neurônios foi significativamente reduzida. Em princípio, a exposição às nanopartículas de prata ativou a micróglia para um estado pró-inflamatório M1.Então, as citocinas pró-inflamatórias liberadas contribuem para a morte celular ao redor. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar micróglia como biossensor substituto para testar a resposta a nanopartículas e se essa resposta é neurotóxica. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três ou quatro dias, se for executada corretamente.Após este procedimento, outros métodos, como o perfilhamento de outras citocinas secretadas após a ativação de micróglias, podem ser realizados para caracterizar os estados de ativação das micróglias.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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