Microglia como um Biosensor Surrogate determinar nanopartículas neurotoxicidade

O objetivo geral deste protocolo é descrever um biossensor substituto in vitro para testar a resposta microglial a nanopartículas. Em seguida, determinaremos a neurotoxicidade após a exposição a meios condicionados de microglia estimulada com nanopartículas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como a forma como as nanopartículas são rastreadas ativamente para neurotoxicidade.

A principal vantagem dessa técnica é que nosso modelo fornece a capacidade de ativar diretamente a microglia e determinar se os fatores secretos são neurotoxinas sem o uso de estudos caros de roedores de longo prazo. Embora este método possa fornecer informações sobre a morte celular induzida pela microglia após a exposição a micropartículas. Também pode ser aplicado a outros modelos de doenças neurodegenerativas no contexto de testes de potenciais poluentes ambientais neurotóxicos.

Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades com a etapa de filtragem do meio de condição. Porque a eficiência da filtragem pode diferir dependendo do tamanho, forma e concentração das nanopartículas. Na preparação, aqueça o DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de PSN a 37 graus Celsius.

Em seguida, pegue células microgliais BV2 congeladas obtidas das passagens 18 25 e descongele-as rapidamente a 37 graus Celsius. Em seguida, transfira suavemente as células descongeladas para um frasco ventilado de 75 centímetros quadrados contendo 10 mililitros de meio e incube o frasco. Após 24 horas, substitua o meio e continue crescendo as células até atingirem uma confluência de 70-80%Neste ponto, aspire o meio e adicione 500 microlitros de solução quente de 1 ex tripsina EDTA.

Depois de deixar o frasco incubar por mais alguns minutos, use um raspador para coletar as células em 5 mililitros de DMEM quente. Em seguida, filtre as células do frasco usando um filtro de 70 mícrons. Repita esta filtração três vezes usando o mesmo filtro e colete as células em um tubo de 50 mililitros.

Uma vez filtradas, conte as células e, em seguida, semeie uma placa de fundo transparente de paredes pretas com 8000 células por poço em 200 microlitros de DMEM suplementado. Após 24 horas de incubação, substitua o meio nos poços por DMEM sem soro para matar a micróglia de fome. Após mais 24 horas de incubação, prossiga para ativar a microglia.

Para fazer isso, primeiro dilua as nanopartículas de prata em DMEM sem soro até a concentração de trabalho desejada. Em seguida, substitua 100 microlitros de meio pelo composto de tratamento. Certifique-se de incluir um controle negativo da solução veicular diluída sem as nanopartículas.

Agora continue a incubação por 24 horas e prossiga com a análise. Para começar, colete 200 microlitros de meio sobrenadante de cada poço de placa e carregue-o em um filtro que removerá as nanopartículas colocadas sobre um tubo de microcentrífuga. É importante lembrar que, ao filtrar as nanopartículas, seu tamanho, forma e concentração são um fator para a eficiência da fusão.

Portanto, é aconselhável testar a filtragem com antecedência. Agora gire os tubos para baixo a 14000g em temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, descarte o fluxo que contém as nanopartículas e coloque os filtros de cabeça para baixo em novos tubos de coleta.

Gire os filtros de cabeça para baixo a 1000g por dois minutos para coletar meio condicionado concentrado contendo citocinas. Em seguida, aumente o volume da coleção para 400 microlitros com DMEM suplementar recém-feito e armazene os tubos no gelo. Para garantir que as nanopartículas residuais de enxofre sejam removidas do meio filtrado, prepare padrões de nanopartículas não filtradas em uma faixa de concentração de um branco a 0,2 microgramas por mililitro em DMEM sem soro.

Em seguida, alíquota de 50 mililitros das amostras filtradas e de cada padrão em uma placa inferior transparente de parede preta e meça a absorbância de 390 a 410 nanômetros. Para medir a concentração de TNF-alfa nas amostras, use metade do volume restante em um kit disponível comercialmente. Para este ensaio, estabeleça células hipotalâmicas a partir de estoques congelados.

Usando os mesmos métodos descritos para estabelecer culturas microgliais. Em última análise, use-os para semear placas de fundo transparentes de paredes pretas com 5000 células por poço em 200 microlitros de DMEM suplementado. Após 24 horas de cultivo, remova 100 microlitros de meio e substitua-o por 100 microlitros de meio filtrado e concentrado coletado das culturas de células microgliais ativadas e, em seguida, incube a placa por 24 horas em condições padrão.

No dia seguinte, adicione 22 microlitros de reagente de resazurina a cada poço e continue a incubação por 20 minutos. Em seguida, com um espectrofotômetro de modo múltiplo, faça uma medida de florescência para estimar a viabilidade das células em termos de unidades de fluorescência relativa. Com o protocolo descrito, a função microglia pode ser usada como um biossensor substituto para a resposta do cérebro às nanopartículas.

A secreção de TNF-alfa pela microglia aumentou significativamente após a exposição às nanopartículas da lasca. Quando os neurônios hipotalâmicos foram expostos ao meio condicionado da microglia ativada por nanopartículas de prata, a viabilidade dos neurônios foi significativamente reduzida. Em princípio, a exposição às nanopartículas de prata ativou a microglia para um estado pró-inflamatório M1.

Em seguida, as citocinas pró-inflamatórias liberadas contribuem para a morte celular circundante. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a microglia como um biossensor substituto para testar a resposta às nanopartículas e se essa resposta é neurotóxica. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três ou quatro dias se for executada corretamente.

Após este procedimento, outros métodos, como o perfil de outras citocinas secretadas após a ativação microglial, podem ser realizados para fenotipar os estados de ativação microglial.