Name: Administração sustentada dos mitógenos de células β para intactas mouse Ilhotas Ex Vivo Usando biodegradável poli (ácido láctico-co-glicólico) Microesferas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprenda a administrar microesferas de PLGA biodegradáveis em ilhotas de rato intactas para estudar a proliferação de células beta pancreáticas. Este método versátil permite a liberação sustentada de compostos e análise por imunofluorescência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer a Bethany Carboneau (Vanderbilt University) pela leitura crítica deste manuscrito. Também agradecemos a Anastasia Coldren (Núcleo de Análise e Aquisição de Ilhotas do Centro Médico da Universidade Vanderbilt) pelos isolamentos das ilhotas, e ao Dr. Alvin C. Powers (Centro Médico da Universidade Vanderbilt) e ao Dr. David Jacobson (Universidade Vanderbilt) pelo uso de suas instalações de centrífuga e cultura de tecidos. Esta pesquisa envolveu o uso do Núcleo de Aquisição e Análise de Ilhotas do Centro de Pesquisa e Treinamento em Diabetes Vanderbilt, apoiado por DK20593 de concessão do NIH. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da American Heart Association (14POST20380262) para RCP e doações da Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592) e do Departamento de Assuntos de Veteranos (1BX00090-01A1) para M.A.G.

Todos os procedimentos foram aprovados e executados em conformidade com o Comité de Cuidados e Uso do Vanderbilt Institucional Animal. 1. Rotulagem COI com Fluoróforo (Opcional) <ol><li> Escolha um corante fluorescente que irá reagir com uma amina primária livre (por exemplo, numa proteína), tal como ésteres de succinimidilo ou derivados de fluoresceína, para visualizar microesfera de carga. Dissolve-se um excesso molar de 8X (em relação a moles de COI) de fluoróforo em 200 mL de sulfóxido de dimetilo (DMSO). </li><li> Ressuspender 50 mg de COI até um volume final de 800 ul de uma solução de veículo (concentração final de 62,5 ng / ul). A solução de veículo irá variar dependendo da fonte do COI. NOTA: veículo típico incluem soluções tampão de fosfatos salino (PBS) ou DMSO. </li><li> Adicionar toda a solução de fluoróforo / DMSO do passo 1.1 e ressuspender o COI. Vortex durante a noite a 4 ° C. Alternativamente, vortex a mistura de reacção à temperatura ambiente(TA) durante 4 h. </li><li> Após a reacção de marcação, remover o excesso de fluoróforo usando uma coluna de dessalinização. <ol><li> Escorra tampão de armazenamento da coluna de dessalinização e lavar com 16 ml de água deionizada. Descarte todo o fluxo através. </li><li> Adicionar o COI marcado de forma fluorescente para a coluna de dessalinização. Elui-se com 1,2 ml de água desionizada e recolher o fluxo através. </li><li> Repetir passo de eluição mais quatro vezes, cada vez que a adição de 1,2 ml de água desionizada e recolhendo o fluxo através de uma amostra em separado. </li><li> Congelar todo o fluxo coletados através de amostras a -80 ° C e liofilizar de acordo com as instruções do fabricante para 24 horas. </li></ol></li></ol> 2. COI-carregado Preparação de Microesferas através da água-água-em óleo-em-emulsão usada solvente método de evaporação <ol><li> Adicionar 1 mg de COI marcado por fluorescência a 100 ul de água desionizada para formar a primeira fase de água (W1). </li><li> Dissolve-se 65 mg de poli (aci láctico-co-glicólicod) (50:50 lactido: glicolido de peso molecular 54000 - 69000) em 750 mL de diclorometano num tubo de microcentrífuga. Ultrasonicate para 10 - 30 segundos (a 160 W) para dissolver completamente o PLGA. Isto forma a fase de óleo (o). </li><li> Adicionar toda a fase W1 gerado no passo 2.1 para a fase S de uma forma gota a gota. Emulsionar usando um homogeneizador de mão a 20.000 rpm durante 30 segundos para formar a fase W1 / S. </li><li> Adicionar toda a fase W1 / S de uma maneira gota a gota a 15 ml de um 1% (peso / volume) de poli aquoso (álcool vinílico) de solução (PVA) e emulsionar usando um homogeneizador de mão a 20.000 rpm durante 30 seg . </li><li> Transferir todo da emulsão gerado no passo 2.4 para um 200 ml frasco de fundo redondo e sob um vácuo de 635 milímetros de Hg utilizando um evaporador rotativo durante 1 hora para remover o solvente e gerar a fase aquosa. </li><li> Alíquotas de 1 ml da fase aquosa gerado no passo 2.5 a catorze tubos de microcentrífuga. A centrifugação da solução aquosa no interior dos tubos de microcentrífuga a 7500xg durante 8 minutos. NOTA: Nesta etapa, as microesferas estão presentes na solução aquosa restante e concentrou-se para o fundo do tubo de microcentrífuga. </li><li> Cuidadosamente remover 900 ml de solução aquosa a partir dos tubos de microcentrífuga com uma micropipeta, pipetagem, de modo a não perturbar as microesferas na parte inferior do tubo de microcentrífuga. <ol><li> Lavam-se as microesferas de PVA em excesso por adição de 1 ml de água desionizada a cada tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 7500 x g durante 8 min, e remover de novo cuidadosamente 900 ul de solução aquosa a partir dos tubos de microcentrífuga com uma micropipeta, pipetagem, de modo a não perturbar as microesferas na parte inferior do tubo de microcentrífuga. NOTA: A solução aquosa restante 100 ul contém as microesferas gerados. </li></ol></li><li> Congelar a solução aquosa de microesferas gerado no passo 2.7 a -80 ° C. </li><li> microesferas liofilizar num liofilizador utilizando de acordo com o fabricante doinstruções e armazenar a -20 ° C. NOTA: medir a eficiência de carregamento do COI dissolvendo completamente as microesferas de PLGA e a determinação da concentração de proteínas em relação a uma curva padrão de proteína livre 7. </li><li> Como controlo negativo, gerar um lote de microesferas &quot;em branco&quot; (doravante referidas como microesferas de controle). NOTA: A geração de microesferas de controlo é idêntica à geração de microsferas hidrófilas COI-carregados, sem adição de ICO a 800 ul da solução de veículo no passo 1.2. partículas de controlo de jogo em concentração em massa de PLGA em relação ao microesferas de PLGA COI-carregados para o ensaio mitogénio de células-β. </li></ol> 3. Preparação de Ilhota Meios de Cultura e Mídia Pré-ensaio <ol><li> Preparar 200 ml de meio de cultura de ilhotas intactas rato: meio RPMI 1640 suplementado com glucose 11 mM, soro de cavalo a 10%, 100 U / ml de penicilina G e 100 ug / ml de estreptomicina (daqui em diante referido como estádeixe meios de cultura). NOTA 1: Ao contrário de soro fetal de bovino (FBS), soro de cavalo carece lactogénio placentário, um indutor de proliferação de células β, que confunde análise no ensaio de proliferação. NOTA 2: À medida que as microesferas de PLGA não são esterilizados antes da utilização, a adição de antibióticos ao meio de cultura é crucial para evitar a contaminação microbiológica. </li><li> Retirar 25 ml de meio de cultura ilhéu com uma pipeta eletrônico e coloque em um tubo de 50 ml. Suplemento de 25 ml de meio de cultura ilhota no tubo de 50 ml com uma concentração final de 0,2 mM de EGTA para gerar o meio de pré-ensaio. NOTA: A adição de EGTA solta suavemente contatos célula-célula nas ilhotas sem alterar a arquitetura da ilhota. Isto ajuda a garantir o COI pode atingir as células internas da ilhota e ajuda a prevenir a necrose da ilhota central. </li></ol> 4. Cultura de Intact mouse Ilhotas <ol><li> Isolar ilhotas intactas a partir de uma estirpe de pré-selecionado, o sexo, AGE, e genótipo de murganhos após uma digestão com colagenase a 8,9 rotina de pâncreas. Piscina juntos ilhotas de como amostras. </li><li> Aliquota de 40 ilhéus em um poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços em 200 ul de meio de cultura das ilhotas. Visualmente ilhotas tamanho-fósforo por poço (uma avaliação precisa da equivalência das ilhotas (IEQ) entre as amostras não é necessário). Encha os poços vazios imediatamente adjacentes aos poços com ilhotas com 200 mL de água estéril para fornecer um buffer de evaporação. Cultura ilhotas em meios durante a noite a 37 ° C sob uma atmosfera de 95% de ar e 5% de CO 2. </li></ol> 5. Re-suspensão de microesferas de controle de PLGA COI-carregados e <ol><li> Após a recuperação da ilhota dia para o outro, microesferas ressuspender por adição de meio de pré-ensaio de uma alíquota de liofilizados microesferas de PLGA COI-carregado de tal modo que a concentração final de ICO no tubo de microcentrífuga é de 10 ng / ul (a quantidade de COI presentes numa dada quantidade de os micros geradospheres foi determinado no passo 2.9). Sonicar as microesferas ressuspensas COI-carregados em um banho de água gelada durante 10 minutos a 160 W com 10 seg longos impulsos a 4 ° C. </li><li> Ressuspender controlo microesferas de PLGA por adição do mesmo volume de meio de pré-ensaio para um volume igual de controlo liofilizado microesferas de PLGA. Sonicar os ressuspensos microesferas de PLGA de controlo num banho de água gelada durante 10 minutos a 160 W com 10 seg longos impulsos a 4 ° C. </li><li> Visualmente confirmar microsferas são dispersas por pipetagem 2 ul de microesferas ressuspensas entre duas lamelas de vidro. Visualize microesferas utilizando uma objectiva de 40x em um epifluorescência ou brightfield microscópio. </li><li> Se agregação significativa das microsferas é ainda visível, sonicado num banho de água gelada por mais 10 minutos adicionais a 160 W com 10 seg longos impulsos a 4 ° C e repetição visualização de microesferas ressuspenso. </li></ol> 6. Tratamento de Ilhotas com controle de PLGA Microesferas COI-carregados ou &lt;/ P&gt; <ol><li> Para cada cavidade a ser tratada com microesferas carregadas COI-, preparar meio de ensaio por diluição a 10 ng / ul de microesferas de COI ressuspensas em meio de pré-ensaio para um volume final de 100 ul e uma concentração final pré-determinada. NOTA: A concentração final óptima da proteína vai variar para cada COI utilizado para este ensaio. Idealmente, uma gama de concentrações finais são testadas. </li><li> Para cada cavidade a ser usada como um controlo, preparar controlo de meio de ensaio por diluição das microesferas de PLGA de controlo ressuspensos gerados no passo 5.2 com o mesmo volume de diluição utilizada para diluir as microesferas COI-carregados no passo 6.1. NOTA: As ilhotas tratadas com meio de ensaio de controlo irá servir como um controlo negativo para permitir a detecção de qualquer efeito das microesferas em branco pode ter sobre os resultados experimentais. </li><li> remover cuidadosamente 100 ul de meio de cultura ilhotas de cada poço com uma micropipeta de tal modo que não há ilhotas são desalojadas dos poços. Delicadamente adicionar 100 μl de meio de ensaio ou 100 ul de meio de ensaio de controlo a cada poço. </li><li> Incubar ilhotas a 37 ° C sob uma atmosfera de 95% de ar e 5% de CO2 durante três dias. </li></ol> 7. A dispersão ilhotas intactas Onto lâminas de microscópio <ol><li> Após três dias, usar uma micropipeta cuidadosamente para remover e descartar meio de ensaio de todos os poços, de modo a não deslocar ilhotas. Delicadamente adicionar 200 mL PBS para ilhotas de lavá-los do meio de ensaio. Remova cuidadosamente e elimine PBS com uma micropipeta e lavar cuidadosamente ilhotas novamente com uma 200 ul adicionais PBS. </li><li> Remova e descarte PBS com uma micropipeta e adicione 100 ml de 0,025% de tripsina, a solução 2 mM EDTA. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min. Pipetar ilhotas na solução de tripsina-EDTA cima e para baixo a cada 2 min até ilhotas são visualmente confirmada a ser dispersos em células individuais (note que alguns pequenos aglomerados de células pode ainda estar presente) utilizando um microscópio de luz. Transferir todo o volume de cada poço individualLY em tubos de microcentrífuga labeled-. </li><li> Adicionar 400 ul de meio de cultura de ilhotas a cada tubo de microcentrífuga para parar a dissociação de células mediada por tripsina. </li><li> Centrifugar as amostras durante 5 minutos a 100 xg, a 4 ° C para sedimentar as células das ilhotas para o fundo de tubos de microcentrífuga. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma micropipeta, e pellet ressuspender em 200 meios de cultura ilhéu ul fresco. </li><li> Usando uma cito-centrífuga, centrífuga dissociada ilhotas a 140 xg por 3 min em lâminas de microscópio carregadas. </li><li> Ar lâminas secar à temperatura ambiente durante 10 min, em seguida, desenhar uma caixa em torno das ilhotas dissociadas com uma caneta de marcação hidrofóbico. </li><li> Fixar as células com 75 uL de 4% de paraformaldeído (PFA) a TA durante 10 min. Remover PFA 4% e lavar cuidadosamente as células em 75 ul PBS duas vezes. Após a lavagem, permeabilizar as células com 75 uL de 0,2% de Triton X-100 em PBS durante 10 min. Em seguida, lavar as células com 75 ul de PBS. Cuidado: PFA é conhecido por ser alergénicos, cancerígenos, e tóxico. </li></ol&gt; 8. Imunofluorescência Rotulagem de Dissociated Ilhotas de insulina ea proliferação celular Marker, Ki67 <ol><li> Preparar uma câmara úmida, colocando duas toalhas de papel molhado no fundo de uma caixa de slides capacidade microscópio 100 slide. </li><li> Colocar as lâminas planas para baixo (células voltadas para cima) em câmara úmida. Preparar as amostras para rotulagem por aspiração do PBS do passo de lavagem anterior, utilizando uma micropipeta e a adição de 75 ul de solução de bloqueio (5% normal asno soro (NDS) em PBS) a cada diapositivo para bloquear a ligação não específica de anticorpos contra os espécimes. Incubar as lâminas em solução de bloqueio durante 1 h à TA. </li><li> Delicadamente aspirado bloqueio solução usando uma micropipeta e adicionar 75 ul de solução de anticorpo primário contendo de cobaia anti-insulina de coelho e os anticorpos anti-Ki67, diluiu-se 1 ug / ml em 5% de NDS em PBS. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h. NOTA: marcadores alternativos de proliferação celular incluem proliferando antigénio da célula nuclear (PCNA) e fosfohistone H3 (PH3), </li><li> Aspirar cuidadosamente solução de anticorpo primário utilizando uma micropipeta e lavar as células com 75 ul de PBS. Aspirar PBS utilizando uma micropipeta e lavar as células mais duas vezes, cada vez com 75 ul de PBS. Incubar cada amostra com 75 ul de anticorpo secundário anti-cobaia de Cy5 e Cy3 anticorpo secundário anti-coelho diluída a 2 ug / ml em solução de bloqueio durante 1 h à TA. NOTA: Não use anticorpos secundários marcados com o mesmo ou espectralmente sobreposição fluoróforo que já foi usado para rotular as microesferas. </li><li> A solução de anticorpo secundário aspirado utilizando uma micropipeta e incuba-se 75 ul de 300 nM DAPI em PBS durante 3 min a RT. Aspirar DAPI utilizando uma micropipeta e enxaguar em água desionizada, durante 5 min. </li><li> Gentilmente aspirar água de amostras utilizando uma micropipeta. Detectar uma gota (cerca de 100 L) de solução de montagem de secagem rápida contendo antifade reagente sobre uma lamela de vidro. Inverta o lado do microscópio amostra deslizar para baixo, onto a solução de montagem. Pressione suavemente as lamelas contra a lâmina utilizando uma ponta de pipeta para remover as bolhas e limpe o excesso de líquido com um tecido de limpeza macio. Permitir lamelas secar durante a noite à TA. </li></ol> 9. Aquisição de Imagem e Análise <ol><li> Use um microscópio de epifluorescência com uma câmera acoplada para aquisição de imagem. Para cada fluoróforo, determinar o tempo de exposição óptimo (tipicamente 20 ms para DAPI, 40 - 80 mseg para insulina, e 250 mseg de Ki67). Certifique-se de parâmetros de aquisição de imagem são iguais para todas as amostras. </li><li> Para cada amostra, contar manualmente 3.000 células de insulina-positivos e dos que contar quantos são também Ki67-positivas. Quantidade de apenas as células de insulina positivas que têm um núcleo bem definida e claramente visíveis. Calcula-se a percentagem de proliferação de células-p para cada amostra dividindo o número de células de Ki67-positivas / insulina-positivo pelo número total de células de insulina positivas e multiplicando por 100. </li><li> Depois determining a percentagem de proliferação de células-p, para cada amostra para determinar se uma diferença estatisticamente significativa na proliferação de células β existe entre o controlo e amostras experimentais por análise de resultados com um ANOVA de uma via utilizando o software estatístico disponível comercialmente. </li></ol>

<ol><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+deficit+and+increased+beta-cell+apoptosis+in+humans+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes.</a> Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).</li>
<li>Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+deterioration+determines+the+onset+and+rate+of+progression+of+secondary+dietary+failure+in+type+2+diabetes+mellitus%3A+the+10-year+follow-up+of+the+Belfast+Diet+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet+Med%22%5BJournal%5D)">Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study.</a> Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).</li>
<li>Bouwens, L., Rooman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pancreatic+beta-cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of pancreatic beta-cell mass.</a> Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).</li>
<li>McCall, M., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Update on islet transplantation.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823(2012).</li>
<li>Danhier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA-based+nanoparticles%3A+an+overview+of+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications.</a> J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).</li>
<li>Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta+cell+lines+and+their+applications+in+diabetes+mellitus+research%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research.</a> ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).</li>
<li>Rui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+release+of+vascular+endothelial+growth+factor+using+poly-lactic-co-glycolic+acid+microspheres%3A+in+vitro+characterization+and+application+in+polycaprolactone+fumarate+nerve+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits.</a> Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).</li>
<li>Lacy, P. E., Kostianovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+isolation+of+intact+islets+of+Langerhans+from+the+rat+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas.</a> Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+pancreatic+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine pancreatic islet isolation.</a> J Vis Exp. (7), e255(2007).</li>
<li>Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+characterization+and+in-vitro+evaluation+of+sustained+release+protein-loaded+nanoparticles+based+on+biodegradable+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers.</a> Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).</li>
<li>Riley, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connective+tissue+growth+factor+modulates+adult+beta-cell+maturity+and+proliferation+to+promote+beta-cell+regeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice.</a> Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).</li>
<li>Mosser, R. E., Gannon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+for+small+scale+screening+of+candidate+beta+cell+proliferative+factors+using+intact+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets.</a> Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).</li>
<li>Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+interactions+regulate+beta-cell+proliferation+in+islet-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures.</a> Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).</li>
<li>Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+the+regulation+of+islet+beta+cell+mass+in+mice%3A+the+role+of+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin.</a> Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).</li>
<li>Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+programmed+cell+death+in+situ+via+specific+labeling+of+nuclear+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.</a> J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).</li>
<li>Kuo, L. J., Yang, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX+-+a+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).</li>
<li>Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+culture+and+preservation+strategies%3A+advances%2C+challenges%2C+and+future+outlook%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook.</a> Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).</li>
<li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).</li>
<li>Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species+%28ROS%29+Responsive+Polymers+for+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications.</a> Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).</li>
<li>Makadia, H. K., Siegel, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+Lactic-co-Glycolic+Acid+%28PLGA%29+as+Biodegradable+Controlled+Drug+Delivery+Carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier.</a> Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).</li>
<li>Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanoparticles+loaded+with+insulin-phospholipid+complex+for+oral+delivery%3A+preparation%2C+in+vitro+characterization+and+in+vivo+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation.</a> J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).</li>
<li>Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-based+technologies+for+osteoarthritis+detection+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy.</a> Drug Deliv Transl Res. , (2015).</li>
<li>Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+pH-+and+temperature-responsive+microparticles+for+protein+delivery+to+ischemic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues.</a> Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).</li>
<li>Poole, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS-responsive+microspheres+for+on+demand+antioxidant+therapy+in+a+model+of+diabetic+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease.</a> Biomaterials. 41, 166-175 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O estudo da proliferação de células β em cultura é normalmente prejudicada por várias dificuldades. Em primeiro lugar, as linhas de células imortalizadas β são caracterizados por níveis mais elevados de proliferação do que o que é encontrado em células beta em ilhéus endógenos vivo. Além disso, estas linhas de células imortalizadas não têm a arquitetura normal crítico para a função das células β normal. Estes dois factos fazem com que seja difícil para determinar se os resultados obtidos utilizando linhas de células imo...

células beta pancreáticas são as únicas células produtoras de insulina no corpo e são essenciais para manter a homeostase da glicose do sangue. Quando os indivíduos saudáveis possuem massa suficiente de células β e funcionar para regular adequadamente a glicose no sangue, indivíduos com diabetes são caracterizados pela insuficiente massa de células β e / ou função de 1,2. Foi proposto que a indução da proliferação de células β em última instância pode aumentar a massa de células β e restaurar a homeostase de glucose em indivíduos com diabetes 3. No entanto, é necessária a avaliação e validação de potenciais compostos de proliferação de células β em ilhotas intactas antes de terapias eficazes podem ser desenvolvidas. O transplante de ilhotas humanas de cadáveres em indivíduos com diabetes restaura a homeostase da glicose no sangue durante algum tempo, mas a disponibilidade e sucesso deste procedimento experimental é dificultada pela escassez de ilhotas humanos disponíveis para transplante e pela morte das células beta nas ilhotas rétransplante er 4. Mesmo com a descoberta de factores que induzem a multiplicação das células produtoras de insulina, um grande desafio ainda existe no fornecimento destes factores a locais relevantes in vivo. Uma estratégia para a entrega local sustentada de compostos proliferativas de células β é ácido poli (láctico-co-glicólico) (PLGA). PLGA tem uma história de uso na FDA aprovou produtos de entrega de drogas devido à sua alta segurança, biodegradabilidade, e cinética de libertação prolongada 5. Especificamente, é um copolímero de PLGA de lactido e glicolido que degrada por meio de hidrólise com água in vivo ou em cultura em ácido láctico e ácido glicólico, que são metabolitos que ocorrem naturalmente no corpo. O composto de fármaco encapsulado possa ser libertado no ambiente circundante por ambos difusão e / ou mecanismos de libertação controlada por degradação. A encapsulação de COI proporciona protecção contra a degradação enzimática, melhorar a biodisponibilidade do reagente em relação ao unencapsulated COI 5. Sugerimos que as microesferas de PLGA podem ser usadas para administrar compostos candidatos para ilhotas intactas em cultura, e, finalmente, in vivo. Testar a eficácia de PLGA para administrar agentes mitogénicos de células β para ilhotas ex vivo é crítico antes de protocolos de transplante são exploradas. Actualmente, não existe uma técnica para medir a proliferação de células β em animais vivos. Experimentos para avaliar a eficácia de compostos potenciais de proliferação in vivo, portanto, requerem administração destes compostos a animais vivos, com dissecção posterior e processamento de pancreata para imunomarcação. Tais protocolos são caros e laborioso, e requer o composto a ser administrada sistemicamente, sem qualquer garantia de que eles vão atingir as ilhotas. Por outro lado, várias linhas de células imortalizadas β estão disponíveis para o estudo de células produtoras de insulina em cultura, mas estas linhas de células têm a arquitectura dos ilhéus e ENVIRONMENt encontrada em organismos vivendo 6. Linhas de células imortalizadas β são também caracterizados como tendo um grau muito mais elevado de replicação de células beta endógeno in vivo, complicando, assim, a análise dos compostos que induzem a proliferação. Neste estudo, descrevemos um protocolo que utiliza ilhotas intactas isoladas a partir de ratinhos adultos. Ao contrário de linhas de células-β, ilhotas intactas reter arquitetura normal das ilhotas. Do mesmo modo, em contraste com experiências realizadas in vivo, a administração de compostos proliferativas directamente para ilhotas intactas em cultura reduz significativamente a quantidade de reagentes que é necessário para medir com precisão a proliferação de células β. O estudo actual utiliza PLGA para administrar um COI, neste exemplo, crescimento de tecido conectivo do Factor humano recombinante (rhCTGF). O método aqui descrito confere uma vantagem significativa sobre a administração do composto em bruto de ilhotas de cultura, uma vez que permite uma libertação contínua do composto em the meios de comunicação. Notavelmente, este ensaio pode ser modificado para administrar uma ampla variedade de proteínas e anticorpos de interesse para ilhotas intactas. Efeitos sobre outros tipos de células endócrinas, incluindo células-ct, também podem ser analisados.

<table><tbody><tr><td>Ácido carboxílico verde de Oregon 488, éster de Succinimidyl, 6 isomer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6149</td><td>Para rotular o COI com fluoróforo</td></tr><tr><td>DMSO Dimethyl Sulfoxide</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>Para dissolver o fluoróforo na etapa 1</td></tr><tr><td>Colunas de dessalinização PD-10 descartáveis</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>Coluna de dessalinização usada na etapa 1</td></tr><tr><td>Resomer RG 505, Poli (D, L-lactide-co-glicolide), éster terminado, peso molecular 54.000 - 69.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>739960</td><td>Usado na geração de microesferas na etapa 2</td></tr><tr><td>Poli (álcool vinílico) peso molecular 89.000 - 98.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td>Usado na geração de microesferas na etapa 2</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Scientific</td><td>11879-020</td><td>Para ilhotas de cultura</td></tr><tr><td>Dextrose anidra</td><td>Fisher BioReagents</td><td>200-075-1</td><td>Suplemento para meio de ilhotas</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>Antibióticos para meio de ilhotas</td></tr><tr><td>Soro normal de cavalo</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>008-000-121</td><td>Suplemento para meio de ilhotas</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 96 poços</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Para ilhéus</td></tr> <tr><td>de culturaÁcido etilenoglico-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetracético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>Suplemento para meios de ilhotas pré-ensaio</td></tr><tr><td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>Para células giratórias em lâminas de microscópio</td></tr><tr><td>EZ Single Cytofunnel</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710020</td><td>Para células giratórias em lâminas</td></tr> <tr><td>de microscópioÁcido etilenodiaminotetracético</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP118-500</td><td>Usado na dissociação de ilhotas</td></tr><tr><td>paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Para fixar células</td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151</td><td>Para células permeabilizantes</td></tr><tr><td>Soro de burro normal</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Reagentes de bloqueio para imunofluorescência</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 anticorpo</td><td>abcam</td><td>ab15580</td><td>Para imunofluorescência Ki67</td></tr><tr><td>Cobaia policlonal Anti-Insulina</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>Para imunofluorescência de insulina</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>Para imunofluorescência Ki67</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td>Para imunofluorescência de insulina</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Para visualização de núcleos em imunofluorescência</td></tr><tr><td>Aqua-Mount</td><td>Lerner Laboratories</td><td>13800</td><td>Mídia de montagem de secagem rápida</td></tr><tr><td>FreeZone -105 &deg; C 4,5 litros Cascade Benchtop Freeze Dry System</td><td>Labconco</td><td>7382020</td><td>Para liofilização de microesferas</td></tr></tbody></table>

administração sustentada dos mitógenos de células β para intactas mouse ilhotas<em&gt; ex vivo</em&gt; usando biodegradável poli (ácido láctico-co-glicólico) microesferas

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

O desenvolvimento de biomateriais aumentou significativamente o potencial para a entrega de drogas alvo para uma variedade de tipos de células e de tecidos, incluindo as células beta pancreáticas. Além disso, biomateriais partículas, hidrogéis, e andaimes também oferecem uma oportunidade única para administrar sustentada, a entrega de drogas controlável a p-células em cultura e em modelos de tecidos transplantados. Estas tecnologias permitem o estudo de fatores de proliferação de células β candidato usando ilhotas intactas e um sistema de translação relevante. Além disso, determinar a eficácia ea viabilidade de fatores candidatos para estimular a proliferação de células β em um sistema de cultura é fundamental antes de avançar para modelos in vivo. Aqui, nós descrevemos um método para co-cultura ilhotas intactas rato com o composto biodegradável de interesse (COI) poli -loaded (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) com a finalidade de avaliar os efeitos das sustentada in situ release of factores mitogénicos sobre a proliferação de células β. Esta técnica descreve em detalhe como gerar microesferas de PLGA contendo uma carga desejado, utilizando reagentes disponíveis comercialmente. Embora a técnica descrita utiliza factor de crescimento humano recombinante conjuntivo tecido (rhCTGF) como um exemplo, pode ser prontamente utilizada uma ampla variedade de COI. Além disso, este método utiliza placas de 96 poços para minimizar a quantidade de reagentes necessários para avaliar a proliferação de células β. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para utilizar biomateriais alternativos e outras características da célula endócrina, tais como a sobrevivência de células e estado de diferenciação.

A Figura 1 é uma representação visual das microesferas geradas utilizando o protocolo anterior. O protocolo aqui descrito proporciona microesferas rhCTGF-carregada de vários tamanhos. A maior fracção de microsferas vai situar-se entre 1 e 10 um de diâmetro, embora algumas microsferas que podem ser maiores (Figura 2). Se desejado, o tamanho de microsferas pode ser ajustada e optimizada com base em parâmetros de fabrico, tais como velocida...

Aqui, apresentamos metodologia para gerar e administrar compostos de microesferas de poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) carregadas de interesse para ilhotas de camundongos intactas em cultura com subsequente análise de imunofluorescência da proliferação de células β. Este método é adequado para determinar a eficácia de mitógenos candidatos a β células.

Administração sustentada dos mitógenos de células β para intactas mouse Ilhotas<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Usando biodegradável poli (ácido láctico-co-glicólico) Microesferas

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

O objetivo geral deste protocolo é utilizar microesferas de &lt;span data-jove-entity="chemical"&gt;ácido poli(lático-co-glicólico)&lt;/span&gt; ou PLGA para entregar compostos de interesse a ilhotas pancreáticas intactas cultivadas, a fim de estudar os efeitos de compostos individuais na proliferação de células beta pancreáticas adultas. Este método pode ser usado para testar uma variedade de compostos entregues localmente de maneira sustentada a ilhotas intactas. A principal vantagem deste método é que ele pode ser facilmente adaptado para biomateriais alternativos de entrega, compostos de interesse e ensaios de ponto final.Este método também possui o potencial de entregar compostos de interesse em conjunto com a transferência adotada de ilhotas in vivo. A demonstração de como produzir as microesferas de PLGA será feita por Taylor Kavanaugh, o aluno de pós-graduação do meu laboratório. Comece adicionando um miligrama do composto de interesse marcado com fluorescência a 100 microlitros de água desionizada para formar a primeira fase aquosa.Em seguida, dissolva 65 miligramas de PLGA em 750 microlitros de diclorometano em um frasco de cintilação e ultrassonique a mistura por 10 a 30 segundos a

sustained-administration-cell-mitogens-to-intact-mouse-islets-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Apresentamos aqui um protocolo para o isolamento de ilhotas do modelo de camundongo com diabetes tipo 2, Leprdb e detalhes de um ensaio de células vivas para medição da secreção de insulina de ilhotas intactas que utiliza microscopia de 2 fótons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas

Este protocolo demonstra isolamento de manchas murinas e semeadura em um andaime decelularizado. As ilhotas suportadas em andaimes foram transplantadas para a almofada de gordura epididimática de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ). As ilhotas sobreviveram no local do transplante e revertearam a condição hiperglicêmica.

Transplante de islotes apoiado em andaimes na almofada de gordura epidídmica de ratos diabéticos

Este protocolo da isolação da ilhotas descreveu uma rota nova da injeção do colagenase para digerir o tecido exócrina e um procedimento simplificado do inclinação para purificar os ilhotas dos ratos. Envolve a digestão enzimática, separação de gradiente/purificação, e Islet mão-picking. O isolamento bem-sucedido pode produzir 250 – 350 de alta qualidade e ilhotas totalmente funcionais por mouse.

Um protocolo de alta eficiência simples para isolamento de Islet pancreático de camundongos

É apresentado um método para o omental transplante de ilhotas em um rato. As ilhotas isoladas são misturadas com hidrogel e a mistura é colocada em bolsa omental de um rato diabético. Então, a glicose no sangue é monitorada, e é realizada a análise imuno-histoquímico.

Um método de transplante de ilhotas para o omento no Mouse

Transplante de ilhotas pancreáticas é uma maneira de conseguir normoglycemia no diabetes tipo 1. Este artigo centra-se na técnica de transplante através da rota intraportal para manter os níveis normais de glicose em ratos diabéticos.

Intraportal transplante de ilhotas pancreáticas no modelo de Mouse

Aqui, apresentamos um protocolo de validação em vivo de terapia celular baseada em hidrogel, ilustrada pelo exemplo de transplante de ilhotas. h-Omental ilhéu de Matrix (localizador) implantação de enchimento permite a implantação de uma célula-hidrogel mistura entre as camadas omental, perto dos vasos sanguíneos, para maximizar a enxertia em um ambiente apropriado e metabólica.

Transplante de ilhotas intra-Omental usando h-Omental enchimento Matrix ilhéu (hOMING)

Neste protocolo, um método de isolamento e transplante de isto de murina no tecido adiposo branco subcutâneo inguinal é descrito. Ishotas singeneicas isoladas são transplantadas em um receptor de murina usando um hidrogel de membrana do porão. O nível de glicemia dos receptores é monitorado, e a análise de histologia dos enxertos de lumiçal é realizada.

Modelo de transplante de tecido adiposo branco subcutâneo inguinal (ISWAT) de Isletas murina

Aqui apresentamos procedimentos cirúrgicos refinados na realização com sucesso do transplante de ilhotas intraportais, um procedimento cirúrgico clinicamente relevante, mas tecnicamente desafiador, em camundongos.

Minimizando o sangramento da veia do portal pós-infusão durante o transplante de ilhotas intrahápticas em camundongos

Este estudo desenvolveu um método simplificado para extrair eficientemente ilhéus primários funcionais e células acinares do pâncreas do camundongo, oferecendo uma ferramenta valiosa para estudar a comunicação intercelular na patogênese do Diabetes Induzido por Pancreatite Aguda.

Um método simples e rápido para isolamento simultâneo de ilhotas primárias e células acinares pancreáticas primárias de camundongos

Fornecemos um protocolo minimamente invasivo para o transplante intramuscular de ilhéus de células-tronco pancreáticas derivadas de células-tronco humanas em camundongos imunodeficientes, para implantação in vivo e análise posterior.

Transplante Intramuscular de Células Endócrinas Pancreáticas Derivadas de Células-Tronco Humanas Pluripotentes em Camundongos

Aprenda a administrar microesferas de PLGA biodegradáveis em ilhotas de rato intactas para estudar a proliferação de células beta pancreáticas. Este método versátil permite a liberação sustentada de compostos e análise por imunofluorescência.

Administração sustentada dos mitógenos de células β para intactas mouse Ilhotas Ex Vivo Usando biodegradável poli (ácido láctico-co-glicólico) Microesferas (Vídeo) | JoVE Journal

Administração sustentada dos mitógenos de células β para intactas mouse Ilhotas

Explorar mais vídeos