Administração sustentada dos mitógenos de células β para intactas mouse Ilhotas

O objetivo geral deste protocolo é utilizar microesferas de <span data-jove-entity="chemical">ácido poli(lático-co-glicólico)</span> ou PLGA para entregar compostos de interesse a ilhotas pancreáticas intactas cultivadas, a fim de estudar os efeitos de compostos individuais na proliferação de células beta pancreáticas adultas. Este método pode ser usado para testar uma variedade de compostos entregues localmente de maneira sustentada a ilhotas intactas. A principal vantagem deste método é que ele pode ser facilmente adaptado para biomateriais alternativos de entrega, compostos de interesse e ensaios de ponto final.

Este método também possui o potencial de entregar compostos de interesse em conjunto com a transferência adotada de ilhotas in vivo. A demonstração de como produzir as microesferas de PLGA será feita por Taylor Kavanaugh, o aluno de pós-graduação do meu laboratório. Comece adicionando um miligrama do composto de interesse marcado com fluorescência a 100 microlitros de água desionizada para formar a primeira fase aquosa.

Em seguida, dissolva 65 miligramas de PLGA em 750 microlitros de diclorometano em um frasco de cintilação e ultrassonique a mistura por 10 a 30 segundos a 160 watts para dissolver completamente o PLGA. Isso forma a fase oleosa. Adicione toda a primeira fase aquosa à fase oleosa, gota a gota.

Em seguida, utilize um homogeneizador manual para emulsificar a solução a 20.000 rpm durante 30 segundos, formando a primeira fase água-óleo. Então, adicione toda a primeira fase água-óleo gota a gota em 15 mililitros de solução de PVA 1% e emulsifique conforme demonstrado anteriormente. A seguir, transfira todo o volume da emulsão para um balão de fundo redondo de 200 mililitros e utilize um evaporador rotativo para remover o solvente, gerando a fase aquosa sob vácuo de 635 milímetros de mercúrio por uma hora.

Aliquotar um mililitro da fase aquosa em cada um dos 14 tubos de microcentrífuga e pelotizar as microesferas por centrifugação. Ao final da centrifugação, utilizar uma micropipeta para remover 900 microlitros da solução aquosa de cada tubo, tomando cuidado para não perturbar os pellets. Lavar as microesferas com um mililitro de água desionizada, seguido da remoção cuidadosa de 900 microlitros do sobrenadante.

Em seguida, adicione 900 microlitros de água deionizada aos 100 microlitros restantes dos sobrenadantes. Em seguida, vórtex brevemente e sonique para ressuspender os pellets. Após o isolamento das ilhotas dos animais experimentais de interesse, semeie 40 ilhotas com tamanho visualmente pareado em um poço de uma placa de cultura tecidual de 96 poços contendo 200 microlitros de meio de cultura de ilhotas.

Na manhã seguinte, re-suspenda uma alíquota de microesferas em meio pré-ensaio, de modo que a concentração final do composto de interesse no tubo seja de 10 nanogramas por microlitro, e sonique as microesferas em banho de gelo e água por 10 minutos a 160 watts, com pulsos de 10 segundos a quatro graus Celsius. Em seguida, remova cuidadosamente 100 microlitros do meio de cultura de ilhotas de cada poço sem deslocar as ilhotas, e incube as culturas com 100 microlitros do meio de ensaio contendo microesferas. Após três dias, descarte cuidadosamente o meio de ensaio de todos os poços sem perturbar as ilhotas, e lave suavemente as ilhotas duas vezes com 200 microlitros de PBS.

Os ilhotas aderem-se apenas fracamente a uma placa de 96 poços. Portanto, é fundamental que o meio e o PBS sejam removidos suavemente de cada poço para que os ilhotas não sejam acidentalmente deslocados e descartados. Após a segunda lavagem, imergir suavemente os ilhotas em 100 microlitros de solução de tripsina-EDTA por três minutos à temperatura ambiente, com pipetagem suave após dois minutos.

Transfira todo o volume de cada poço para tubos individuais de microcentrífuga e adicione 400 microlitros de meio de cultura de ilhotas a cada tubo para interromper a dissociação. Após coletar as ilhotas tratadas com microesferas por centrifugação, use uma micropipeta para remover suavemente os sobrenadantes e ressuspender os pellets em 200 microlitros de meio de cultura de ilhotas fresco. Em seguida, centrifugue as ilhotas dissociadas em lâminas microscópicas carregadas usando uma citocentrifugadora.

Após a secagem ao ar, desenhe uma caixa ao redor das ilhotas com uma caneta marcadora hidrofóbica e fixe as células em 75 microlitros de paraformaldeído a quatro por cento por 10 minutos à temperatura ambiente, seguido por duas lavagens com 75 microlitros de PBS. Após a segunda lavagem, permeabilize as células com 75 microlitros de Triton X-100 a 0,2% em PBS por 10 minutos, seguido por uma lavagem final com 75 microlitros de PBS puro. Para imunomarcar as ilhotas, comece colocando as lâminas com o lado das células voltado para cima em uma câmara úmida e remova o PBS.

Em seguida, bloqueie a ligação inespecífica com 75 microlitros de soro de jumento normal à temperatura ambiente. Após uma hora, substitua o soro por 75 microlitros do anticorpo primário de interesse por mais uma hora à temperatura ambiente. Ao final da incubação, aspire cuidadosamente a solução do anticorpo primário e lave as amostras com lavagens de 375 microlitros de PBS.

Em seguida, incubar as ilhotas com 75 microlitros do anticorpo secundário marcado com imunofluorescência apropriado por uma hora, em temperatura ambiente e protegido da luz. Ao final da incubação, substituir a solução do anticorpo secundário por 75 microlitros de Dappy durante três minutos, seguido por uma lavagem de cinco minutos em água desionizada. Ao final da lavagem, colocar uma gota de 100 microlitros de solução de montagem de secagem rápida contendo reagente anti-fading sobre um lamínula de vidro e inverter uma lâmina de microscopia, com o lado da amostra voltado para baixo, sobre a solução de montagem.

A maior fração de microesferas terá diâmetro entre 1 e 10 mícrons, embora algumas microesferas possam ser maiores. Após a dispersão das ilhotas tratadas com microesferas de PLGA intactas e sua subsequente imunomarcação, é comum observar regiões da amostra desprovidas de qualquer marcação entre as células, causadas por microesferas intactas que não foram completamente removidas durante as etapas de lavagem. Após a aquisição de imagens, a porcentagem de células positivas para insulina e Ki67 pode ser quantificada por meio de análise de imagem por software ou por contagem manual do número total de células marcadas.

Tratar os ilhotas intactos com microesferas de fator de crescimento do tecido conjuntivo humano recombinante em PLGA por três dias, conforme acabou de ser demonstrado, resulta em um aumento da proliferação de células beta, demonstrando que a proteína não perde nenhuma funcionalidade durante a geração das microesferas. Uma vez dominada, esta técnica pode gerar resultados em menos de uma semana, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o impacto sobre a proliferação de células beta em seu experimento variará dependendo do composto de interesse e da cinética exata de liberação das microesferas geradas.

Após seguir este procedimento, outros métodos, como a co-transplantação de microesferas carregadas com compostos juntamente com ilhotas pancreáticas intactas, podem ser realizados para responder a outras questões, como se o composto de interesse pode induzir a proliferação de células beta in vivo. O PLGA possui histórico de uso em dispositivos e sistemas de liberação de fármacos que já foram aprovados pela FDA, representando, portanto, uma boa opção para pesquisadores e clínicos que desejam entregar cargas terapêuticas a tecidos específicos por um período prolongado. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar microesferas de PLGA carregadas com compostos e administrá-las a ilhotas intactas em cultura.

Não se esqueça de que trabalhar com paraformaldeído pode ser extremamente perigoso e que precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual apropriados, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.