Name: Técnicas de imagem Prometáfase e Metaphase da meiose I em Fixed Drosophila oócitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprenda técnicas de imagem de oócitos de Drosophila para estudar a montagem do fuso e orientação cromossômica durante a meiose I. Este método permite visualizar estruturas celulares com imunofluorescência.

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Agradecemos a Christian Lehner por fornecer o anticorpo CENP-C e a Eric Joyce por recomendações sobre FISH. O trabalho no laboratório McKim foi financiado por uma bolsa do NIH (GM101955).

Nota: Os procedimentos são realizados à temperatura ambiente a menos que indicado de outra maneira. incubadoras de temperatura controlada são usados ​​para manter as temperaturas para criação mosca e cruza salvo indicação em contrário. 1. Preparações <ol><li> Prepare Moscas. <ol><li> Prometáfase enriquecido coleções de ovócitos. <ol><li> Limpar moscas adultas a partir saudáveis, jovens de ações ou transversais culturas. garrafas de idade para dois dias a 25 ° C. Nota: Geralmente duas garrafas saudáveis ​​serão suficientes, embora mais podem ser necessários para algumas culturas cruzadas. </li><li> Após dois dias, recolher ~ 100 a 300 (fêmeas que são 0 a 2 dias de idade, neste ponto) de garrafas. As fêmeas não precisa ser virgens. Adicionar uma pincelada de pasta de levedura para o lado de um frasco e colocá-30 fêmeas e 10 machos e 15 cada um em frascos yeasted. frascos de idade para dois dias a 25 ° C. </li></ol></li><li> Metaphase enriquecido ovócitos Collections. <ol><li> Recolha ~ 100 a 300 fêmeas de estoque ou cross cultures. Adicionar uma pincelada de pasta de levedura para o lado de um frasco e colocar cada 30 fêmeas (sem machos adicionados) para dentro de frascos yeasted. frascos de idade para três a cinco dias a 25 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Prepare Solutions. Nota: As soluções podem ser armazenadas indefinidamente à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra maneira. <ol><li> Preparar tampão de modificação de Robb (5x): 500 mM de HEPES, 500 mM de sacarose, acetato de sódio 275 mM, acetato de potássio 200 mM, glicose 50 mM, cloreto de magnésio a 6 mM, e cloreto de cálcio 5 mM. Use 10 N 11: 8 de hidróxido de sódio: hidróxido de potássio para trazer o pH para 7,4. Esterilizar por filtração; Não autoclave. Armazenar a -20 ° C. Descongelar conforme necessário para preparar ~ 200 ml de 1x Robb por ovócitos prep. </li><li> Fixação Solutions. <ol><li> Opção # 1: Prepare formaldeído / fixação heptano. Preparar tampão de fixação: solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS), mais 150 mM de sacarose. Para usar, faça fresco com 687,5 ul Fixação de buffer e 312,5 mL de 16% de formaldeídopor prep oócito. CUIDADO: Use luvas enquanto estiver usando soluções de formaldeído em um exaustor. Descarte de resíduos de acordo com as diretrizes institucionais. </li><li> Opção # 2: Preparar o formaldeído / fixação cacodilato. Prepare a mistura Fix: sacarose 250 mM, acetato de potássio 100 mM (pH 7,5), acetato de sódio 25 mM (pH 7,0), e EGTA 25 mM (pH 8,0). Para usar, faça fresco com 400 ul Fix Mix, 100 cacodilato ul de potássio (1 M, pH 7,2), e 500 mL de 16% de formaldeído por prep oócito. CUIDADO: cacodilato de potássio contém arsênico. </li></ol></li><li> Prepare PBS / Triton X-100: 1x PBS mais 1% ou 0,05% de Triton X-100. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare PBS-Tween 20 Albumina de Soro Bovino (BSA) (PTB): 1x PBS, BSA a 0,5% (w / v) e 0,1% de Tween-20. Pode ser armazenado a 4 ° C durante uma semana. </li><li> A fluorescência in situ fluorescente (FISH) Soluções. <ol><li> Prepara-cloreto de sódio 20X Citrato de sódio (SSC): 3 M de cloreto de sódio e citrato de sódio 0,3 M. </li><li> Prepare 2x SSC-Tween-20 (SSCT): 2 x SSC mais 0,1% de Tween-20. Faça frescas, ~ 20 ml por prep oócito. </li><li> Preparar soluções de formamida: 2 x SSC, 0,1% de Tween-20, além de formamida. Adicione fresco, 1 ml de 20% de formamida, 0,5 ml de formamida a 40%, e 2 ml de formamida a 50% por preparação de oócitos. CUIDADO: Use luvas enquanto estiver usando soluções de formamida em um exaustor. Descarte de resíduos de acordo com as diretrizes institucionais. </li><li> Preparar a solução de hibridização: 2 x SSC, formamida a 50%, e 10% de sulfato de dextrano (w / v). Armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Sondas peixe. <ol><li> Oligonucleotídeos ordem (ver Tabela 1 para sequências) com HPLC e desejado 5 &#39;modificação fluorescente (por exemplo, Cy3 ou Cy5). Ressuspender em Tris-EDTA (TE) a 50 ng / ul. NOTA: Proteja oligos da exposição à luz em todos os momentos. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Recolha de tarde-estágio Drosophila Oócitos <ol><li> Como <em&gt; oócitos de Drosophila com membranas íntegras vai ficar com plástico e vidro, pré-revestir o interior de um tubo de 5 ml e uma pipeta de Pasteur por prep ovócito com PTB. </li><li> Anestesiar todos os ~ 100 a 300 moscas yeasted com dióxido de carbono e adicionar a um misturador contendo ~ 100 ml de 1X tampão de Robb. Pulso três vezes (~ 1 segundo cada). Mantenha oócitos em Robb para &lt;20 min para evitar a activação. NOTA: Como alternativa, os oócitos podem ser mão-dissecados das fêmeas. A vantagem deste método é que ele exige menos fêmeas. No entanto, os cuidados devem ser tomadas para limitar a exposição ao dióxido de carbono para apenas alguns minutos para evitar erros associados à hipóxia 7. </li><li> Filtrar através de malha grande (~ 1.500 mm) em 250 ml copo para remover partes do corpo grandes. Se muitos abdomens intactas permanecer no material de malha, re-moagem usando adicional buffer de Robb e filtro novamente. Vamos resolver ~ 2 min, em seguida, aspirar off camada superior, removendo como muitos dos grandes partes do corpo quanto possível. </li><li> Filtro através de malha pequena (~ 300 uM) para uma proveta de 250 ml. Lavar ovócitos restantes fora do primeiro copo usando adicional de Robb e revestido Pasteur pipeta. Vamos settle ~ 3 min; oócitos vai resolver fora. Aspirar off todos, mas ~ 10 ml. </li><li> Despeje o máximo de 10 ml como se encaixam em revestido tubo de 5 ml. Vamos resolver, remover o líquido, e repita com o restante. Lavar ovócitos restantes fora do copo usando Pasteur pipeta adicional de Robb e revestido. Vamos resolver em 5 ml tubo para ~ 3-5 min. </li></ol> 3. Os tratamentos medicamentosos (Opcional) <ol><li> Revestimento de um segundo tubo de 5 ml com PTB para cada prep oócito. Adicionar solvente apropriado (controle) ou de drogas para 1 ml de Robb cada oócito para cada preparação (Tabela 2). </li><li> oócitos dividida em segunda revestido tubo de 5 ml. Vamos Settle, remover o líquido e adicionar 1 ml Robb das mais solventes em um tubo e 1 ml Robb de mais droga no segundo tubo. Nutar para a quantidade de tempo apropriado para o tratamento de drogas (Tabela 2). euet resolver. </li></ol> 4. Fixação <ol><li> Aspirar off todo o líquido e imediatamente adicionar 1 ml Fix. </li><li> Opção # 1: Formaldeído / fixação heptano (Tampão de Fixação mais 5% de formaldeído). <ol><li> Fixar para 2.5 min em um nutator. Adicionar 1 ml de heptano e vortex 1 min. Vamos settle ~ 1 min. </li><li> Retire todo o líquido e, em seguida adicionar 1 ml 1x PBS. Vortex 30 seg. Vamos settle ~ 1 min. </li><li> Retire todo o líquido e, em seguida, preencher tubo com 1x PBS. NOTA: Os oócitos podem ser utilizadas imediatamente ou mantidas no nutator durante várias horas à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Opção # 2: fixação de formaldeído / cacodilato (Fix Mix mais 8% formaldeído e cacodilato 100 mM). <ol><li> Correção para 6 min em um nutator. Vamos contentar 2 min. Remover o líquido e, em seguida, preencher tubo com 1x PBS. NOTA: Os oócitos podem ser utilizadas imediatamente ou mantidas no nutator durante várias horas à temperatura ambiente. </li></ol></li></ol> 5. Removendo membranas ( &quot;Rolling&quot;) <ol><li> Usando revestido pipeta de Pasteur, adicione ~ 500 a 1.000 oócitos para a parte fosco (jacto de areia) de uma lâmina de vidro. Remover todas as partes do corpo e materiais usando uma pinça estranhos. Não deixe oócitos secar; adicionar 1x PBS conforme necessário. </li><li> Coloque uma lamela em cima dos oócitos e gentilmente oócitos &quot;Roll&quot; até que todas as membranas são removidos (arrastando a borda da lamela entre os oócitos funciona melhor.) Verifique periodicamente o progresso sob o microscópio, adicionando mais 1x PBS, conforme necessário. Tome cuidado como muita pressão irá destruir os ovócitos. NOTA: Para imunofluorescência somente, continue com o Passo 6. Para peixes (com ou sem imunofluorescência), continue na Etapa 7. </li></ol> 6. Coloração de anticorpos de Drosophila Oócitos <ol><li> Extração e Bloqueio <ol><li> Lavar oócitos enroladas em um tubo cónico de 15 mL contendo ~ 15 mL de PBS / 1% de Triton X-100. oócitos nutar nesta solução por não menos do que 1,5 horas e não mais do que 2 h.Este passo permite a penetração do anticorpo. </li><li> Vamos oócitos resolver ~ 2 min. Remover o líquido, juntamente com o maior número de membranas quanto possível, em seguida, adicionar PBS / 0,05% de Triton X-100. NOTA: Membranas vai resolver mais lento do que oócitos laminados. </li><li> Deixe oócitos resolver ~ 2 min, em seguida, remover todos, mas ~ 1 ml de líquido. oócitos de transferência para se formou 1,5 tubo ml e remover o líquido remanescente. Adicionar 1 ml de TBP para o bloqueio e nutar durante 1 h. </li></ol></li><li> coloração de anticorpos <ol><li> Pré-absorção de anticorpos secundários contra embriões. NOTA: Este passo elimina a coloração de fundo a partir de interações de anticorpos não específicos com proteínas de Drosophila. <ol><li> Recolher e corrigir embriões de Drosophila (~ 25 ul) por típico procedimento 8. Armazenar em metanol a -20 ° C. </li><li> Remover o metanol a partir de embriões, adicionar 800 mL de metanol, com 200 ul de 1x PBS, e nutar durante 15 min. Retirar 500 ul de sobrenadante e substituir com 500 ul de PBS 1x. Então nutar para 15 min. Repita duas vezes (para um total de ~ 1 hr de lavagens), e depois terminar no PTB. NOTA: Os embriões podem ser utilizadas imediatamente ou mantidas no nutator por várias horas à temperatura ambiente. </li><li> Remover o líquido, encher com PTB para 200 mL por prep oócito, e adicionar anticorpos secundários fluorescente-etiquetados em diluições adequadas (tendo em mente que o volume final será de 300 ul;. Consulte o passo 7.4) nutar a 4 ° C durante a noite (preferível) ou à temperatura ambiente durante 3 a 4 horas. NOTA: Os anticorpos pré-absorvida irá ser utilizado no Passo 6.2.4. NOTA: Manter as amostras no escuro, tanto quanto possível, uma vez anticorpos fluorescentes foram adicionados. </li></ol></li><li> Remover o líquido a partir de oócitos, encher com PTB até 300 ml, e adicionar anticorpos primários nas diluições apropriadas. Nutar a 4 ° C durante a noite (preferível) ou à temperatura ambiente durante 3 a 4 horas. </li><li> Lavar oócitos quatro vezes durante 15 minutos cada um com 1 ml PTB. </li><li> Removerlíquido a partir de oócitos, adicionar 200 ul de sobrenadante a partir de embriões pré-absorvida (anticorpos secundários). Em seguida, preencha com PTB para 300 l. Nutar à temperatura ambiente durante 3 a 4 horas (preferivelmente) ou a 4 ° C durante a noite. </li><li> Lavar oócitos uma vez durante 15 min com 1 ml PTB, remover o líquido. Em seguida, adicione 0,5 mL Hoechst 33342 e 500 ul PTB e nutar para 7 min. </li><li> Lavar oócitos duas vezes durante 15 minutos cada um com 1 ml PTB. NOTA: Os oócitos pode ser montada numa lamela imediatamente ou pode ser armazenada na TBP a 4 ° C até estar pronto para a imagiologia. </li></ol></li></ol> 7. FISH (Continue a partir do passo 5 acima) <ol><li> Lavar oócitos enroladas em um tubo cônico de 15 ml contendo ~ 15 ml 2x SSCT. Vamos oócitos resolver ~ 2 min. Remova todos, mas ~ 0,5 ml de líquido, juntamente com o maior número de membranas quanto possível. NOTA: Membranas vai resolver mais lento do que oócitos laminados. </li><li> Transferência de oócitos para 0,5 tubo ml e remover o líquido remanescente. Sucessivamente adicionar e remover 500 mL20%, 40%, 50% e soluções de formamida, de nutação durante 10 minutos em cada solução. NOTA: Os oócitos vai resolver mais lento com maiores percentagens de formamida. </li><li> Remover o líquido, em seguida, adicionar solução de formamida a 500 ul de 50%, e nutar a 37 ° C durante 1 a 5 horas. NOTA: Longer incubações resultar em uma melhor penetração da sonda. </li><li> Remover o líquido, deixando para trás nada mais do que ~ 100 ul de oócitos, e adicionar 36 ul de solução de hibridação mais 2 ul de sonda (50 ng / mL) e 2 mL de água ou 2 mL de uma sonda 2 ND (Tabela 1). </li><li> Incubar a 91 ° C durante 3 min (apenas FISH) ou 80 ° C durante 20 min (FISH e de imunofluorescência), seguido por incubação num banho de água a 37 ° C durante a noite. NOTA: Estes passos podem ser efectuados num termociclador. </li><li> Não remover o líquido. Adicionar 500 ul de solução a 50% de formamida e nutar a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Vamos Settle, remover o líquido, adicione a solução de formamida 500 mL de 50%, umd nutar a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Vamos assentar, remover o líquido, adicionar solução de formamida a 500 ul de 20%, e nutar à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Execute três lavagens rápidas em 500 ul 2x SSCT (vamos Settle, remover, em seguida, adicione o líquido, inverter várias vezes, repetir.) Vamos Settle, remover o líquido, em seguida, adicionar 500 mL PTB e nutar durante 4 h. </li></ol> 8. Coloração de anticorpos após FISH <ol><li> Remover o líquido a partir de oócitos, encher com 300 uL de TBP, e adicionar anticorpo anti-tubulina α 10 ul conjugado com FITC. Alternativamente, outros anticorpos podem ser utilizados, seguindo o protocolo acima. Nutar à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> Lavar oócitos uma vez durante 15 min com 500 uL PTB, remover o líquido, em seguida, junta-se 0,5 ul de Hoechst 33342 e 500 ul PTB e nutar durante 7 min. </li><li> Lavar oócitos duas vezes durante 15 minutos cada um com 500 ul PTB. NOTA: Os oócitos pode ser montada numa lamela imediatamente ou pode ser armazenada na TBP a 4 ° C até pronto para serimagiologia. Mantenha oócitos no escuro, tanto quanto possível, uma vez anticorpos fluorescentes foram adicionados. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Repita Nome </td><td fo:width="1in"> Cromossoma </td><td> Seqüência Oligo * </td></tr><tr><td> 359 </td><td> X </td><td> GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC </td></tr><tr><td> AACAC </td><td> 2 </td><td> AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC </td></tr><tr><td> dodeca </td><td> 3 </td><td> CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT </td></tr><tr><td> 1.686 </td><td> 2 + 3 </td><td> AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG </td></tr><tr><td> AATAT </td><td> 4 (+ Y) </td><td> AATATAATATAATATAATATAATATAATAT </td></tr><tr><td colspan="3"> * 359 sequência de Eric Joyce, comunicação pessoal, outras sequências de Sullivan et al. 8 </td&gt; </tr></tbody></table> Tabela 1: sondas de peixe para repete centroméricas de Drosophila. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Droga </td><td> Solvente </td><td> da concentração </td><td> A concentração final </td><td> Tempo de tratamento </td><td> Efeito </td></tr><tr><td> colchicina </td><td> etanol </td><td> 125 mM </td><td> 150 uM </td><td> 10 min ou 30 min </td><td> desestabilizar não cinetocoro (10 min), 9 ou todos os microtúbulos (30 min) </td></tr><tr><td> paclitaxel </td><td> DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 10 uM </td><td> 10 min </td><td> estabilizar microtubules </td></tr><tr><td> Binucleine 2 </td><td> DMSO </td><td> 25 mM </td><td> 25 uM </td><td> 20 min </td><td> inibir Aurora B quinase 10 </td></tr></tbody></table> Tabela 2: O tratamento medicamentoso.

<ol><li>Bridges, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-disjunction+as+proof+of+the+chromosome+theory+of+heredity%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity.</a> Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).</li>
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<li>Zou, J., Hallen, M. A., Yankel, C. D., Endow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microtubule-destabilizing+kinesin+motor+regulates+spindle+length+and+anchoring+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A microtubule-destabilizing kinesin motor regulates spindle length and anchoring in oocytes.</a> J Cell Biol. 180 (3), 459-466 (2008).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Staging Drosophila Oócitos Embora um cariossomo alongada é muitas vezes visto em oócitos prometáfase, usando cariossomo forma de distinguir prometáfase a partir de oócitos metafase pode ser problemático. Durante prometáfase, o cariossomo começa como uma forma redonda, alonga, e, em seguida, se retrai para uma forma redonda como o oócito se aproxima da prisão metáfase. Isto significa que muitos oócitos prometáfase não tem uma cariossomo alongado. Além disso, se os oó...

O estudo da meiose às vezes é descrito como a "genética da genética". Isso ocorre porque as propriedades fundamentais da herança cromossômica e do sortimento independente são realizadas por meio da segregação dos cromossomos durante a produção dos gametas. Uma demonstração importante da teoria cromossômica da herança veio em 1916 do trabalho de Calvin Bridges em Drosophila melanogaster1. Este e outros estudos de genética clássica em Drosophila contribuíram muito para nossa compreensão da genética. O exame citológico de cromossomos meióticos em oócitos de Drosophila, no entanto, tem sido um desafio. Isso ocorre principalmente porque a imunofluorescência de oócitos de Drosophila em estágio avançado, quando o fuso se reúne e os cromossomos são orientados para segregação, é dificultada pela presença de membranas que tornam o oócito impenetrável aos anticorpos.
Apesar desse desafio, os oócitos de Drosophila continuam sendo um modelo atraente para o estudo do comportamento cromossômico e da montagem do fuso. Isso se deve às poderosas ferramentas genéticas disponíveis na Drosophila, mas também porque os oócitos param na metáfase I, quando os cromossomos são orientados e o fuso está totalmente formado. Isso facilita a coleta e o exame de um grande número de oócitos neste importante estágio da divisão celular. Além disso, um organismo modelo simples que é passível de manipulação genética para o estudo da segregação cromossômica de oócitos pode fornecer uma contribuição importante para nossa compreensão da saúde reprodutiva humana. Erros no número de cromossomos são a principal causa genética de aborto espontâneo e defeitos congênitos em humanos2. A maioria desses erros pode ser atribuída ao oócito e está correlacionada com o aumento da idade materna. A idade média das mães nos EUA tem aumentado, tornando isso uma grande preocupação de saúde pública.
Descrevemos aqui métodos para o exame citológico de oócitos de Drosophila, incluindo uma demonstração de como remover as membranas do oócito. Esses métodos são modificações de protocolos descritos pela primeira vez por Theurkauf e Hawley3, Zou et al.4, e Dernburg et al.5. Também incluímos métodos para o enriquecimento de diferentes estágios de oócitos, com base em um protocolo descrito pela primeira vez por Gilliland et al.6. Finalmente, adicionamos instruções para o tratamento medicamentoso de oócitos de Drosophila. Juntos, esses métodos permitem a investigação citológica da segregação cromossômica oocitária e montagem do fuso em Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Tubos cônicos de 15 ml</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>formaldeído a 16% Ted</td><td>Pella, Inc.</td><td>18505</td><td>PERIGOSO; uma vez aberto, descartar após um mês</td></tr><tr><td>Copos de 250 ml</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubos de 5 ml</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fermentos secos ativos</td><td>Vários</td><td></td><td>misturam com água para fazer uma pasta com a consistência de</td></tr><tr><td>anticorpo anti-alfa;-tubulina</td> de manteiga de amendoim conjugado ao <td>clone DM1A</td>Binucleína 2 do FITC <td>Sigma</td><td>F2168</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>B1186</td><td>Misturador PERIGOSO</td></tr><tr><td></td><td>Várias</td><td></td><td></td></tr><tr><td>albuminas de soro bovino</td> Cloreto de cálcio <td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Várias</td><td></td><td></td></tr><tr><td>colchicinas</td><td>Sigma</td><td>C-9754</td><td>LAMÍNULAS</td></tr><tr><td>PERIGOSAS</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>No. 1 1/2</td></tr><tr><td>sulfato de dextrano</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Várias</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pinças</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>5622</td><td>Dumont pinças de alta precisão grau estilo 5</td></tr><tr><td>formamida</td><td>Sigma</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>lâminas de vidro</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>glicose</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubos graduados de 1,5 ml</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>EM-5330</td><td>disponíveis em vários vendedores</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cloreto de magnésio</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Várias</td><td></td><td></td></tr><tr><td>malhas grandes (~ 1.500 &micro; m)</td> <td>VWR</td><td>AA43657-NK</td><td>variedade de formatos e outros fornecedores, malha pequena de 12 ou 14 malhas</td></tr><tr><td>(~300 &micro; m)</td> <td>Spectrum labs</td><td>146 424</td><td>variedade de formatos, e.g., 146 422 ou 146 486</td></tr><tr><td>nutator</td><td>Várias</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipetas de Pasteur</td><td>Acetato de potássio diverso</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido cacodílico</td><td>Sigma</td><td></td><td></td>C0125 PERIGOSO; alternativamente, o cacodilato de sódio pode ser substituído por</tr><tr><td></td><td></td> potássio <td></td><td></td></tr><tr><td> hidróxido Vários</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>acetato de sódio</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cloreto de sódio</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>citrato de sódio</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hidróxido de sódio</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sacarose</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>taxol (paclitaxel)</td><td>Sigma</td><td>T1912</td><td>PERIGOSO</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>PI-28314</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>PI-28320</td><td></td></tr><tr><td>vórtice</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

técnicas de imagem prometáfase e metaphase da meiose i em fixed<em&gt; drosophila</em&gt; oócitos

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

A segregação cromossômica em oócitos humanos é propensa a erros, resultando em aneuploidia, que é a principal causa genética de aborto espontâneo e defeitos congênitos. O estudo do comportamento cromossômico em oócitos de organismos modelo é muito promissor para descobrir a base molecular da suscetibilidade de oócitos humanos à aneuploidia. Drosophila melanogaster é passível de manipulação genética, com mais de 100 anos de pesquisa, comunidade e desenvolvimento de técnicas. A visualização do comportamento cromossômico e da montagem do fuso em oócitos de Drosophila tem desafios particulares, no entanto, devido principalmente à presença de membranas ao redor do oócito que são impenetráveis aos anticorpos. Descrevemos aqui protocolos para a coleta, preparação e imagem da montagem do fuso da meiose I e do comportamento cromossômico em oócitos de Drosophila, que permitem a dissecção molecular da segregação cromossômica neste importante organismo modelo.

Os métodos que descrevemos aqui resultará na coleta de oócitos em estágio final de Drosophila representam três fases da meiose (Figura 1). Os oócitos na profase distinguem-se pela presença do envelope nuclear, que é visível pela falta de sinal de tubulina na região em torno do cariossomo (Figura 1A). Prometáfase é o período após nuclear quebra envelope durante o qual os monta fuso. Durante prometáfase, o cariossomo assume uma forma distinta, tor...

Apresentamos protocolos para coleta, preparação e imagem de oócitos maduros de Drosophila. Esses métodos permitem a visualização do comportamento cromossômico e da montagem e função do fuso durante a meiose.

Técnicas de imagem Prometáfase e Metaphase da meiose I em Fixed<em&gt; Drosophila</em&gt; oócitos

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar oócitos de Drosophila para a análise citológica da montagem do fuso e da orientação dos cromossomos durante a meiose I. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da meiose, como a forma pela qual a bipolaridade do fuso é estabelecida e como os cromossomos se tornam biorientados na ausência de centríolos. A principal vantagem desta técnica é que as membranas dos oócitos, que impedem a penetração de anticorpos, são efetivamente removidas, permitindo a imunofluorescência. Para começar, recubra internamente um tubo de cinco milímetros e uma pipeta de pasteur com PTB para evitar que os oócitos adiram às superfícies.Adicione 100 mililitros do tampão ROB a um liquidificador e, em seguida, adicione de 100 a 300 moscas anestesiadas e pulse três vezes por um segundo. Filtre a suspensão resultante em um béquer de 250 mililitros através de uma malha grossa com poros de aproximadamente 1.500 micrômetros. Deixe o filtrado repousar por cerca de dois minutos e, então, aspire a camada superior, removendo o maior número possível de partes grandes do corpo.Filtre novamente a suspensão em um béquer de 250 mililitros, utilizando uma malha menor com tamanho de poro de 300 micrômetros. Enxágue o primeiro béquer usando tampão adicional na pipeta revestida para coletar os ovócitos remanescentes. Deixe a suspensão decantar por três minutos e, em seguida, aspire todo o volume, exceto os 10 mililitros inferiores.Despeje o máximo possível dos 10 mililitros no tubo revestido de cinco mililitros. Deixe a suspensão decantar por cerca de dois minutos e, em seguida, remova cuidadosamente o líquido. Adicione o restante dos 10 mililitros da suspensão e deixe a mistura decantar novamente antes de remover o líquido.Lave os ovócitos remanescentes para fora do béquer utilizando tampão adicional na pipeta revestida. Deixe a lavagem decantar no tubo de cinco mililitros por três a cinco minutos. Para fixar os ovários, aspire primeiro todo o líquido dos tecidos e adicione imediatamente um mililitro da Mistura de Fixação.Coloque os tecidos em um nutator por 2 minutos e meio. Em seguida, adicione um mililitro de heptano, vortexie o tubo por um minuto e, depois, deixe os ovócitos sedimentarem por mais um minuto. Remova todo o líquido do tecido sedimentado e, então, adicione um mililitro de PBS 1x.Vortex a tubo durante 30 segundos e, em seguida, deixe os ovócitos sedimentarem por um minuto. Depois disso, remova todo o líquido do tubo e preencha-o com cinco mililitros de PBS 1x. Usando a pipeta revestida, adicione aproximadamente 500 a 1.000 ovócitos a uma lâmina de vidro fosca.Remova quaisquer partes do corpo ou materiais estranhos usando pin&ccedil;as. Coloque uma lam&iacute;nula sobre o tecido e role suavemente os ov&oacute;citos at&eacute; que todas as membranas sejam removidas. Arrastar a borda da lam&iacute;nula sobre os ov&oacute;citos funciona bem.Verifique periodicamente o progresso da remoção da membrana ao microscópio. Pressão excessiva destruirá os ovócitos. A remoção mais eficaz da membrana do ovócito é obtida combinando a maior quantidade possível de movimento do ovócito com a menor quantidade possível de pressão.Use um toque leve e movimentos rápidos para arrastar a borda da lamínula sobre os ovócitos. Para iniciar a extração e o bloqueio, adicione 15 mililitros de PBS 1% Triton X-100 a um tubo de 50 mililitros. Enxágue os ovócitos enrolados neste tubo e agite em nutator por 1 1/2 a duas horas.Após deixar os ovócitos sedimentarem por dois minutos, remova o líquido junto com o maior número possível de membranas e adicione 50 mililitros de PBS 0,05% Triton X-100. Deixe os ovócitos sedimentarem por mais dois minutos e, em seguida, remova todo o líquido, exceto cerca de um mililitro. Transfira os ovócitos para um tubo graduado de 1,5 mililitro e remova o líquido restante.Adicione um mililitro de PTB para bloqueio e agite suavemente durante uma hora. Remova o líquido dos ovócitos e, em seguida, adicione 300 microlitros de PTB. Em seguida, adicione o anticorpo primário de interesse na diluição apropriada, tomando o cuidado de proteger as amostras tratadas com anticorpo fluorescente da luz.Incubar durante a noite a quatro graus Celsius. Lavar os ovócitos com um mililitro de PTB quatro vezes, durante 15 minutos cada. Remover o líquido e adicionar 200 microlitros de sobrenadante proveniente de embriões tratados com anticorpo secundário.Filtre até a marca de 300 microlitros com PTB e, em seguida, agite suavemente por três a quatro horas à temperatura ambiente. Lave os ovócitos uma vez por 15 minutos com um mililitro de PTB. Em seguida, remova o líquido e adicione 0,5 microlitro de Hoechst 33342 e 500 microlitros de PTB.Coloque para nutar por sete minutos. Use um mililitro de PTB para lavar os ovócitos duas vezes, por 15 minutos cada. As amostras podem agora ser montadas e analisadas imediatamente utilizando técnicas padrão de microscopia confocal, ou armazenadas em PTB a quatro graus Celsius até o momento do uso.Imagens de ovócitos em estágio avançado geradas usando a técnica demonstrada são apresentadas aqui, capturando três estágios diferentes da meiose. Os ovócitos em prófase são distinguidos pela presença da envoltória nuclear, que é visível devido à ausência de sinal de tubulina nas regiões ao redor do cariossomo. A alongação característica do cariossomo na prometáfase também foi observada, e os cromossomos IV são vistos separados da massa do cariossomo.A metáfase também foi capturada e o cariossoma é visto retratado em uma forma arredondada. Aqui, a imunomarcação com diferentes anticorpos destaca o fuso, os centrômeros e o fuso central em ovócitos fixados com formaldeído e heptano. Ovócitos tratados com a droga colchicina exibiram fenótipos não padrão com a eliminação da maioria dos microtúbulos não cinéticos, resultando em todos os microtúbulos em contato com o DNA no centrômero marcado como Phocyde.O tratamento com Paclitaxel resultou em óvulos com microtúbulos excessivos no citoplasma. Por fim, óvulos tratados com Binucleína 2 para inibir a quinase Aurora B apresentaram perda completa dos microtúbulos do fuso. Ao tentar realizar este procedimento, é importante lembrar-se de não se apressar durante a remoção da membrana do óvulo, pois o sucesso do protocolo depende desta etapa.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades, porque a remoção das membranas exige paciência e prática. Esta técnica é, portanto, melhor aprendida observando alguém realizá-la com sucesso. Uma vez dominada, a manipulação dos ovócitos pode ser realizada em cinco a dez minutos.Mas é possível levar até 30 minutos sem afetar a qualidade dos resultados. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar oócitos de Drosophila em estágio avançado para a obtenção de imagens da montagem do fuso biótico, da organização do fuso, dos movimentos cromossômicos e da bi-orientação cromossômica. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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