Técnicas de imagem Prometáfase e Metaphase da meiose I em Fixed Drosophila oócitos

O objetivo geral deste procedimento é preparar oócitos de Drosophila para o exame citológico da montagem do fuso e orientação cromossômica durante a meiose I. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da meiose, como como a bipolaridade do fuso é estabelecida e como os cromossomos se tornam bi-orientados na ausência de centrossomas. A principal vantagem dessa técnica é que as membranas do oócito que bloqueiam a penetração do anticorpo são efetivamente removidas, o que permite a imunofluorescência. Para começar, pré-revestir o interior de um tubo de cinco milímetros e pipetar de pastagem com PTB para evitar que os oócitos grudem nas superfícies.

Adicione 100 mililitros de tampão ROB a um liquidificador e, em seguida, adicione 100 a 300 moscas anestesiadas e pulse três vezes por um segundo. Filtrar a pasta resultante num copo de 250 mililitros através de uma malha grande com poros de cerca de 1 500 micrómetros. Deixe o filtrado repousar durante cerca de dois minutos e aspire depois a camada superior, removendo o maior número possível de partes grandes do corpo.

Filtrar novamente o chorume para um copo de 250 mililitros, através de uma malha mais pequena com poros de 300 micrómetros. Lavar o primeiro copo com tampão adicional na pipeta revestida para recolher os restantes ovócitos. Deixe a pasta repousar por três minutos e, em seguida, aspire tudo, exceto os 10 mililitros inferiores.

Despeje o máximo possível dos 10 mililitros no tubo revestido de cinco mililitros. Deixe a pasta repousar por cerca de dois minutos e, em seguida, remova cuidadosamente o líquido. Adicione o restante dos 10 mililitros de pasta e deixe a mistura repousar novamente antes de remover o líquido.

Lave os oócitos restantes do béquer usando tampão adicional na pipeta revestida. Deixe o enxágue repousar no tubo de cinco mililitros por três a cinco minutos. Para fixar os ovários, primeiro aspire todo o líquido dos tecidos e adicione imediatamente um mililitro de Fix Mix.

Coloque os lenços em um nutator por 2 minutos e meio. Em seguida, adicione um mililitro de heptano, faça um vórtice no tubo por um minuto e deixe os oócitos assentarem por mais um minuto. Remova todo o líquido do tecido sedimentado e adicione um mililitro de 1x PBS.

Vortex o tubo por 30 segundos e, em seguida, deixe os oócitos assentarem por um minuto. Depois disso, retire todo o líquido do tubo e encha-o com cinco mililitros de 1x PBS. Usando a pipeta revestida, adicione cerca de 500 a 1.000 oócitos a uma lâmina de vidro fosco.

Remova quaisquer partes ou materiais estranhos do corpo usando uma pinça. Coloque uma lamínula em cima do tecido e role suavemente os oócitos até que todas as membranas sejam removidas. Arrastar a borda da lamínula pelos oócitos funciona bem.

Verifique o progresso da remoção da membrana ao microscópio periodicamente. Muita pressão destruirá os oócitos. A remoção mais eficaz da membrana do oócito é alcançada combinando a quantidade máxima de movimento do oócito com a quantidade mínima de pressão.

Use um toque leve e movimentos rápidos para arrastar a borda da lamínula pelos oócitos. Para iniciar a extração e o bloqueio, adicione 15 mililitros de PBS 1%Triton X-100 a um tubo de 50 mililitros. Enxágue os oócitos enrolados neste tubo e nutate por 1 1/2 a duas horas.

Depois de permitir que os oócitos assentem por dois minutos, remova o líquido junto com o maior número possível de membranas e adicione 50 mililitros de PBS 0,05%Triton X-100. Deixe os oócitos repousarem por mais dois minutos e, em seguida, remova tudo, exceto cerca de um mililitro de líquido. Transfira os oócitos para um tubo graduado de 1,5 mililitro e remova o líquido restante.

Adicione um mililitro de PTB para bloqueio e nutato por uma hora. Retire o líquido dos oócitos e adicione 300 microlitros de PTB. Em seguida, adicione o anticorpo primário de interesse na diluição apropriada, tomando cuidado para proteger as amostras tratadas com anticorpo fluorescente da luz.

Nutute durante a noite a quatro graus Celsius. Lave os oócitos e um mililitro de PTB quatro vezes por 15 minutos cada. Remova o líquido e adicione 200 microlitros de sobrenadante dos embriões tratados com anticorpos secundários.

Filtre a marca de 300 microlitros com PTB e depois nutate por três a quatro horas em temperatura ambiente. Lave os oócitos uma vez por 15 minutos com um mililitro de PTB. Em seguida, remova o líquido e adicione 0,5 microlitros de Hoechst 33342 e 500 microlitros de PTB.

Defina para nutate por sete minutos. Use um mililitro de PTB para lavar os oócitos duas vezes por 15 minutos cada. As amostras agora podem ser montadas e visualizadas imediatamente usando técnicas de microscopia confocal padrão ou armazenadas em PTB a quatro graus Celsius até que sejam necessárias.

Imagens de oócitos em estágio avançado geradas usando a técnica demonstrada são mostradas aqui, capturando três estágios diferentes da meiose. Os oócitos em prófase se distinguem pela presença do envelope nuclear que é visível devido à falta de sinal da tubulina nas regiões ao redor do cariossomo. O alongamento distinto do cariossomo na prometáfase também foi observado, e os quartos cromossomos são vistos separados da massa do cariossomo.

A metáfase também foi capturada e o cariossomo é visto retraído em uma forma redonda. Aqui, a imunomarcação com diferentes anticorpos destaca o fuso, os centrômeros e o fuso central em oócitos fixados com formaldeído e heptano. Os oócitos tratados com a droga Colchicina apresentaram fenótipos não padronizados com a eliminação da maioria dos microtúbulos ou não cinéticos, resultando em todos os microtúbulos em contato com o DNA no centrômero marcado com Phocyde.

O tratamento com paclitaxel resultou em oócitos com microtúbulos excessivos no citoplasma. Finalmente, oócitos tratados com Binucleína 2 para inibir a Aurora B quinase, mostraram perda completa dos microtúbulos fusiformes. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não se apressar durante a remoção da membrana do oócito, pois o sucesso do protocolo depende desta etapa.

Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, porque a remoção das membranas requer paciência e prática. Portanto, essa técnica é melhor aprendida observando alguém executá-la com sucesso. Uma vez dominado, o rolamento dos oócitos pode ser feito em cinco a 10 minutos.

Mas é possível levar até 30 minutos sem afetar a qualidade dos resultados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar oócitos de Drosophila em estágio avançado para imagens de montagem do fuso biótico, organização do fuso, movimentos cromossômicos e biorientação cromossômica. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.