Name: Remoção de Drosophila Tecido muscular larval Filetes para Análise de imunofluorescência de neurônios sensoriais e células epidérmicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Aprenda a remover tecido muscular de larvas de Drosophila para análise de imunofluorescência de neurônios sensoriais e células epidérmicas. Este método melhora a visualização proteica e a relação sinal-ruído.

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Agradecemos Gary Laevsky de votos discussões sobre microscopia. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01GM061107 e R01GM067758 para ERG

Nota: O procedimento para a remoção muscular (Figura 1) é uma modificação dos métodos anteriormente descritos para a preparação de filetes de larvas. As etapas que precedem e seguem a remoção do músculo são descritas de forma breve e o leitor é remetido ao trabalho anterior 10, 11 para descrições mais detalhadas. 1. Dissecar Larva em Saline Fria <ol><li> Prepare uma diluição de trabalho de frio solução salina HL3.1 15 ou Ca 2 + livre frio HL3.1 salina 11 (Tabela 1). Coloque a larva em um prato de elastómero de silicone com uma solução salina fria apenas o suficiente para cobrir a parte inferior do prato. NOTA: Ver discussão sobre a escolha de uma solução salina. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1x HL3.1 salina (pH 7,2) </td></tr><tr><td> 5 mM de HEPES </td></tr><tr><td> NaCl 70 mM </td></tr><tr&gt; <td> 5 mM de KCl </td></tr><tr><td> 1,5 mM de CaCl2 (omitir de Ca2 + salina -livre) </td></tr><tr><td> 4 mM de MgCl2 </td></tr><tr><td> 10 mM de NaHCO3 </td></tr><tr><td> 5 mM de trealose </td></tr><tr><td> sacarose 115 mM </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> imita Composição de insetos hemolinfa: Nota </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Composição de Cold Saline. <ol start="2"><li> Posicionar a larva com o lado ventral para cima. A superfície ventral da larva pode ser identificada pelos cintos abdominais e dentical lado dorsal por os tubos traqueais larvais primárias que funcionam no sentido antero-posterior. Estique a larva no sentido ântero-posterior e fixar a cabeça ea cauda a umelastômero de silicone dissecar prato utilizando os pinos de insetos. Use tesouras de dissecação fino para cortar ao longo da linha média ventral, começando numa extremidade e progredindo no sentido da outra. NOTA: Esta orientação preserva o cluster dorsal comumente estudada da neurônios. </li><li> Após a larva é cortado, fixar os quatro cantos para o prato de dissecação como se abrir um livro. Use uma pinça para agarrar e remover os órgãos internos incluindo o sistema nervoso central, do intestino, traqueia e. Ajuste os pinos de insetos para que o filé é tensa, mas não maximamente esticado. NOTA: Os músculos são ancoradas à parede do corpo em limites segmentares. Embora músculos cobrir a maior parte da parede do corpo, que estão ausentes numa região estreita perto da linha média dorsal. </li></ol> Remoção 2. Muscle <ol><li> Localizar a linha média dorsal da larva, onde o tecido muscular está ausente. A posição de uma única pinça pino de tal forma que ele pode ser inserido por baixo do tecido muscular na orientação mais plana possível. </li><li> Começando àsa linha média dorsal, perto do limite anterior do segmento, deslize cuidadosamente o pino de uma pinça entre o músculo e da epiderme, tendo o cuidado para minimizar o contacto entre a pinça e epiderme. </li><li> Puxar as pinças para cima para quebrar a fixação do músculo da parede do corpo em um ponto de ancoragem. Repetir este processo para o hemi-segmento (s) restante de interesse. NOTA: Este protocolo otimiza preservação da posterior de cada campo dendrite da neurônio. Para preservar a parte anterior do campo dendrítico, que é melhor para inserir o pino de uma pinça na extremidade posterior de cada segmento. </li><li> Reajustar os pinos de insetos de modo a que o filé larval é maximamente se estendiam em todas as direções. </li><li> Corrigir o filé enquanto ele ainda está preso ao prato de dissecação usando frio, preparados na hora formaldeído 4% em PBS durante 25 min. </li><li> Lavar 5 vezes em PBS. </li><li> Use uma pinça para retirar cuidadosamente o tecido muscular dos restantes pontos de ancoragem, tendo o cuidado para minimizar Contact com a epiderme. </li><li> Soltar e remover o filete do prato de dissecação para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Executar todas as lavar, bloqueio e passos imunofluorescência posteriores, como descrito anteriormente 11. </li></ol> 3. Monte o larval Fillet <ol><li> Primeiro retire a cabeça ea cauda usando tesouras de dissecação finas, a fim de fazer a amostra o mais plano possível. Montar o filete sobre uma lamela em antifade montagem com a superfície interior do filete de frente para a lamela. </li><li> Coloque uma lâmina de microscópio sobre a lamela e pressione suavemente para dispersar o meio de montagem. Virar a lâmina de microscópio mais e selar a lamela na lâmina usando unha polonês. As lâminas podem ser armazenadas a -20 ° C durante pelo menos um mês. </li></ol>

<ol><li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+out%3A+mechanisms+of+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li>
<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+establish+dendrite-substrate+relationships+that+promote+dendritic+self-avoidance+and+patterning+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).</li>
<li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+regulate+repulsion-mediated+dendritic+patterning+of+Drosophila+sensory+neurons+by+restricting+dendrites+in+a+2D+space%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space.</a> Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).</li>
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<li>Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+bantam+regulates+a+developmental+transition+in+epithelial+cells+that+restricts+sensory+dendrite+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth.</a> Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).</li>
<li>Meltzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermis-derived+Semaphorin+promotes+dendrite+self-avoidance+by+regulating+dendrite-substrate+adhesion+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).</li>
<li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cells+are+the+primary+phagocytes+in+the+fragmentation+and+clearance+of+degenerating+dendrites+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila.</a> Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).</li>
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<li>Karim, M. R., Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+analysis+of+Drosophila+larval+peripheral+sensory+neuron+dendrites+and+axons+using+genetic+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics.</a> J Vis Exp. (57), e3111(2011).</li>
<li>Gustafsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+flow+quantified+beyond+the+diffraction+limit+by+spatiotemporal+image+correlation+of+structured+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data.</a> Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).</li>
<li>Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sound+response+mediated+by+the+TRP+channels+NOMPC%2C+NANCHUNG%2C+and+INACTIVE+in+chordotonal+organs+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae.</a> PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
<li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Aqui é descrito um protocolo para a remoção manual de tecido muscular de Drosophila filetes larval. Este protocolo modifica previamente descrito técnicas de dissecação larvais 10,11. Depois que a larva é dissecado em um prato de elastómero de silicone, a linha média dorsal está localizado. Um único pino de pinça, na sua orientação mais plana possível, é cuidadosamente inserida entre o tecido muscular e da epiderme, perto da linha média dorsal. As pinças são delicadamente puxado para cima para o tecid...

Neurónios Drosophila larval arborização dendrítica (DA) fornecer um modelo válido para o estudo do desenvolvimento neuronal, devido à sua receptividade para a manipulação genética e a facilidade com que eles podem ser visualizados. Esses neurônios sensoriais têm sido fundamentais para a identificação de inúmeros caminhos que controlam dendrite morfogênese 1-3. Quatro classes de da neurônios (Classe I - IV) inervam a epiderme larval. Estes neurônios situar-se entre a membrana basal da epiderme e, com as suas dendrites formando matrizes bidimensionais largamente 4,5. Das quatro classes, classe IV da neurônios têm os mandris mais altamente ramificada e, como neurônios sensoriais dos outros animais, a elaboração desses mandris exige fatores intrínsecos, bem como sugestões de tecidos vizinhos, em particular a epiderme, para o seu desenvolvimento 6-9 . Estudos para determinar como tal neuronal e fato extra-neuronalRUP controlar benefício morfogénese dendrite de a capacidade de detectar a expressão de proteínas in situ por imunofluorescência. A cutícula externa da larva é impenetrável para os anticorpos, mas este impedimento é facilmente superada pela preparação de filetes de larvas através de métodos bem estabelecidos de dissecação 10,11. No entanto, o tecido do músculo da parede do corpo que se encontra logo interior para a membrana basal apresenta vários desafios para visualização dos neurónios de da e as células epidérmicas. Primeiro, o tecido muscular, que a maioria das linhas de parede do corpo, obscurece grandemente sinais fluorescentes que emanam a partir de tecido neuronal ou epidérmica. Isto reduz substancialmente a relação sinal-ruído na amostra. Em segundo lugar, muitas proteínas relevantes pode ser expresso em tecido muscular, assim como nos neurónios ou epiderme. Este sinal de fluorescência derivadas de músculo é provável que mais obscura a detecção de um sinal de fluorescência a partir do neurónio ou epiderme. Finalmente, os avanços nas tecnologias de microscopia semw autorização de imagem de amostras com resolução sub-difração e pode ser especialmente útil para discernir a localização de proteínas que são expressas em neurônios e em torno de células epidérmicas 12,13. No entanto, a imagem latente através de benefícios de microscopia de super-resolução de uma forte relação sinal-ruído e proximidade da amostra com a lamela. Além de reduzir a relação sinal-ruído, as distâncias da parede do corpo do músculo larval da neurônios da lamela, limitando assim a resolução da imagem melhorada que pode ser conseguida com métodos de microscopia de super-resolução. Além desafios para análise de imunofluorescência, tecido muscular apresenta uma barreira para gravação electrofisiológico de neurónios sensoriais na parede do corpo larval. Portanto, a sua remoção beneficia manipulação neurofisiológica de neurônios sensoriais 14. Aqui, um método para a remoção manual de Drosophila tecido muscular larval é descrito. Nós demonstramos que nosso protocolo pErmits imagem imunofluorescência de proteínas que são de outra forma obscurecido por tecido muscular, melhora a relação sinal-ruído para a visualização de classe IV da neurônios, e permite o uso de microscopia de super-resolução para melhor discriminar relações espaciais de proteínas e estruturas celulares no da neurônios e a epiderme.

<table><tbody><tr><td>Pinça Dumont #5</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>72701-D</td><td></td></tr><tr><td>Micro Tesoura, 8 cm, reta, lâminas de 5 mm, pontas de 0,1 mm</td> Kit de elastômero de silicone Sylgard 184 da <td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>para placas de dissecação</td></tr><tr><td>Pinos de insetos Austerlitz, 0,1 mm</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz Fostec 8375</td><td>Artisan Technology Group</td><td>62792-4</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifade mount</td><td>medium Vector</td><td>Laboratories H-1000</td><td>para microscopia confocal</td></tr><tr><td>Prolong Diamond antifade mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36970</td><td>para microscopia de iluminação estruturada</td></tr><tr><td>Micro vidro de cobertura, 22 x 22 mm, nº 1,5</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio Superfrost Plus, 25 x 75 x 1,0 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anticoracle de camundongo</td><td>Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma</td><td>C615.16</td><td>sobrenadante, diluído 1:50</td></tr><tr><td>Anticorpo grande de camundongo anticorpo grande</td><td>Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma</td><td>4F3</td><td>sobrenadante, diluído 1:50</td></tr><tr><td>Coelho anti-dsRed anticorpo</td><td>Clontech</td><td>632496</td><td>diluir 1:1.000</td></tr><tr><td>anticorpo anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 568 conjugado</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>diluído 1:1.000</td></tr><tr><td>anticorpo anti-camundongo de cabra, Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>diluir 1:500</td></tr></tbody></table>

remoção de<em&gt; drosophila</em&gt; tecido muscular larval filetes para análise de imunofluorescência de neurônios sensoriais e células epidérmicas

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Neurônios Drosophila larval arborização dendrítica (DA) é um modelo popular para a investigação de mecanismos de morfogênese neuronal. Da neurónios desenvolver em comunicação com as células epidérmicas que inervam e, portanto, os seus benefícios de análise de visualização em in situ de ambas as proteínas neuronalmente e epidermicamente expressas por imunofluorescência. Os métodos tradicionais de preparação de filetes de larvas para experiências de imunofluorescência deixar intacto o tecido muscular que cobre a maior parte da parede do corpo, apresentando vários desafios à imagem latente proteínas neuronais e epidérmicas. Descrevemos aqui um método para a remoção de tecido muscular de Drosophila filetes larval. Este protocolo permite imagiologia de proteínas que são de outra forma obscurecido por tecido muscular, melhora a relação sinal-ruído, e facilita o uso de microscopia de super-resolução para estudar da Desenvolvimento neurônio.

Nós demonstrar a utilidade do procedimento de remoção do músculo para melhorar a relação sinal-ruído em experiências de imunofluorescência para co-visualizar as proteínas de junções septadas Coracle (Cora) e discos de grande (GMD) em conjunto com classe IV da neurônios marcados com o marcador de membrana CD4- tdTomato. Cora foi previamente usada para identificar trechos onde a Dinamarca dendrites neuronais são delimitados por células epidérmicas e é um dos mu...

Estudos da morfogênese neuronal usando Drosophila arborização dendrítica larval (da) neurônios beneficiar na visualização situ de proteínas neuronais e epidérmicas por imunofluorescência. Descreve-se um processo que melhora a análise de imunofluorescência de Da neurónios e células epidérmicas vizinhas através da remoção de tecido do músculo da parede do corpo larval.

Remoção de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecido muscular larval Filetes para Análise de imunofluorescência de neurônios sensoriais e células epidérmicas

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

O objetivo geral deste procedimento é remover o tecido muscular de uma larva de drosófila para preparação à análise por imunofluorescência da arborização dendrítica larval ou dos neurônios da e do tecido epidérmico. Hoje, vamos demonstrar um método que melhora a visualização de fatores neuronais e extraneuronais envolvidos na morfogênese dendrítica. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a obtenção de imagens por imunofluorescência de proteínas que, de outra forma, seriam obscurecidas pelo tecido muscular, melhora a relação sinal-ruído e possibilita o uso de microscopia de super-resolução.Para começar, adicione salina fria suficiente a um recipiente de elastômero de silicone para cobrir a superfície inferior. Adicione a larva objeto ao recipiente e coloque-a sob o microscópio estereoscópico. Certifique-se de posicionar corretamente a luz.Posicione a larva com o lado ventral voltado para cima, o que pode ser identificado pelas faixas de cerdas abdominais. Estique a larva na direção anterior-posterior e, utilizando alfinetes para insetos, fixe a cabeça e a cauda no fundo do recipiente. Com um par de tesouras finas de dissecação, corte ao longo da linha média ventral da larva de uma extremidade à outra.Espalhe a larva aberta e fixe o tecido da cutícula nos quatro cantos para que fique plano. Usando pinças, remova os órgãos internos, incluindo o SNC, o intestino e a traqueia. Ajuste os alfinetes de inseto para que o filé fique esticado, mas não totalmente alongado.Localize a linha média dorsal da larva, onde o tecido muscular está ausente, e então posicione uma ponta da pinça no interior desse limite. Deslize a ponta entre o músculo e a epiderme, tomando cuidado para minimizar o contato com a epiderme. Para minimizar danos à epiderme, realize a dissecação com pontas o mais achatadas possível e tente realizar a dissecação em salina contendo cálcio. Isso pode ajudar a criar espaço entre o músculo e a epiderme.Em seguida, puxe a pinça para cima para romper a fixação do músculo na parede corporal em um ponto de ancoragem. Repita este processo para os demais segmentos musculares de interesse. Reajuste os alfinetes no inseto para esticar ao máximo os filés larvais em todas as direções.Para fixar o filete, primeiro remova a solução salina e, em seguida, adicione formaldeído a 4% recém-preparado e frio em PBS, suficiente para cobrir o fundo do recipiente. Incube em temperatura ambiente por 25 minutos. Lave o filete cinco vezes em PBS para remover o excesso de formaldeído.Em seguida, use uma pinça para remover cuidadosamente o tecido muscular dos pontos de fixação restantes. Novamente, minimizando o contato com a epiderme. Por fim, retire os alfinetes do filete e remova-o do prato de dissecação.Coloque-o em um tubo microcentrífugo limpo de 1,5 mililitro. As etapas subsequentes de lavagem, bloqueio e imunomarcação devem ser realizadas neste tubo. Para montar o fragmento para análise microscópica, remova a amostra do tubo microcentrífugo e posicione-a com a superfície interna voltada para baixo sobre uma lamínula, em uma gota de PBS.Corte a cabeça e a cauda. Em seguida, remova o PBS absorvendo-o com um lenço laboratorial. Adicione uma gota de meio de montagem antidesbotamento.Coloque uma lâmina de microscópio sobre a lamínula e, em seguida, pressione suavemente com um lenço de laboratório para espalhar o meio de montagem. Vire o conjunto e aplique esmalte incolor em cada borda para selar a lamínula. Essas imagens de microscopia confocal mostram experimentos de imunofluorescência para visualizar a proteína de junção septada, Coracle ou Cora, e os neurônios da.Aqui, imagens de tecidos com músculo removido e com músculo intacto foram obtidas sob as mesmas condições de potência do laser. No tecido com músculo intacto, a potência do laser foi aumentada para compensar a interferência muscular e produzir uma imagem comparável. Nas imagens obtidas de filés com músculo removido, a cora pôde ser claramente detectada nas fronteiras das células epidérmicas em trajetos intermitentes ao longo dos dendritos dos neurônios da classe quatro.E delimitando o neurônio, o soma. Em contraste, a localização de cora nesses domínios era dificilmente detectável em amostras musculares. Aqui, cora foi amplamente visualizada no músculo, traqueia e junções neuromusculares, e a fluorescência desses tecidos obscureceu a maior parte da cora epidérmica.As amostras também foram visualizadas usando microscopia de iluminação estruturada 3D para determinar se a remoção do músculo melhorava a visualização em maior resolução. Novamente, as amostras com músculo intacto exigiram visualização com aumento de potência e tempo de exposição para compensar a interferência muscular. A resolução da imagem pareceu mais nítida nas amostras sem músculo, foram observados menos artefatos e a marcação de cora nos trajetos dos dendritos foi mais facilmente resolvida.As membranas dendríticas também poderiam ser medidas em 114 nanômetros na condição de músculo desativado. Enquanto isso, elas parecem ter 272 nanômetros de largura em filetes de músculo ativado. Durante a realização deste procedimento, é importante limitar o número de larvas dissecadas antes da fixação, de modo que o tempo decorrido não ultrapasse 25 minutos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como remover o tecido muscular de uma larva de drosófila. Este protocolo auxiliará na análise de imunofluorescência de neurônios sensoriais larvais e nas células epidérmicas que eles inervam. Obrigado por assistir e boa sorte em seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Drosophila larval Dissection MNJ

Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

Este vídeo descreve como preparar filés larvais usados para visualizar neurônios de arborização dendrítica sensorial (da) e suas células epidérmicas associadas. O protocolo apresentado mostra em detalhes como remover o tecido muscular da parede do corpo, preservando a morfologia das células, o que melhora a imunocoloração e a visualização dos neurônios e células epidérmicas obscurecidas.

Preparação de filé larval: um método para visualizar neurônios sensoriais intactos e células epidérmicas associadas

Os músculos de vôo da Drosophila são usados como um sistema modelo para o desenvolvimento e fisiologia muscular. Este vídeo descreve a musculatura de voo de adultos e destaca um protocolo para dissecar o desenvolvimento de músculos de voo indireto que são adequados para o sequenciamento de RNA de pupas.

drosófila Dissecção do músculo de voo indireto (IFM) da pupa tardia: um método para coleta de tecido de alto rendimento

Neste vídeo, as fibras nervosas das larvas de Drosophila são imersas em corante FM, que se liga aos lipídios da membrana celular. O microeletrodo de sucção e os pulsos elétricos estimulam o processo de endocitose, incorporando o corante FM em vesículas endocíticas recém-formadas. Este método, que visualiza estágios pré-sinápticos de neurotransmissão, é útil para estudar a função sináptica e a liberação de neurotransmissores.

Carga e descarga de corante FM mediada por microeletrodo em células nervosas de larvas de Drosophila

A imunocoloração é uma técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células e proteínas dentro dos tecidos. Ao utilizar a sonicação, o protocolo descrito aqui alivia a necessidade de dissecar tecidos de Drosophila melanogaster de embriões e larvas em estágio avançado antes da imunocoloração. Fornecemos uma metodologia eficiente para a imunocoloração de larvas de montagem inteira fixadas em formaldeído.

Facilitou-Sonication Imunofluorescência Coloração de Late-estágio embrionário e larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos<em&gt; In Situ</em

As estruturas adultas de Drosophila são derivadas de estruturas semelhantes a sacos chamadas discos imaginais. A análise desses discos fornece informações sobre muitos processos de desenvolvimento, incluindo determinação de tecidos, estabelecimento de limites de compartimentos, proliferação celular, especificação do destino celular e polaridade celular planar. Este protocolo é usado para preparar discos imaginais para microscopia de luz / fluorescente.

Dissecção e Imunocoloração do Imaginário discos de Drosophila melanogaster

O músculo de vôo de Drosophila é um modelo poderoso para estudar a regulação transcricional, splicing alternativo, metabolismo e mecanobiologia. Nós apresentamos um protocolo para a dissecção do músculo fluorescente-etiquetado do vôo das pupas vivos para gerar amostras altamente enriquecidas ideais para o proteômica e profundamente-arranjar em seqüência. Essas amostras podem oferecer importantes insights mecanísticos em diversos aspectos do desenvolvimento muscular.

Dissecção de músculos de vôo de Drosophila melanogaster para abordagens Omics

Este relatório fornece um novo procedimento de preparação de amostras para visualizar junções neuromusculares em larvas de Drosophila . Este método é mais eficaz na prevenção do enrolamento das amostras em comparação com o método tradicional e é particularmente útil para a análise ultraestrutural da junção neuromuscular de Drosophila .

Otimizando o processo de preparação de amostras para microscopia eletrônica de transmissão de junções neuromusculares em larvas de Drosophila

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para visualizar as redes de microtúbulos nas junções neuromusculares e células musculares. Combinado com as poderosas ferramentas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita muito a triagem genética e a análise da dinâmica de microtúbulos para o papel das proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso.

Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

Drosophila é um modelo poderoso para entender os mecanismos fundamentais da miogênese. Este protocolo para a dissecção e preparação de hemissecções de tórax permite a análise microscópica do músculo de voo indireto dos estágios pupal e adulto. Este protocolo permite imagens confocais da morfologia celular, localização de proteínas, estrutura muscular e vários outros aspectos da miogênese.

Dissecção de músculos de voo indireto de Drosophila melanogaster para abordagens de microscopia

Aprenda a remover tecido muscular de larvas de Drosophila para análise de imunofluorescência de neurônios sensoriais e células epidérmicas. Este método melhora a visualização proteica e a relação sinal-ruído.

Remoção de Drosophila Tecido muscular larval Filetes para Análise de imunofluorescência de neurônios sensoriais e células epidérmicas (Vídeo) | JoVE Journal

Remoção de

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