Name: Remoção de Drosophila Tecido muscular larval Filetes para Análise de imunofluorescência de neurônios sensoriais e células epidérmicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Aprenda a remover tecido muscular de larvas de Drosophila para análise de imunofluorescência de neurônios sensoriais e células epidérmicas. Este método melhora a visualização proteica e a relação sinal-ruído.

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Agradecemos Gary Laevsky de votos discussões sobre microscopia. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01GM061107 e R01GM067758 para ERG

Nota: O procedimento para a remoção muscular (Figura 1) é uma modificação dos métodos anteriormente descritos para a preparação de filetes de larvas. As etapas que precedem e seguem a remoção do músculo são descritas de forma breve e o leitor é remetido ao trabalho anterior 10, 11 para descrições mais detalhadas. 1. Dissecar Larva em Saline Fria <ol><li> Prepare uma diluição de trabalho de frio solução salina HL3.1 15 ou Ca 2 + livre frio HL3.1 salina 11 (Tabela 1). Coloque a larva em um prato de elastómero de silicone com uma solução salina fria apenas o suficiente para cobrir a parte inferior do prato. NOTA: Ver discussão sobre a escolha de uma solução salina. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1x HL3.1 salina (pH 7,2) </td></tr><tr><td> 5 mM de HEPES </td></tr><tr><td> NaCl 70 mM </td></tr><tr&gt; <td> 5 mM de KCl </td></tr><tr><td> 1,5 mM de CaCl2 (omitir de Ca2 + salina -livre) </td></tr><tr><td> 4 mM de MgCl2 </td></tr><tr><td> 10 mM de NaHCO3 </td></tr><tr><td> 5 mM de trealose </td></tr><tr><td> sacarose 115 mM </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> imita Composição de insetos hemolinfa: Nota </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Composição de Cold Saline. <ol start="2"><li> Posicionar a larva com o lado ventral para cima. A superfície ventral da larva pode ser identificada pelos cintos abdominais e dentical lado dorsal por os tubos traqueais larvais primárias que funcionam no sentido antero-posterior. Estique a larva no sentido ântero-posterior e fixar a cabeça ea cauda a umelastômero de silicone dissecar prato utilizando os pinos de insetos. Use tesouras de dissecação fino para cortar ao longo da linha média ventral, começando numa extremidade e progredindo no sentido da outra. NOTA: Esta orientação preserva o cluster dorsal comumente estudada da neurônios. </li><li> Após a larva é cortado, fixar os quatro cantos para o prato de dissecação como se abrir um livro. Use uma pinça para agarrar e remover os órgãos internos incluindo o sistema nervoso central, do intestino, traqueia e. Ajuste os pinos de insetos para que o filé é tensa, mas não maximamente esticado. NOTA: Os músculos são ancoradas à parede do corpo em limites segmentares. Embora músculos cobrir a maior parte da parede do corpo, que estão ausentes numa região estreita perto da linha média dorsal. </li></ol> Remoção 2. Muscle <ol><li> Localizar a linha média dorsal da larva, onde o tecido muscular está ausente. A posição de uma única pinça pino de tal forma que ele pode ser inserido por baixo do tecido muscular na orientação mais plana possível. </li><li> Começando àsa linha média dorsal, perto do limite anterior do segmento, deslize cuidadosamente o pino de uma pinça entre o músculo e da epiderme, tendo o cuidado para minimizar o contacto entre a pinça e epiderme. </li><li> Puxar as pinças para cima para quebrar a fixação do músculo da parede do corpo em um ponto de ancoragem. Repetir este processo para o hemi-segmento (s) restante de interesse. NOTA: Este protocolo otimiza preservação da posterior de cada campo dendrite da neurônio. Para preservar a parte anterior do campo dendrítico, que é melhor para inserir o pino de uma pinça na extremidade posterior de cada segmento. </li><li> Reajustar os pinos de insetos de modo a que o filé larval é maximamente se estendiam em todas as direções. </li><li> Corrigir o filé enquanto ele ainda está preso ao prato de dissecação usando frio, preparados na hora formaldeído 4% em PBS durante 25 min. </li><li> Lavar 5 vezes em PBS. </li><li> Use uma pinça para retirar cuidadosamente o tecido muscular dos restantes pontos de ancoragem, tendo o cuidado para minimizar Contact com a epiderme. </li><li> Soltar e remover o filete do prato de dissecação para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Executar todas as lavar, bloqueio e passos imunofluorescência posteriores, como descrito anteriormente 11. </li></ol> 3. Monte o larval Fillet <ol><li> Primeiro retire a cabeça ea cauda usando tesouras de dissecação finas, a fim de fazer a amostra o mais plano possível. Montar o filete sobre uma lamela em antifade montagem com a superfície interior do filete de frente para a lamela. </li><li> Coloque uma lâmina de microscópio sobre a lamela e pressione suavemente para dispersar o meio de montagem. Virar a lâmina de microscópio mais e selar a lamela na lâmina usando unha polonês. As lâminas podem ser armazenadas a -20 ° C durante pelo menos um mês. </li></ol>

<ol><li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+out%3A+mechanisms+of+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li>
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<li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cells+are+the+primary+phagocytes+in+the+fragmentation+and+clearance+of+degenerating+dendrites+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila.</a> Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).</li>
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<li>Karim, M. R., Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+analysis+of+Drosophila+larval+peripheral+sensory+neuron+dendrites+and+axons+using+genetic+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics.</a> J Vis Exp. (57), e3111(2011).</li>
<li>Gustafsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+flow+quantified+beyond+the+diffraction+limit+by+spatiotemporal+image+correlation+of+structured+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data.</a> Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).</li>
<li>Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sound+response+mediated+by+the+TRP+channels+NOMPC%2C+NANCHUNG%2C+and+INACTIVE+in+chordotonal+organs+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae.</a> PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
<li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Aqui é descrito um protocolo para a remoção manual de tecido muscular de Drosophila filetes larval. Este protocolo modifica previamente descrito técnicas de dissecação larvais 10,11. Depois que a larva é dissecado em um prato de elastómero de silicone, a linha média dorsal está localizado. Um único pino de pinça, na sua orientação mais plana possível, é cuidadosamente inserida entre o tecido muscular e da epiderme, perto da linha média dorsal. As pinças são delicadamente puxado para cima para o tecid...

Neurónios Drosophila larval arborização dendrítica (DA) fornecer um modelo válido para o estudo do desenvolvimento neuronal, devido à sua receptividade para a manipulação genética e a facilidade com que eles podem ser visualizados. Esses neurônios sensoriais têm sido fundamentais para a identificação de inúmeros caminhos que controlam dendrite morfogênese 1-3. Quatro classes de da neurônios (Classe I - IV) inervam a epiderme larval. Estes neurônios situar-se entre a membrana basal da epiderme e, com as suas dendrites formando matrizes bidimensionais largamente 4,5. Das quatro classes, classe IV da neurônios têm os mandris mais altamente ramificada e, como neurônios sensoriais dos outros animais, a elaboração desses mandris exige fatores intrínsecos, bem como sugestões de tecidos vizinhos, em particular a epiderme, para o seu desenvolvimento 6-9 . Estudos para determinar como tal neuronal e fato extra-neuronalRUP controlar benefício morfogénese dendrite de a capacidade de detectar a expressão de proteínas in situ por imunofluorescência. A cutícula externa da larva é impenetrável para os anticorpos, mas este impedimento é facilmente superada pela preparação de filetes de larvas através de métodos bem estabelecidos de dissecação 10,11. No entanto, o tecido do músculo da parede do corpo que se encontra logo interior para a membrana basal apresenta vários desafios para visualização dos neurónios de da e as células epidérmicas. Primeiro, o tecido muscular, que a maioria das linhas de parede do corpo, obscurece grandemente sinais fluorescentes que emanam a partir de tecido neuronal ou epidérmica. Isto reduz substancialmente a relação sinal-ruído na amostra. Em segundo lugar, muitas proteínas relevantes pode ser expresso em tecido muscular, assim como nos neurónios ou epiderme. Este sinal de fluorescência derivadas de músculo é provável que mais obscura a detecção de um sinal de fluorescência a partir do neurónio ou epiderme. Finalmente, os avanços nas tecnologias de microscopia semw autorização de imagem de amostras com resolução sub-difração e pode ser especialmente útil para discernir a localização de proteínas que são expressas em neurônios e em torno de células epidérmicas 12,13. No entanto, a imagem latente através de benefícios de microscopia de super-resolução de uma forte relação sinal-ruído e proximidade da amostra com a lamela. Além de reduzir a relação sinal-ruído, as distâncias da parede do corpo do músculo larval da neurônios da lamela, limitando assim a resolução da imagem melhorada que pode ser conseguida com métodos de microscopia de super-resolução. Além desafios para análise de imunofluorescência, tecido muscular apresenta uma barreira para gravação electrofisiológico de neurónios sensoriais na parede do corpo larval. Portanto, a sua remoção beneficia manipulação neurofisiológica de neurônios sensoriais 14. Aqui, um método para a remoção manual de Drosophila tecido muscular larval é descrito. Nós demonstramos que nosso protocolo pErmits imagem imunofluorescência de proteínas que são de outra forma obscurecido por tecido muscular, melhora a relação sinal-ruído para a visualização de classe IV da neurônios, e permite o uso de microscopia de super-resolução para melhor discriminar relações espaciais de proteínas e estruturas celulares no da neurônios e a epiderme.

<table><tbody><tr><td>Pinça Dumont #5</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>72701-D</td><td></td></tr><tr><td>Micro Tesoura, 8 cm, reta, lâminas de 5 mm, pontas de 0,1 mm</td> Kit de elastômero de silicone Sylgard 184 da <td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>para placas de dissecação</td></tr><tr><td>Pinos de insetos Austerlitz, 0,1 mm</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz Fostec 8375</td><td>Artisan Technology Group</td><td>62792-4</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifade mount</td><td>medium Vector</td><td>Laboratories H-1000</td><td>para microscopia confocal</td></tr><tr><td>Prolong Diamond antifade mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36970</td><td>para microscopia de iluminação estruturada</td></tr><tr><td>Micro vidro de cobertura, 22 x 22 mm, nº 1,5</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio Superfrost Plus, 25 x 75 x 1,0 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anticoracle de camundongo</td><td>Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma</td><td>C615.16</td><td>sobrenadante, diluído 1:50</td></tr><tr><td>Anticorpo grande de camundongo anticorpo grande</td><td>Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma</td><td>4F3</td><td>sobrenadante, diluído 1:50</td></tr><tr><td>Coelho anti-dsRed anticorpo</td><td>Clontech</td><td>632496</td><td>diluir 1:1.000</td></tr><tr><td>anticorpo anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 568 conjugado</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>diluído 1:1.000</td></tr><tr><td>anticorpo anti-camundongo de cabra, Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>diluir 1:500</td></tr></tbody></table>

remoção de<em&gt; drosophila</em&gt; tecido muscular larval filetes para análise de imunofluorescência de neurônios sensoriais e células epidérmicas

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Neurônios Drosophila larval arborização dendrítica (DA) é um modelo popular para a investigação de mecanismos de morfogênese neuronal. Da neurónios desenvolver em comunicação com as células epidérmicas que inervam e, portanto, os seus benefícios de análise de visualização em in situ de ambas as proteínas neuronalmente e epidermicamente expressas por imunofluorescência. Os métodos tradicionais de preparação de filetes de larvas para experiências de imunofluorescência deixar intacto o tecido muscular que cobre a maior parte da parede do corpo, apresentando vários desafios à imagem latente proteínas neuronais e epidérmicas. Descrevemos aqui um método para a remoção de tecido muscular de Drosophila filetes larval. Este protocolo permite imagiologia de proteínas que são de outra forma obscurecido por tecido muscular, melhora a relação sinal-ruído, e facilita o uso de microscopia de super-resolução para estudar da Desenvolvimento neurônio.

Nós demonstrar a utilidade do procedimento de remoção do músculo para melhorar a relação sinal-ruído em experiências de imunofluorescência para co-visualizar as proteínas de junções septadas Coracle (Cora) e discos de grande (GMD) em conjunto com classe IV da neurônios marcados com o marcador de membrana CD4- tdTomato. Cora foi previamente usada para identificar trechos onde a Dinamarca dendrites neuronais são delimitados por células epidérmicas e é um dos mu...

Estudos da morfogênese neuronal usando Drosophila arborização dendrítica larval (da) neurônios beneficiar na visualização situ de proteínas neuronais e epidérmicas por imunofluorescência. Descreve-se um processo que melhora a análise de imunofluorescência de Da neurónios e células epidérmicas vizinhas através da remoção de tecido do músculo da parede do corpo larval.

Remoção de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecido muscular larval Filetes para Análise de imunofluorescência de neurônios sensoriais e células epidérmicas

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

O objetivo geral deste procedimento é remover o tecido muscular de uma larva de drosófila para preparação à análise por imunofluorescência da arborização dendrítica larval ou dos neurônios da e do tecido epidérmico. Hoje, vamos demonstrar um método que melhora a visualização de fatores neuronais e extraneuronais envolvidos na morfogênese dendrítica. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a obtenção de imagens por imunofluorescência de proteínas que, de outra forma, seriam obscurecidas pelo tecido muscular, melhora a relação sinal-ruído e possibilita o uso de microscopia de super-resolução.Para começar, adicione salina fria suficiente a um recipiente de elastômero de silicone para cobrir a superfície inferior. Adicione a larva objeto ao recipiente e coloque-a sob o microscópio estereoscópico. Certifique-se de posicionar corretamente a luz.Posicione a larva com o lado ventral voltado para cima, o que pode ser identificado pelas faixas de cerdas abdominais. Estique a larva na direção anterior-posterior e, utilizando alfinetes para insetos, fixe a cabeça e a cauda no fundo do recipiente. Com um par de tesouras finas de dissecação, corte ao longo da linha média ventral da

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