Caracterizando o transporte de elétrons através de biofilmes vivos

O objetivo geral deste procedimento experimental é determinar a quantidade de corrente que pode ser conduzida através de um material vivo in situ, bem como o mecanismo empregado pelo material vivo para transportar a corrente. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da eletroquímica microbiana, como: Como certos biofilmes podem mover elétrons por centenas de mícrons para apoiar o metabolismo celular? A principal vantagem dessa técnica é que os eletrodos interdigitados fornecem uma relação sinal-ruído muito alta e podem ser dimensionados para caber em muitas configurações diferentes de reatores.

Esses métodos podem fornecer informações sobre o transporte de elétrons extracelulares de comprimento de várias células em biofilmes. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como filmes de polímero eletricamente condutores. Pesquisadores novos neste método terão dificuldades porque requer um bipotenciostato para definir os potenciais de ambos os eletrodos separadamente e medir a corrente em cada eletrodo separadamente.

Para começar, obtenha eletrodos IDA disponíveis comercialmente padronizados em um substrato não condutor ou sintetize-os usando métodos litográficos padrão. Prepare epóxi de prata condutor de acordo com as instruções do fabricante com uma haste misturadora ou ponta de pipeta. Em seguida, coloque um fio em cada almofada de ouro e prenda-os no lugar usando fita adesiva.

Cubra o fio e a almofada com epóxi prateado usando uma haste misturadora ou ponta de pipeta. Mova cuidadosamente o aparelho para um forno a 80 graus Celsius por uma hora para curar. Após a cura do epóxi, use um multímetro para garantir a condutividade elétrica entre a extremidade do fio e as almofadas.

A resistência entre o fio e as pastilhas deve ser inferior a cinco ohms. Além disso, use o multímetro para verificar se nenhum epóxi condutor está conectando várias almofadas de eletrodo, pois isso pode causar curto-circuito na matriz. Se o epóxi condutor estiver conectando vários cabos, use o escriba para isolar os cabos.

Em seguida, remova a ponta de um tubo de centrífuga cônico de 15 mililitros para usar como molde para o material isolante. Use uma agulha de calibre 21 para fazer dois pequenos orifícios na parte inferior do molde para que os fios se projetem. Insira o IDA no molde e insira os fios através dos orifícios na parte inferior do molde.

Em seguida, prepare um material isolante térmico elétrico e à prova d'água. Resinas de poliuretano retardantes de chama são frequentemente adequadas. Pipete o isolador no molde para que o epóxi prateado fique completamente coberto e deixe o isolador secar de acordo com as especificações do fabricante.

Para configurar a célula eletroquímica, insira o IDA, o contra-eletrodo e o eletrodo de referência na célula eletroquímica. Encha a célula eletroquímica com meio estéril adequado para o crescimento do biofilme. Para Geobacter sulfurreducens, use meio de água doce excluindo fumarato.

Em seguida, conecte os eletrodos a um bipotenciostato. Conecte um eletrodo IDA ao cabo de trabalho, o outro eletrodo IDA ao cabo de trabalho dois, o eletrodo de referência ao cabo de referência e o contra-eletrodo ao contra-cabo. Realize um experimento de controle realizando voltametria cíclica no eletrodo um e segurando o eletrodo dois em circuito aberto para garantir que os eletrodos não estejam conectados.

Para cultivar o biofilme eletroativo relevante, inocular o reator eletroquímico a partir de uma cultura de estoque ou enriquecimento dos microrganismos eletroquimicamente ativos desejados usando técnicas microbiológicas assépticas padrão. Para testes padrão, inocular em uma proporção de 1 para 20 de inóculo para volume do reator. Defina a agitação no reator para o nível desejado e defina a incubadora ou banho-maria para a temperatura desejada com base nas condições de crescimento do biofilme de interesse.

Incubar o sistema com base nos requisitos específicos do microrganismo de interesse até que o biofilme preencha a lacuna que separa os dois eletrodos. Para biofilme estacionário Geobacter sulfurreducens, incubar por sete a dez dias a 30 graus Celsius. Comece a configuração dos parâmetros experimentais que serão usados para determinar a dependência potencial atual para as medições de gating, conforme descrito no protocolo de texto.

Configure o software bipotenciostato para realizar as medições de gating na faixa selecionada na tensão de drenagem da fonte selecionada e na taxa de varredura desejada. Além disso, execute uma medição de linha de base conforme descrito no protocolo de texto. Realizar medições de gating utilizando as mesmas condições de renovação com dador ou aceptor de electrões solúveis presente em condições de não rotatividade sem condições de doador ou aceptor de electrões solúveis.

Obtenha um reator de controle para garantir que o ponto de ajuste e a temperatura real do meio sejam os mesmos. Coloque um termômetro ou um termopar em um reator de controle onde estaria o IDA. Em seguida, faça medições da corrente de deformação da fonte na faixa de temperaturas selecionadas em condições de rotatividade e não rotatividade usando o bipotenciostato.

Para fazer isso, defina e segure o IDA no potencial de porta que produz a corrente máxima conduzida usando o bipotenciostato. Registre a corrente máxima conduzida usando o bipotenciostato enquanto a temperatura é alternada entre a faixa de temperaturas selecionada usando os controles integrados do banho-maria ou incubadora. Alterne a temperatura de um ponto de ajuste para o outro e vice-versa usando os controles integrados da incubadora ou do banho-maria.

Isso determina a reversibilidade da reação para garantir que o ciclo de temperatura não prejudique o biofilme. Finalmente, redefina a temperatura de volta à temperatura normal de crescimento e permita que o sistema se estabilize. Aqui são mostrados os resultados representativos de um IDA que está funcionando corretamente em meio de água doce.

Versus um em que os eletrodos foram curtos. Medições de gating eletroquímico representativas realizadas em um biofilme Geobacter sulfurreducens sob condições de não rotatividade com uma tensão de deformação da fonte de 10 milivolts exibem a corrente conduzida em forma de pico versus curva de potencial de porta característica da condutividade redox. Aqui, dados brutos representativos mostram a dependência da corrente conduzida da temperatura do meio do reator.

A diminuição da corrente conduzida com a diminuição da temperatura é outra característica dos condutores redox. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente dois dias se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de garantir que as bandas IDA não estejam em curto antes de inocular o reator.

As implicações desta técnica se estendem à terapia quando aplicada para estudar como interromper o metabolismo celular de patógenos formadores de biofilme. Este procedimento pode ser aplicado a qualquer material vivo capaz de transportar elétrons para abordar questões adicionais, como a correlação entre a refologia do biofilme e a condutividade.