Um método para medir RNA N 6 -methyladenosine modificações nas células e tecidos

O objetivo geral da técnica modificada de northern blotting é medir as modificações de N6-metiladenosina, n6A no RNA e detectar modificações em diversos RNAs. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no papel da epigenética do RNA, como modificações de N6-metiladenosina. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece a separação efetiva do RNA, melhor padronização para projetos experimentais e um delineamento claro da modificação do n6A nos RNAs.

Este método pode fornecer informações sobre as modificações de n6A no RNA e também pode ser aplicado a outras modificações de RNA com diferentes anticorpos de detecção. Para iniciar o experimento, borrife a solução de descontaminação da ribonuclease em toalhas de papel e limpe as pipetas e as superfícies da bancada do laboratório. Molhe as toalhas de papel com água livre de nuclease e limpe as pipetas e as superfícies da bancada do laboratório novamente.

Obtenha a solução de isolamento de RNA mantida a quatro graus Celsius e adicione um mililitro da solução a cerca de 75 miligramas de tecido de camundongo. Use um agitador suspenso para homogeneizar o tecido. Em seguida, adicione 100 microlitros de 1-Bromo-3-cloropropano ou BCP por um mililitro de homogeneizado de amostra.

Agite os tubos vigorosamente por 15 segundos e prossiga para o isolamento total do RNA. Usando um espectrofotômetro, determine a concentração de RNA observando a absorbância em 260 nanômetros e 280 nanômetros. Verifique a qualidade da amostra de RNA realizando eletroforese em gel de agarose a 0,8%.

Enxágue todo o equipamento de eletroforese com dietilpirocarbonato ou água DEPC. Combine 2,5 gramas de agarose, depois 215 mililitros de água DEPC em um frasco Erlenmeyer e derreta completamente a mistura no micro-ondas. Depois que a solução derreter, adicione 12,5 mililitros de tampão MOPS 10X.

E 22,5 mililitros de formaldeído a 37% para o frasco. Em seguida, despeje a solução no aparelho de eletroforese com um pente de 1,5 milímetro de espessura. Usando um pente limpo, empurre as bolhas para as bordas do gel.

Deixe o gel solidificar à temperatura ambiente. Em seguida, use o tampão de corrida 1X MOPS previamente preparado para enxaguar os poços do gel e pré-executar o gel. Carregue as amostras de RNA nos poços do gel e, em seguida, execute o gel.

No dia seguinte, examine e fotografe o gel sob luz ultravioleta. Para preparar a transferência, corte o gel e remova a porção não utilizada. Prepare 500 mililitros de citrato de sódio sadio 10X salino ou tampão SSC.

Lave o gel duas vezes com tampão SSC 10X. Corte uma folha de papel de filtro grande o suficiente para cobrir o gel. Corte quatro pedaços de papel de filtro do mesmo tamanho do gel.

Em seguida, corte uma folha de membrana de náilon carregada positivamente no mesmo tamanho do gel. Marque um entalhe no gel e na membrana como um marcador para garantir a orientação adequada. Mergulhe a membrana em tampão SSC 2X.

Despeje 500 mililitros de tampão SSC 10X na bandeja de transferência. Coloque a folha grande de papel de filtro sobre a placa de vidro e molhe o papel de filtro com tampão de transferência. Em seguida, use uma pipeta para estender as bolhas.

Mergulhe dois pedaços de papel de filtro pré-cortado no tampão de transferência e coloque-os no centro do papel de filtro. Remova todas as bolhas. Em seguida, coloque o gel com a parte superior voltada para baixo no papel de filtro e coloque a membrana em cima do gel, certificando-se de alinhar os entalhes do gel e da membrana.

Em seguida, coloque dois pedaços de papel de filtro pré-cortado em cima da membrana. Remova todas as bolhas entre as camadas. Aplique filme plástico ao redor do gel para garantir que as toalhas absorvam apenas o tampão que passa pelo gel e pela membrana.

Em seguida, empilhe toalhas de papel em cima do papel de filtro. Coloque uma placa de vidro grande em cima das toalhas e coloque um peso em cima da pilha e permita que o RNA seja transferido do gel para a membrana durante a noite. Após a transferência, mantenha a membrana úmida em tampão SSC 2X.

Mergulhe duas folhas de papel de filtro com tampão SSC 10X e, em seguida, coloque as folhas no reticulador UV. Certifique-se de que o lado absorvido pelo RNA esteja voltado para cima e, em seguida, coloque a membrana em cima do papel de filtro. Selecione o modo de reticulação automática e pressione o botão Iniciar para iniciar a irradiação.

Examine a membrana e o gel com um coletor de imagem de gel UV para confirmar a transferência de RNA do gel para a membrana. Bloqueie a membrana em 5% de leite desnatado em tampão TBST em temperatura ambiente por uma hora. Incube a membrana durante a noite em solução de anticorpo m6A a quatro graus Celsius.

No dia seguinte, lave a membrana três vezes com tampão TBST por 15 minutos. Em seguida, incubar a membrana na solução de anticorpo anti-coelho de burro conjugada HRP durante uma hora à temperatura ambiente. Após uma hora, lave a membrana três vezes com tampão TBST por 15 minutos.

Aplique o substrato de quimioluminescência aprimorado. Capture a quimioluminescência com um gerador de imagens digital. Finalmente, passe para a quantificação de m6A e meça a intensidade quimioluminescente relativa de m6A usando a imagem J. Os RNAs do fígado de camundongos foram amostrados em intervalos de quatro horas e estudados com a técnica de northern blotting modificada.

A metilação de rRNAs, mRNAs e pequenos RNAs foi claramente detectada. Foram realizados blots representativos de m6A para RNA total e sem rRNA do fígado de camundongos selvagens. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro dias se for executada corretamente.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da epigenética de RNA explorarem os impactos na fisiologia humana relacionados ao ritmo circadiano e à obesidade.