Name: Um método para medir RNA N 6 -methyladenosine modificações nas células e tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprenda a técnica de northern blotting modificada para detectar modificações de m6A em RNA de tecidos de camundongo. Este método padronizado permite estudar epigenética de RNA e ritmos circadianos.

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C.Y.W. recebeu apoio do National Health Research Institute (NHRI-EX101-9925SC), do National Science Council (101-2314-B-182-100-MY3, 101-2314-B-182A-009) e do Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG3B1643, CMRPG3D1002, CMRPG3D0581, CMRPG380091 e CMRPG3C1763).

NOTA: O total RNA m 6 A nível inclui rRNA, mRNA, e outros pequenos RNAs. Desde RNA ribossomal tem abundantes m 6 modificações A, a medição da m 6 levels terá de considerar este fato. Isolamento 1. RNA <ol><li> Usando a solução ribonuclease descontaminação (pulverizado sobre toalhas de papel), limpe as pipetas e superfícies das bancadas do laboratório. papel-toalha molhada com água livre de nuclease e limpar as pipetas e superfícies das bancadas do laboratório novamente. </li><li> Extração de RNA <ol><li> Isolamento de ARN total <ol><li> Usando um agitador suspenso, homogeneizar 50-100 mg de tecido ou 5-10 X 10 6 células em 1 mL de solução de isolamento de ARN mantidas a 4 ° C. NOTA: Mais tecido (100-150 mg) pode ser necessária para amostras de tecido adiposo de ratos por causa das concentrações de ARN inferiores das mesmas. As amostras provenientes de rato coração, fígado, músculo esquelético, o pulmão, cérebro, e os macrófagos foram empregues quatro anteriormente. </li><li> DentroCubate os homogenatos de amostra durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 100 uL de 1-bromo-3-cloropropano (BCP) por 1 ml de homogenato da amostra. Agitar vigorosamente os tubos durante 15 s e proceder para isolar o ARN total de acordo com as instruções do fabricante 24. </li></ol></li><li> A purificação a partir de ARNm poliadenilado do RNA total isolado <ol><li> Purificar mRNA poliadenilados usando kits ou protocolos disponíveis. <ol><li> Agitar minuciosamente para re-suspender cada uma das seguintes soluções: A solução de ligação, oligo (dT) de grânulos de poliestireno, e a solução de lavagem 2x. Certifique-se de que o oligo (dT) grânulos quentes à temperatura ambiente antes do uso. </li><li> Transferir 120 uL da solução de eluição por preparação para um tubo de calor e a 70 ° C num bloco de aquecimento. </li><li> Pipeta-se 500 ^ g de ARN total para um tubo de microcentrífuga. Com água livre de nuclease, ajustar o volume para 250 mL. </li><li> Adicionar 250 uL de solução de ligação 2x para o ARN total assimlução e agitar com vortex brevemente para misturar o conteúdo. </li><li> Adicionar 15 ul de oligo (dT) e grânulos de vórtice para misturar completamente. </li><li> Incubar a mistura a 70 ° C durante 3 min. </li><li> Retirar a amostra do bloco de aquecimento e deixou-se em repouso à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Centrifugar a 15000 xg durante 2 min. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante, deixando para trás cerca de 50 mL. </li><li> Adicionar 500 uL de solução de lavagem para re-suspender o sedimento por pipetagem. </li><li> Pipetar a suspensão em um conjunto tubo de filtro de spin / coleção. </li><li> Centrifugar a 15000 xg durante 2 min. Retirar a coluna do tubo de recolha e o descarte de fluxo. Retornar a coluna para o tubo de recolha. </li><li> Pipetar 500 L de solução de lavagem para o filtro de rotação. </li><li> Centrifugar a 15.000 x g durante 2 min. </li><li> Transferência do filtro de rotação para um tubo de recolha de fresco. </li><li> Pipetar 50 ul de solução de eluição aquecidaa 70 ° C para o centro do filtro de rotação. </li><li> Incubar durante 2-5 min a 70 ° C. Centrifugar a 15000 xg durante 1 min. </li><li> Pipetar um adicional de 50 ul de solução de eluição aquecida a 70 ° C para o centro do filtro de rotação. </li><li> Repita o passo 1.2.2.1.18. </li></ol></li><li> Adicionam-se 100 ug / mL de glicogénio, 0,1 volume de tampão de acetato de sódio 3 M (pH 5,2), e 2,5 volumes de etanol absoluto. Precipitar durante a noite a -80 ° C. </li><li> Centrifuga-se a 15000 xg durante 25 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante. </li><li> Lava-se a pelete com 1 ml de etanol a 75%. Centrifuga-se a 15000 xg durante 15 min a 4 ° C. Retire cuidadosamente o etanol. </li><li> Seco ao ar durante 3-5 min. </li><li> Adicionar 10 ul de água isenta de nuclease para dissolver o sedimento. </li><li> Armazenar a -70 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> RNA qualificação e quantificação <ol><li> Usando um espectrofotómetro para determinar a concentração de ARN por NotIng a absorvância a 260 nm e 280 nm. A relação A260 / A280 deve ser 1,8-2,2. </li><li> Verifique a qualidade da amostra de RNA usando 0,8% eletroforese em gel de agarose 25. NOTA: O RNA total eucariótica intacta deve mostrar intensas bandas de 28S e 18S rRNA. A proporção de 28S contra 18S rRNA intensidade da banda para uma boa preparação de RNA é ~ 2. </li></ol></li></ol> 2. eletroforese em gel e Transferência NOTA: Os protocolos de preparação tampão são dadas na Tabela 1. <ol><li> Formaldeído Preparação de gel (1%) <ol><li> Lavar todo o equipamento de eletroforese com dietilpirocarbonato (DEPC) de água. </li><li> Melt 2,5 g de agarose em 215 ml de água com DEPC completamente num forno de microondas. </li><li> Adicionar 12,5 ml de 10x 3- (N- morfolino) propanossulfónico (MOPS) Tampão e 22,5 ml de formaldeído a 37%. </li><li> Deite-o no aparelho de electroforese com um pente de espessura de 1,5 mm. </li><li> Eliminar as bolhas ou empurrar tbainha para as bordas do gel com um pente limpo. </li><li> Deixar o gel solidificar à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparação de amostra <ol><li> Misture 1-10 ug de ARN total, e 11,3 ul de tampão de amostra. </li><li> Misturar 2 ug do marcador de ARN (1 mg / mL) com 11,3 mL de tampão de amostra. </li><li> Adicionar água isenta de nuclease para as amostras a partir de 2.2.1 e 2.2.2 para um volume total de 16 uL. </li><li> Aquecer a 60 ° C durante 5 min, e em seguida esfriar em gelo. </li><li> Misturar 16 ul da amostra a partir de 2.2.3 com 4 ul de corante de acompanhamento, que contém 0,1 mg / mL de brometo de etidio em gelo. CUIDADO: O brometo de etídio é, possivelmente, teratogênico e tóxico se inalado. Leia brometo de etídio segurança folha de dados. </li></ol></li><li> eletroforese <ol><li> Adicione 200 ml de 10x tampão MOPS a 1.800 mL de DDH 2 O para fazer um tampão de corrida 1x MOPS. </li><li> Utilize tampão de corrida 1x MOPS para lavar os poços do gel. </li><li> Pré-run tele gel a 20 V durante 5 minutos. </li><li> Coloque as amostras de ARN para os poços do gel. </li><li> Cubra com papel alumínio para evitar a exposição à luz. Execute a 35 V durante cerca de 17 h (durante a noite) </li><li> Examinar e fotografar o gel sob uma luz UV. </li></ol></li><li> Transferir <ol><li> Cortar o gel para remover a porção não utilizada. </li><li> Preparar 500 ml de 10x tampão SSC (250 ml de 20x tampão SSC e 250 mL de água com DEPC). </li><li> Lavar o gel duas vezes com 10x tampão SSC durante 20 min com agitação a 50 rpm. </li><li> Cortar uma folha de papel de filtro suficientemente grande para servir como um pavio de papel, que absorve tampão de transferência do tabuleiro de transferência (figura 1). </li><li> Corte 4 pedaços de papel de filtro para o mesmo tamanho que o gel. </li><li> Cortar uma folha de membrana de nylon carregada positivamente para o mesmo tamanho que o gel. </li><li> Marcar um entalhe sobre o gel e a membrana, como um marcador para assegurar a orientação correcta. </li><li> Embeber a membrana em tampão SSC 2x durante 15 min. </li><li> Despeje 500 ml of 10x SSC tampão na bandeja de transferência. </li><li> Coloque a folha de papel de filtro grande do outro lado da placa de vidro e molhar o papel de filtro com tampão de transferência. </li><li> Rolar para fora todas as bolhas com uma pipeta. </li><li> Soak 2 peças de papel de filtro pré-corte em tampão de transferência e coloca-os no centro do papel de filtro a partir do passo 2.4.5. Remover quaisquer bolhas. </li><li> Lay topo do lado do gel para baixo no papel de filtro. </li><li> Colocar a membrana no topo do gel. Alinhar os entalhes do gel e da membrana. </li><li> Coloque 2 peças de papel de filtro pré-corte na parte superior da membrana e molha o filtro de papel com tampão de transferência. </li><li> Remover quaisquer bolhas entre as camadas. </li><li> Aplicar película de plástico em torno do gel para garantir que as toalhas apenas absorver tampão que passa através do gel e da membrana. </li><li> Empilhar as toalhas de papel no topo do papel de filtro. </li><li> Coloque uma placa de vidro de grandes dimensões em cima das toalhas. </li><li> Coloque um peso no topo da pilha. </li><li>Manter durante a noite para permitir que o ARN de transferência do gel para a membrana. </li></ol></li></ol> 3. Detecção de N 6 -methyladenosine <ol><li> membrana de reticulação <ol><li> Mantenha a membrana úmida em tampão 2x SSC. </li><li> Coloque 2 folhas de papel de filtro imerso com 10x tampão SSC em reticulador de UV. </li><li> Colocar a membrana no topo do papel de filtro, com o lado da ARN-adsorvido voltado para cima. </li><li> Selecione &quot;Modo autocrosslink&quot; (120.000 μJ) e pressione o botão &quot;Iniciar&quot; para iniciar a irradiação. </li><li> Examinar a membrana e o gel com uma imagem do gel de UV coletor para confirmar a transferência de ARN do gel para a membrana. </li></ol></li><li> immunoblotting <ol><li> Bloquear a membrana em leite sem gordura a 5% em solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBST) de tampão à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Lavar três vezes com tampão de TBST, durante 15 min. </li><li> Incubar a membrana durante a noite em 6 m A (&lt;em&gt; solução de N 6 -methyladenosine) anticorpo (1: não gordo leite tampão TBST 1000 em 5%) a 4 ° C. </li><li> Lava-se a membrana três vezes com tampão de TBST, durante 15 min. </li><li> Incubar a membrana na solução de burro conjugado com HRP anti-anticorpo de coelho (1: 2000 em tampão TBST leite 5% sem gordura) durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Lava-se a membrana três vezes com tampão de TBST, durante 15 min. </li><li> Aplicar o substrato quimioluminescente melhorado (0,125 ml por cm2 de membrana). </li><li> Capture a quimiluminescência com as definições ideais de o gerador de imagens digitais, de acordo com as instruções do fabricante 26. </li></ol></li><li> m 6 A Quantificação <ol><li> Medir a 6 m Uma intensidade quimioluminescente relativa utilizando o software ImageJ. <ol><li> Sob o menu do software ImageJ, selecione a opção &quot;File&quot; para abrir o arquivo pertinente. </li><li> Selecione a ferramenta &quot;Retângulo&quot; de ImageJ e desenhar uma moldura em voltaos sinais. </li><li> Se RNA ribossomal não é o foco dos experimentos, evitar os 18S e 28S RNA ribossomal m 6 a bandas para o cálculo. </li><li> Clique &quot;Comando&quot; e &quot;1&quot; para confirmar a pista seleccionada. </li><li> Pressione &quot;Command&quot; e &quot;3&quot; para mostrar o enredo selecionado. </li><li> Clique no botão &quot;Straight&quot; ferramenta e desenhe linhas para separar a área segmentada. </li><li> Clique na ferramenta &quot;Wand&quot; para gravar as medições. </li><li> Exportar os dados. </li><li> Normalizar os níveis de M 6 um com o ARN ribossómico 18S banda da coloração com brometo de etídio. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Klungland, A., Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+RNA+modifications+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Dynamic RNA modifications in disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

As modificações do RNA têm papéis importantes na função e fisiologia celular. A compreensão atual da regulação, função e homeostase dessas modificações ainda está sendo explorada e expandida8. Portanto, é necessário um método preciso e padrão-ouro para avaliar as modificações do RNA. O método de northern blotting modificado fornece quantificação precisa das modificações de RNA e delineamento claro das modificações em diversos RNAs. Embora o método exija pelo menos 3 dias, ele pode ser padronizado e pode ser usado em vários projetos experimentais. Além disso, com diferentes anticorpos, pode detectar diferentes modificações de RNA27.
É importante separar diferentes RNAs ao analisar as modificações do RNA. O RNA ribossômico compreende uma grande parte da quantidade total de RNA28,29. Os resultados da análise das modificações do RNA apenas no RNA total representarão principalmente as alterações do rRNA. A metilação e outras modificações do rRNA podem potencialmente mascarar as mudanças em outros RNAs. Com o procedimento de separação em gel, as modificações de mRNA e outros pequenos RNAs podem ser analisadas com mais precisão.
O mapeamento de todo o transcriptoma com imunoprecipitação e sequenciamento m6A fornece informações detalhadas sobre a modificação de cada tipo de RNA22. Ele fornece informações sobre os RNAs específicos e uma resolução de cerca de 80-120 pb. Embora m6A-Seq possa comparar as modificações entre diferentes condições experimentais, a seleção de padrões e controles adequados para tais experimentos é difícil18. A imunoprecipitação é difícil de reproduzir, muitas vezes dando variações significativas entre as repetições. Além disso, m6A-Seq requer a fragmentação de amostras de RNA antes da imunoprecipitação e sequenciamento30. O processo de fragmentação poderia potencialmente induzir influências indevidas nas modificações originais do RNA. Se o experimento não precisar de informações do gene específico, mas exigir condições diferentes para comparação, o método atual fornece melhor visualização e controle para diversas configurações experimentais. 
A modificação do RNA é um passo importante na regulação do controle transcricional31. No entanto, a homeostase e os mecanismos regulatórios de várias modificações de RNA sob diversos domínios fisiológicos ainda não estão claros. Usando o presente método modificado de northern blotting, diferentes modificações de RNA podem ser quantificadas e comparadas. Além disso, as mudanças e regulações das modificações de RNA podem ser investigadas com mais detalhes. No futuro, também pode ser possível combinar os dados experimentais dos protocolos clássicos de northern blotting e northern blotting modificados, fornecendo maiores insights sobre a biologia do RNA.
O fator mais importante que determina o sucesso do protocolo de northern blotting modificado é a integridade da amostra de RNA. RNAs com alguma quantidade de degradação podem produzir bons resultados clássicos de northern blotting, mas isso pode ter um impacto significativo nos resultados modificados de northern blotting. As modificações do RNA em diferentes tecidos ou linhagens celulares também podem variar significativamente. É importante testar as cargas de amostra de RNA adequadas para diferentes tecidos antes de realizar os experimentos finais.
Como os procedimentos de blotting têm sido tradicionalmente nomeados em homenagem ao Dr. Southern e diferentes direções geográficas, propomos o nome blotting "nordestino" para a técnica atual.

Modificações dinâmicas e reversíveis de RNA têm papéis importantes na homeostase do RNA. Quatro décadas atrás, as modificações de N 6-metiladenosina (m6A) foram encontradas em transcriptomas eucarióticos1. Eles têm diversas funções no RNA mensageiro (mRNA), RNA ribossômico (rRNA), RNA nucleolar pequeno, RNA de transferência e microRNA2. As modificações m6A do mRNA influenciam seu splicing3, tradução4, degradação5 e localização2. Além disso, eles afetam a biogênese do ribossomo e a função do microRNA6. A conservação evolutiva das modificações de RNA m6A é observada em bactérias unicelulares para humanos multicelulares7. A delimitação dos papéis das modificações m6A está atualmente sob extensa exploração. Espera-se que os esforços forneçam novos insights sobre o controle da transcrição. Estudos recentes revelam que outras modificações químicas do mRNA8 também desempenham papéis críticos no metabolismo do RNA. 
Ritmos circadianos9, pluripotência de células-tronco10, metabolismo de triglicerídeos4, fibrose11, obesidade12 e depressão maior13 são alguns exemplos de processos em que as modificações m6A são conhecidas por controlar os resultados. Muitos transcritos de genes do relógio circadiano têm m6sítios A14. A modulação de m6A metilase ou desmetilase provoca alterações no período circadiano15. Mettl3, uma m6A transferase, é um regulador da pluripotência de células-tronco. Uma deficiência de Mettl3 leva à letalidade embrionária precoce e ao priming de linhagem aberrante no estágiopós-implantação 10. Uma deficiência de massa gorda associada à obesidade (FTO), uma m6A desmetilase, em adipócitos afeta a mobilização de ácidos graxos e o peso corporal por meio da regulação pós-transcricional de Angptl44. Esses estudos revelam que o m6A não apenas controla o processamento do mRNA, mas também desempenha papéis críticos no desenvolvimento embriológico e na fisiopatologia. A função das modificações m6A tem implicações para considerações terapêuticas no futuro.
Vários métodos estão disponíveis para medir modificações m6A do RNA16-18. Tradicionalmente, a cromatografia em camada delgada (TLC) e a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) são usadas para estudar a distribuição de m6A em vários RNAs19,20. A espectrometria de massa é uma ferramenta sensível para a detecção de modificações m6A no RNA. No entanto, o RNA precisa ser excisado por RNase em fragmentos curtos antes da análise por espectrometria de massa21. A imunoprecipitação e sequenciamento de metil-RNA (m6A-Seq)22 imunoprecipita RNAs fragmentados com anticorpos específicos m6A e realiza sequenciamento paralelo de RNA. Este método gera paisagens m6A em todo o transcriptoma. O mapeamento de alta resolução de m6A de reticulação e imunoprecipitação de resolução de nucleotídeos individuais (miCLIP) mapeia ainda mais as modificações de m6A em uma resolução de nucleotídeo único23. Ambos os métodos fornecem detalhes da modificação de m6A em todo o transcriptoma, com informações de genes específicos. No entanto, quantificações e padronizações em ambos os métodos são difíceis se os experimentos exigirem a comparação de várias condições. Além disso, fragmentações de RNA para m6A-Seq alteram a estrutura original do RNA, o que pode afetar os níveis nativos de m6A. Para detectar modificações globais de m6A do RNA e suas mudanças em diferentes condições experimentais, relatamos um método que emprega um protocolo de northern blotting modificado. Este método resolve o RNA por peso molecular, usando eletroforese em gel18. Este procedimento fornece melhor padronização e quantificações para experimentos que envolvem várias condições ou amostras. Ele também fornece informações específicas de modificação m6A para diferentes RNAs, seja rRNA, mRNA ou microRNA.

<table><tbody><tr><td>Solução RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9782</td><td>Protocolo 1.1</td></tr><tr><td>Solução de reagente TRI</td><td>Ambion</td><td>AM9738</td><td>Protocolo 1.2.1.1</td></tr><tr><td>1-Bromo-3-cloropropano (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B9673</td><td>Protocolo 1.2.1.3</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>JTbaker</td><td>8006</td><td>Protocolo 1.2.1.3</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>Protocolo 1.2.1.3</td></tr><tr><td>GenElute mRNA Miniprep Kit</td><td>Sigma</td><td>MRN70</td><td>Protocolo 1.2.2.1</td></tr><tr><td>Glicogênio</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td>Protocolo 1.2.2.2</td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>Fluka</td><td>71183</td><td>Protocolo 1.2.2.2</td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Ambion</td><td>AM9930</td><td>Protocolo 1.2.2.6</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>Protocolo 2.1.1</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>JT Baker</td><td>A426</td><td>Protocolo 2.1.2</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>Protocolo 2.1.3</td></tr><tr><td>Solução de formaldeído a 37%</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Protocolo 2.1.3</td></tr><tr><td>EDTA, Sal Dissódico</td><td>JT Baker</td><td>8993</td><td>Protocolo 2.1.3 10x MOPS tampão</td></tr><tr><td>formamida</td><td>Sigma</td><td>F7503</td><td>Protocolo 2.2.1</td></tr><tr><td>RNA Millennium Marker</td><td></td><td>Ambion AM7150</td><td>Protocolo 2.2.2</td></tr><tr><td>Brometo de Etídio</td><td>Amresco</td><td>X328</td><td>Protocolo 2.2.5</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0300-10</td><td>Protocolo 2.2.5 corante de rastreamento</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol Sigma</td><td></td><td>114391</td><td>Protocolo 2.2.5 corante de rastreamento</td></tr><tr><td>Xileno Cyanol FF</td><td>Sigma</td><td>X4126</td><td>Protocolo 2.2.5 corante de rastreamento</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio di-hidratado</td><td>JT Baker</td><td>3624</td><td>Protocolo 2.4.2 20x SSC tampão</td></tr><tr><td>Citrato trissódico</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td>Protocolo 2.4.2 20x SSC tampão Hybond</td></tr><tr><td>Papel mata-borrão</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN6101M</td><td>Protocolo 2.4.4</td></tr><tr><td>GE Hybond-N+ membrana</td><td>GE Healthcare RPN303B</td><td></td><td>Protocolo 2.4.6</td></tr><tr><td>Stratalinker UV Crosslinker 2400</td><td>Protocolo 400075 Stratagene</td><td></td><td>3.1.2</td></tr><tr><td>Coletor de gel 1500</td><td>Tecnologia ANT</td><td>Gel Catcher 1500</td><td>Protocolo 3.1.5</td></tr><tr><td>Anti-m6A (N6-metiladenosina)</td> <td>Sistemas sinápticos</td><td>202003</td><td>Protocolo 3.2.3</td></tr><tr><td>Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd inteiro Ab</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934</td><td>Protocolo 3.2.5</td></tr><tr><td>Sistema ChemiDoc MP</td><td>BIO-RAD</td><td>1708280</td><td>3.2.8</td></tr></tbody></table>

um método para medir rna<em&gt; n</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine modificações nas células e tecidos

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N 6-metiladenosina (m6A) modificações de RNA são diversas e onipresentes entre os eucariotos. Eles ocorrem em mRNA, rRNA, tRNA e microRNA. Estudos recentes revelaram que essas modificações reversíveis de RNA afetam o splicing, tradução, degradação e localização do RNA. Múltiplos processos fisiológicos, como ritmos circadianos, pluripotência de células-tronco, fibrose, metabolismo de triglicerídeos e obesidade também são controlados por modificações m6A. Imunoprecipitação/sequenciamento, espectrometria de massa e northern blotting modificado são alguns dos métodos comumente empregados para medir modificações m6A. Aqui, apresentamos uma técnica de blotting nordestino para medir modificações de m6A. O protocolo atual fornece boa separação de tamanho de RNA, melhor acomodação e padronização para vários projetos experimentais e delineamento claro de modificações m6A em várias fontes de RNA. Embora as modificações m6A sejam conhecidas por terem um impacto crucial na fisiologia humana relacionada aos ritmos circadianos e à obesidade, seus papéis em outros estados (pato) fisiológicos não são claros. Portanto, as investigações sobre as modificações de m6A têm imensa possibilidade de fornecer informações importantes sobre a fisiologia molecular.

Após 14 dias em fase circadiana luz-escuro normais, os ratinhos do tipo selvagem foram colocadas em escuridão constante. Os ARN de fígado foram amostrados a intervalos de 4 horas e estudaram com Northern blotting modificado. A metilação de ARNr, ARNm, e pequenos RNAs foram claramente detectadas (Figura 2). A comparação entre os diferentes tempos circadianos (CT) pode ser calculado com precisão com o padrão de rRNA 18S. Houve oscilação circadiana robusto de m 6 levels em rRNA, mRNA, e pequenos RNAs. Para evitar a interferência oferecida por ARNr, RNAs poliadenilados pode ser purificado, tal como no passo 1.2.2. Após purificação, o rRNA pode ser largamente eliminada para permitir uma melhor visualização de outros ARN (Figura 3). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig1.jpg" /> <stron<html> g&gt; Figura 1: Montagem da unidade de transferência blot. A unidade de transferência capilar para blotting do ARN para a membrana é mostrado. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig2.jpg" /> Figura 2: Ritmo circadiano dos m 6 levels em camundongos C57BL / 6J. Esta figura mostra a M 6 Um blot de ARN total a partir de fígados de ratinhos de tipo selvagem sacrificados no primeiro dia da fase de escuro-escuro após 14 dias de uma fase de luz-escuro normal em intervalos de 4 h. A quantificação foi feita usando o m 6 A diferença de densidade de imagem entre 18S e 28S rRNA. O M 6 Uma abundância foi normalizada para a banda de ARNr 18S a partir do gel de formaldeído na parte inferior.et = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig3.jpg" /> Figura 3: Os m 6 borrões com ou sem rRNA. M representativas 6-blots de ARN total e ARN poliadenilado a partir de fígados de ratinhos do tipo selvagem são mostradas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1 </td><td colspan="3"> tampão 10x MOPS (pH 7,0, proteger da luz) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> MOPS </td><td> 41.85 </td><td> g </td><td> 0,2 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> O acetato de sódio </td><td> 4.1 </td><td> g </td><td>0,05 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> EDTA, sal dissódico </td><td> 3.7 </td><td> g </td><td> 0,01 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> água DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Total </td><td> 1 </td><td> eu </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Agita-se à temperatura ambiente </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="3"> tampão SSC 20x (pH 7,0) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> O cloreto de sódio </td><td> 175,3 </td><td> g </td><td> 3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> citrato trissódico </td><td> 88,3 </td><td> g </td><td> 0,3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> água DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Total </td><td> 1 </td><td> eu </td><td></td&gt; </tr><tr><td></td><td colspan="3"> Agita-se à temperatura ambiente, em seguida, autoclave </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="3"> Acompanhando Dye </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> tampão 10x MOPS </td><td> 500 </td><td> ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Ficoll 400 </td><td> 0,75 </td><td> g </td><td> 15% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> azul de bromofenol </td><td> 0,01 </td><td> g </td><td> 0,2% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> xileno cianol </td><td> 0,01 </td><td> g </td><td> 0,2% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> água DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Total </td><td> 5 </td><td> mL </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Armazenar a -20 ° C </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="3"> água DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Diluir proporção de 1: 1000 de DEPC em ddH2O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Agita-se durante a noite à temperatura ambiente, em seguida, autoclave </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="3"> tampão de amostra (proteger da luz) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> tampão 10x MOPS </td><td> 200 </td><td> ul </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 37% de formaldeído </td><td> 270 </td><td> ul </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> formamida </td><td> 660 </td><td> ul </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Armazenar a -20 ° C </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table> Tabela 1: Os tampões e soluções.

Um método de transferência Northern modificado para medir N 6 -methyladenosine (M 6) Um modificações em RNA é descrito. O actual método pode detectar modificações em diversos RNAs e controles sob vários modelos experimentais.

Um método para medir RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine modificações nas células e tecidos

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

O objetivo geral da técnica de blotting norte modificado é medir as modificações de N6-metiladenosina, n6A, no RNA e detectar modificações em diversos tipos de RNA. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre o papel da epigenética do RNA, como as modificações de N6-metiladenosina. A principal vantagem desta técnica é que ela proporciona uma separação eficaz do RNA, uma melhor padronização para os delineamentos experimentais e uma delimitação clara da modificação n6A nos RNAs.Este método pode fornecer informações sobre modificações n6A no RNA e também pode ser aplicado a outras modificações de RNA com diferentes anticorpos de detecção. Para iniciar o experimento, pulverize a solução de descontaminação de ribonuclease sobre toalhas de papel e limpe as pipetas e as superfícies da bancada do laboratório. Umedeça as toalhas de papel com água livre de nucleases e limpe novamente as pipetas e as superfícies da bancada do laboratório.Obtenha a solução de isolamento de RNA mantida a quatro graus Celsius e adicione um mililitro da solução a aproximadamente 75 miligramas de tecido de camundongo. Utilize um agitador magnético para homogeneizar o tecido. Em seguida, adicione 100 microlitros de 1-Bromo-3-cloropropano ou BCP por um mililitro de homogeneizado da amostra.Agite os tubos vigorosamente por 15 segundos e prossiga para o isolamento de RNA total. Utilizando um espectrofotômetro, determine a concentração de RNA observando a absorbância em 260 nanômetros e 280 nanômetros. Verifique a qualidade da amostra de RNA realizando eletroforese em gel de agarose 0,8%.Lave todo o equipamento de eletroforese com água contendo pirocarbonato de dietila ou água DEPC. Combine 2,5 gramas de agarose e, em seguida, 215 mililitros de água DEPC em um frasco Erlenmeyer e aqueça completamente a mistura em um forno de micro-ondas até sua completa fusão. Após a fusão da solução, adicione 12,5 mililitros de tampão MOPS 10X.E 22,5 mililitros de formaldeído a 37% no frasco. Em seguida, despeje a solução no aparelho de eletroforese com um pente de 1,5 milímetro de espessura. Usando um pente limpo, empurre as bolhas para as bordas do gel.Deixe o gel solidificar à temperatura ambiente. Em seguida, use o tampão de eletroforese MOPS 1X previamente preparado para enxaguar os poços do gel e realizar a pré-eletroforese. Carregue as amostras de RNA nos poços do gel e, então, realize a eletroforese.No dia seguinte, examine e fotografe o gel sob luz ultravioleta. Para preparar a transferência, corte o gel e remova a porção não utilizada. Prepare 500 mililitros de tampão SSC 10X (citrato de sódio e cloreto de sódio).Lave o gel duas vezes com tampão SSC 10X. Corte uma folha de papel filtro grande o suficiente para cobrir o gel. Corte quatro pedaços de papel filtro no mesmo tamanho do gel.Em seguida, corte uma folha de membrana de nylon com carga positiva no mesmo tamanho do gel. Faça um entalhe no gel e na membrana como marca para assegurar a orientação correta. Sature a membrana em tampão 2X SSC.Despeje 500 mililitros de tampão SSC 10X na bandeja de transferência. Coloque a folha grande de papel filtro sobre a placa de vidro e umedeça o papel filtro com o tampão de transferência. Em seguida, use uma pipeta para remover quaisquer bolhas.Embeba dois pedaços de papel-filtro pré-cortados em tampão de transferência e coloque-os no centro do papel-filtro. Remova todas as bolhas. Em seguida, posicione o gel com a face superior voltada para baixo sobre o papel-filtro e coloque a membrana sobre o gel, certificando-se de alinhar as ranhuras do gel e da membrana.Em seguida, coloque dois pedaços de papel-filtro pré-cortados sobre a membrana. Remova todas as bolhas entre as camadas. Aplique filme plástico ao redor do gel para garantir que as toalhas absorvam apenas o tampão que passa através do gel e da membrana.Em seguida, empilhe toalhas de papel sobre o papel filtro. Coloque uma placa de vidro grande sobre as toalhas e posicione um peso sobre a pilha, deixando o RNA transferir do gel para a membrana durante a noite. Após a transferência, mantenha a membrana úmida em tampão 2X SSC.Imersa duas folhas de papel filtro com tampão SSC 10X, depois coloque as folhas no cruzador UV. Certifique-se de que o lado onde a RNA foi absorvida esteja voltado para cima, então coloque a membrana sobre o papel filtro. Selecione o modo de cruzamento automático e pressione o botão de início para iniciar a irradiação.Examine a membrana e o gel com um capturador de imagem de gel UV para confirmar a transferência de RNA do gel para a membrana. Bloqueie a membrana em solução de leite desnatado a 5% em tampão TBST por uma hora à temperatura ambiente. Incube a membrana durante a noite em solução de anticorpo anti-m6A a quatro graus Celsius.No dia seguinte, lave a membrana três vezes com tampão TBST durante 15 minutos. Em seguida, incube a membrana na solução de anticorpo secundário de jumento anti-coelho conjugado com HRP por uma hora à temperatura ambiente. Após uma hora, lave a membrana três vezes com tampão TBST durante 15 minutos.Adicione o substrato de quimioluminescência aprimorado. Capture a quimioluminescência com um sistema digital de imagem. Por fim, prossiga para a quantificação de m6A e meça a intensidade quimioluminescente relativa de m6A utilizando o ImageJ. As RNAs do fígado de camundongo foram coletadas em intervalos de quatro horas e analisadas com a técnica de northern blot modificado.A metilação de RNAr, RNAm e pequenos RNAs foi claramente detectada. Ensaios representativos de hibridização para m6A foram realizados com RNA total e sem RNAr provenientes de fígados de camundongos selvagens. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em quatro dias, se for executada corretamente.Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da epigenética de RNA explorarem os impactos sobre a fisiologia humana relacionados ao ritmo circadiano e à obesidade.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aqui, descrevemos um protocolo para a caracterização bioquímica de enzimas de RNA-modificando o fermento, Mod5 e discutir como este protocolo poderia ser aplicado a outras enzimas RNA-modificando.

Um ensaio In Vitro para detectar a atividade de Transferase de tRNA-isopentenilo

Aqui nós apresentamos um protocolo para o clivagem dnazyme-dependente do RNA. Isto permite a análise rápida e local-dependente do RNA 2 '-O-methylation. Esta aproximação pode ser usada para a avaliação preliminar ou principal da atividade do snoRNA.

Análise DNAzyme-dependente de rRNA 2 '-O-methylation

Aqui, um ensaio in vitro anticorpo-livre para a análise direta da atividade do metiltransferase no RNA transcrito sintético ou in vitro é descrito.

Teste anticorpo-livre para a análise da atividade do methyltransferase do RNA

O ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado é um método à base de anticorpos usado para enriquecer para fragmentos de RNA metilado. Juntamente com sequenciamento profundo, leva à identificação de transcrições carregando a modificação m5C.

Ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado para estudar m5C modificação em Arabidopsis

Um método preciso e reprodutível para quantificação de nucleosídeos/nucleotídeos in vivo nas plantas é descrito aqui. Este método emprega um HPLC-MS/MS.

Preparação da amostra de plantas para medição de conteúdo nucleoídeo/nucleotídeo com hplc-MS/MS

O presente protocolo descreve a preparação e a medição quantitativa de arginina e metil-argininas livres e ligadas a proteínas por espectroscopia de 1RMN-H.

Explorando o metiloma de arginina por espectroscopia de ressonância magnética nuclear

As modificações pós-transcrição do RNA representam uma camada subestudada de regulação de tradução que recentemente foi ligada à plasticidade do sistema nervoso central. Aqui, a preparação da amostra e a abordagem de espectrometria de massa cromatografia líquida-tandem é descrita para caracterização simultânea de numerosas modificações de RNA em neurônios únicos.

Caracterizando modificações de RNA em neurônios únicos usando espectrometria de massa

O protocolo fornece instruções para modificar o RNA com sulfato de dimetilo para experimentos de perfil mutacional. Inclui sondagem in vitro e in vivo com dois métodos alternativos de preparação de bibliotecas.

Sondando a estrutura do RNA com perfil mutacional de sulfato de dimetilo com sequenciamento in vitro e em células

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar semi-quantitativamente os níveis globais de m⁶A usando dot blot. O RNA total é extraído, desnaturado, manchado em uma membrana de náilon, sondado com anticorpo anti-m⁶A e visualizado por quimioluminescência. A intensidade do sinal, quantificada pela análise em escala de cinza ImageJ, reflete a abundância relativa de metilação, proporcionando um fluxo de trabalho reprodutível para pesquisas.

Ensaio Dot Blot para Detectar Níveis Globais de Modificação do RNAN 6-metiladenosina

Esse protocolo fornece uma abordagem detalhada para avaliar os níveis de modificação m6Ade RNA específico usando MeRIP-qPCR.

Ensaio MeRIP-qPCR para Detecção de Níveis de Modificação M6Ade RNA Específico em Células de Osteossarcoma

Aprenda a técnica de northern blotting modificada para detectar modificações de m6A em RNA de tecidos de camundongo. Este método padronizado permite estudar epigenética de RNA e ritmos circadianos.

Um método para medir RNA

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