Medição paralela da expressão do gene relógio circadiano e hormonal secreção em culturas de células primárias humanas
11 de novembro de 2016
Aqui, descrevemos as configurações para monitorar em paralelo a bioluminescência circadiana e a atividade secretora das células das ilhotas humanas e miotubos primários. Para isso, empregamos a entrega do gene lentiviral de um repórter de relógio central de luciferase, seguido de sincronização in vitro e coleta de meio de saída por perifusão celular contínua.
O objetivo geral deste procedimento é a avaliação paralela da bioluminescência circadiana e da atividade secretora de células endócrinas primárias humanas cultivadas e sincronizadas en vitro. Este método pode ajudar a investigar o padrão temporal da secreção celular e como ela pode ser regulada por relógios circadianos autônomos de células. A principal vantagem desta técnica é que ela nos permite monitorar as luciferinas circadianas como atividade repórter e, simultaneamente, coletar meio de saída para medir os níveis de hormônios secretados e miocinas. Para introduzir repórteres de bioluminescência circadiana em células primárias por transdução lentiviral, primeiro, transfira as placas de Petri de 3,5 cm contendo mioblastos humanos a 30% a 50% de confluência para um gabinete de fluxo laminar. Substitua o meio de mioblasto humano por 2 mL de meio de crescimento. Em seguida, transduzir a cultura de células primárias pipetando a solução de lentivírus para o prato para obter uma multiplicidade de infecção igual a três. Incube as células durante a noite em uma incubadora de cultura de tecidos. Mude de meio no dia seguinte. Para obter a sincronização in vitro, adicione 10 ativadores micromolares de adenilil ciclase em 2 mL de meio por placa de Petri de 3,5 cm contendo as células primárias previamente transfectadas. Incube as células por 60 minutos a 37
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Visão Geral
Este estudo descreve métodos para monitorar a bioluminescência circadiana juntamente com a atividade secretora de células de ilhotas humanas e miótubos primários. A abordagem envolve a entrega gênica por lentivírus de um repórter de luciferase do relógio biológico central, seguida pela sincronização in vitro e perifusão contínua das células para coleta de meio.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Cronobiologia
Antecedentes
- Os ritmos circadianos desempenham um papel crucial nas funções celulares.
- O monitoramento da bioluminescência pode fornecer informações sobre a atividade celular.
- As células das ilhotas humanas são vitais para a secreção de insulina.
- Os miótubos primários são importantes para o estudo da fisiologia muscular.
Objetivo do Estudo
- Investigar a relação entre ritmos circadianos e atividade secretora.
- Desenvolver um método para monitoramento em tempo real de funções celulares.
- Aprimorar o entendimento dos processos metabólicos em células humanas.
Métodos Utilizados
- Entrega genética por lentivírus para expressão do gene repórter de luciferase.
- Sincronização in vitro de culturas celulares.
- Perfusão contínua para coleta de meio.
- Medição da bioluminescência para avaliação de ritmos circadianos.
Resultados Principais
- Monitoramento bem-sucedido da bioluminescência circadiana em células de ilhotas humanas.
- Atividade secretora demonstrada em miótubos primários.
- Estabelecimento de um método confiável para o estudo de ritmos celulares.
- Fornecimento de insights sobre a interação entre biologia circadiana e função celular.
Conclusões
- O estudo oferece uma abordagem inovadora para monitorar atividades celulares em tempo real.
- Os resultados contribuem para a compreensão das influências circadianas no metabolismo.
- Aplicações potenciais na pesquisa sobre diabetes e na fisiologia muscular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A medição paralela da expressão de genes do relógio circadiano e da secreção hormonal em culturas primárias de células humanas permite a investigação direta da regulação temporal nos sistemas endócrino e muscular humanos. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao vincular osciladores circadianos moleculares a saídas funcionais de secreção. A integração dessas medições na fase de descoberta apoia o avanço ajustado ao risco de programas de metabolismo e cronobiologia em todo o portfólio.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a desmistificação mecanicista por meio da correlação entre a atividade de genes-relógio e a secreção de hormônios e miocinas em células humanas primárias.
- Apoia a validação funcional de alvos por meio da interrupção de genes-relógio essenciais e quantificação dos efeitos secretórios downstream.
- Facilita a confiança preditiva na seleção de vias para alvos metabólicos e endócrinos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Estabelece sistemas de células primárias validados e sincronizados para o desenvolvimento robusto de ensaios.
- Fornece leituras quantitativas e resolvidas no tempo da expressão gênica e da atividade secretora.
- Permite a avaliação reprodutível dos efeitos de compostos ou perturbações genéticas sobre as saídas reguladas pelo ritmo circadiano.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha descobertas in vitro com a fisiologia humana relevante para doenças, utilizando células primárias de ilhotas e músculo.
- Apoia a descoberta translacional de biomarcadores ao associar a desregulação do relógio molecular a fenótipos funcionais de secreção.
- Oferece continuidade do estágio de descoberta até a validação pré-clínica na pesquisa metabólica e de cronobiologia.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método conecta a fase inicial de descoberta e a pesquisa pré-clínica ao permitir a verificação de hipóteses sobre a regulação circadiana em células primárias humanas, apoiando tanto a validação de alvos quanto a continuidade translacional.
- Biologia da Descoberta: Permite o teste direto da função de genes circadianos e seu impacto sobre vias secretoras.
- Triagem: Fornece modelos celulares primários sincronizados e prontos para ensaios, com saídas quantitativas para avaliação de compostos.
- Análises: Gera dados de bioluminescência e secreção com resolução temporal para comparação estatística robusta entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a perturbação do relógio molecular a fenótipos secretórios relevantes para doenças em células humanas.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável para avaliar a regulação circadiana em diversos tipos celulares primários e alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho de medição paralelos e de longo prazo em células humanas primárias.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper ao vincular saídas moleculares e funcionais em sistemas relevantes para doenças.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de programas de metabolismo e cronobiologia.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em transdução lentiviral, cultura de células primárias e medição de bioluminescência.
- Necessita de acesso a sistemas de perfusão sincronizados e ensaios sensíveis de hormônios/miocinas.
- Exige padronização entre equipes para coleta reprodutível de dados de curso temporal.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes tipos celulares primários ou pontos finais secretórios.
- A estabilidade do cultivo de longo prazo e do repórter deve ser validada para cada aplicação.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
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Continuos Long-term Circadian Bioluminescence Recording, Performed in Parallel with the Assessment of Hormone Secretion in Living Human Primary Cells
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Parallel Assessment of Circadian Bioluminescence Recording and Hormone Secretion Profiles in Synchronized Human Secretory Primary Cells
4:37
Results: Evaluation of the Clock Regulation of Basal IL-6 Secretion by Human Myotubes
5:33
Conclusion
