The Loop arteriovenosa (AV) em um modelo animal pequeno para estudar angiogénese e Engenharia de tecido vascularizado

O objetivo geral dessa abordagem microcirúrgica é gerar um circuito arteriovenoso para a engenharia de tecidos axiolares, vascularizados e translacionáveis, bem como para a análise da vascularização in vivo e em ambiente isolado e bem caracterizado. Com este método, podemos utilizar nossos próprios corpos como biorreatores vivos para a geração de diferentes tipos de tecidos vascularizados axialmente adaptados às necessidades individuais de cada paciente. A principal vantagem dessa técnica é que o tecido gerado pode ser transplantado com seu acesso vascular e conectado aos vasos locais no sítio do receptor para suprimento imediato de oxigênio e nutrientes.

Além dos estudos de engenharia de tecidos, este método pode fornecer informações sobre os processos de angiostenose em um organismo vivo. Também pode ser aplicado a situações patológicas, como a angiogênese no câncer. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido à alta complexidade da cirurgia, como a microanastomose do vaso submilimétrico.

Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando nos deparamos com casos clínicos com defeitos teciduais extensos, que exigiam o transplante de tecido vascularizado aloenxertado, criando uma mobilização significativa no local doador. Após confirmar a anestesia adequada, pese o rato para calcular as doses dos medicamentos. Em seguida, aplique pomada oftálmica para prevenir o ressecamento durante a anestesia.

Após administrar medicamentos analgésicos e antibióticos, posicione a rata sobre uma placa aquecida e administre isoflurano continuamente. Em seguida, confirme novamente o nível de anestesia utilizando o teste de compressão do dedo do pé. Se possível, utilize também oximetria de pulso para verificar o nível de anestesia da rata.

Prossiga raspando as partes internas das patas traseiras. Em seguida, desinfete a área cirúrgica com esfregações alternadas de betadine e álcool. Depois, afaste as patas traseiras e fixe-as com fita adesiva.

Por fim, posicione a rata sob um microscópio cirúrgico e cubra-a. Prossiga com a cirurgia utilizando procedimentos estéreis. Abra a pele na parte central da coxa esquerda com uma incisão longitudinal, da região acima do joelho até a virilha, usando um bisturi.

Em seguida, utilizando tesoura cirúrgica e pinças microcirúrgicas, corte o tecido subcutâneo e a fáscia em camadas com cerca de três centímetros de comprimento. Pare quando o feixe vascular femoral for exposto, desde a artéria pélvica na virilha até o joelho. Em seguida, utilizando tesoura de tecido adiposo e pinças microcirúrgicas, separe os vasos e remova o tecido adiposo.

Se necessário, coagule os ramos laterais utilizando coagulação elétrica. Após a conclusão, cubra a área operada com uma compressa úmida e repita o procedimento no lado direito do rato. Agora que o primeiro procedimento foi concluído de forma simétrica, inicie a colheita do enxerto venoso.

Primeiro, ligue a veia femoral direita usando coagulação elétrica nas extremidades proximal e distal para obter um enxerto de cerca de um a 1,5 centímetros. Em seguida, remova o enxerto venoso com pinça microcirúrgica. Para dilatar a abertura do enxerto venoso, utilize o dilatador de vasos.

Em seguida, lave o enxerto venoso com uma solução de heparina utilizando uma cânula de irrigação. Transfira o enxerto desprovido de tecido para a coxa esquerda e cubra o campo cirúrgico no lado direito com uma compressa úmida. A seguir, ligue a veia femoral no lado esquerdo proximalmente na região inguinal com uma pinça para microvasos.

Em seguida, coagule a veia femoral distalmente no joelho superior antes da bifurcação. Para a anastomose, conecte a extremidade proximal do enxerto venoso com a extremidade proximal da veia utilizando uma técnica de extremidade com extremidade com sutura 11-0. Comece posicionando os dois primeiros pontos nas posições 12 horas e seis horas.

Em seguida, coloque mais dois a três pontos entre esses pontos no lado frontal. E então coloque mais dois a três pontos no lado traseiro. A anastomose dos vasos em alça é a etapa mais crítica do protocolo.

É importante garantir que os pontos sejam realizados com a maior precisão possível para reduzir o risco de fechamento dos vasos em alça. Em seguida, ligue a artéria femoral com uma pinça para microvasos e use coagulação eletrônica, de forma semelhante ao que é feito com a veia femoral. Antes de prosseguir, certifique-se de que os vasos em alça não estejam torcidos.

Em seguida, anastomose a extremidade distal do enxerto venoso com a extremidade proximal da artéria, utilizando a mesma técnica de sutura demonstrada anteriormente. Após a segunda anastomose, administre 25 UI de heparina por via intravenosa. Agora, verifique cuidadosamente se os vasos do circuito estão torcidos e, então, remova os grampos.

Observe o alça por cerca de cinco minutos, verificando vazamentos e perviedade. Se houver perviedade, o alça se expandirá e o pulso da artéria será visível. Durante a observação, pingue papaverina sobre os vasos para prevenir espasmos vasculares.

Em seguida, preencha previamente a câmara de implantação com a primeira metade da mistura da matriz, cerca de meio mililitro. Então, incorpore o loop na câmara de implantação. Feche a entrada da câmara com dois coágulos de fibrina e preencha a câmara com a segunda metade da mistura da matriz, obtendo um volume total de um mililitro.

Agora, posicione a câmara na coxa, feche a câmara com sua tampa e fixe a tampa com um ponto 6-0 não absorvível. Em seguida, fixe a câmara de implante à coxa com um ponto 6-0 não absorvível adicional. Interrompa qualquer sangramento utilizando coagulação elétrica.

Por fim, feche a pele com suturas absorvíveis 4-0 e cubra a ferida com spray de alumínio. Para fins de engenharia de tecido ósseo, diversos substitutos ósseos diferentes foram implantados no modelo de pequeno animal de laço A-V em rato. A vascularização foi observada utilizando tomografia computadorizada micro 3D.

A pré-vascularização de uma matriz óssea trabecular bovina processada por seis semanas levou a uma sobrevivência superior dos osteoblastos injetados. Os loops foram coletados, seccionados e corados em diferentes pontos temporais após o implante. Por exemplo, a coloração H e E mostrou que o uso de um substituto ósseo de hidroxiapatita e beta fosfato tricálcico com células-tronco mesenquimais resultou em muitas conexões vasculares dentro de seis semanas.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cinco a seis horas, se for executada corretamente. Após este procedimento, uma grande variedade de diferentes fatores celulares ou anticorpos pode ser implantada para estudar uma ampla gama de condições. Esta técnica também funciona em um modelo de grande animal, o circuito venoso de ovelha.

Portanto, isso deve permitir que pesquisadores gerem tecidos vascularizados em grandes quantidades clinicamente relevantes. Este modelo pode proporcionar a oportunidade de estudar a vascularização sob condições patológicas. Por exemplo, as influências de diversos fatores de crescimento e células durante a formação da rede vascular tumoral poderiam ser investigadas.