Perturbações de circulação miRNAs na Síndrome do Cólon Irritável detectada usando um multiplexado de alta capacidade: Plataforma Gene Expression

O objetivo geral deste protocolo de quantificação de ácido nucleico multiplex é quantificar digitalmente a expressão de microRNA no sangue total. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no estudo de distúrbios digestivos. Ajuda na identificação de mecanismos moleculares desregulados e assinaturas de biomarcadores, como microRNAs.

A principal vantagem dessa técnica é que a quantificação de microRNA não depende da amplificação. Essa tecnologia conta digitalmente alvos moleculares e é amplamente automatizada. Para purificar o RNA total, descongele e incube amostras de sangue total previamente coletadas e congeladas por duas horas.

Use um rotor de caçamba oscilante para centrifugar os tubos a 5.000 vezes g em temperatura ambiente por dez minutos. Em seguida, remova os sobrenadantes despejando-os ou pipetando-os cuidadosamente em um tubo de resíduos, tomando cuidado para não perturbar o pellet. Adicione quatro mililitros de água sem RNase ao pellet.

Recoloque a tampa com segurança e vortex até que o pellet esteja visivelmente dissolvido. Em seguida, centrifugue novamente o tubo e remova o sobrenadante. Em seguida, adicione 350 microlitros de tampão BM1 ao pellet e ao vórtice até que o pellet esteja visivelmente dissolvido.

Em seguida, transfira a amostra para um tubo de processamento de dois mililitros para extração automatizada de RNA total. Usando um kit de extração de RNA disponível comercialmente, realize uma purificação automatizada de RNA intracelular, incluindo microRNA da amostra de sangue total, carregando pontas de pipeta pré-carregadas, tubos de centrífuga, tampões e reagentes fornecidos no kit de purificação de RNA no sistema robótico de extração de RNA. No menu de seleção de protocolos, escolha o protocolo Blood miRNA PartA e inicie a execução.

Conclua a extração de RNA e armazene as amostras de acordo com o protocolo de texto. Prepare amostras de microRNA usando primeiro água livre de RNase para normalizar 12 amostras de RNA para 33 nanogramas por microlitro. Com água livre de nuclease, prepare uma diluição de 1 em 500 dos controles de microRNA fornecidos no kit de ensaio e mantenha no gelo.

Em seguida, prepare a mistura mestre de recozimento combinando 13 microlitros de tampão de recozimento, 26 microlitros de reagente micro R-tag e 6,5 microlitros de controles de microRNA. Para cada um dos 12 tubos de tira de 0,2 mililitros, adicione 3,5 microlitros da mistura master de recozimento e, em seguida, adicione 3 microlitros da amostra de RNA. Agite os tubos para misturar, gire-os a 2000 vezes g com uma mini microcentrífuga de bancada e opere os tubos em um termociclador usando o seguinte programa.

Em seguida, prepare uma mistura mestre de ligação combinando três microlitros do tampão de ligação e 19,5 microlitros de PEG. Em seguida, adicione 2,5 microlitros da mistura principal de ligação a cada uma das reações. Depois de misturar e girar os tubos, retorne-os ao termociclador a 48 graus Celsius por cinco minutos.

Em seguida, adicione um microlitro de ligase diretamente a cada amostra ainda no bloco termociclador e incube os tubos usando o seguinte programa. Misture e gire suavemente os tubos e adicione um microlitro de enzima de limpeza de ligadura a cada amostra. Em seguida, incube os tubos no termociclador conforme mostrado aqui.

Após a incubação, adicione 40 microlitros de água livre de RNase às amostras antes de misturá-las e girá-las. Para realizar a hibridização de microRNA, descongele os conjuntos de sondas repórter e captura fornecidos no gelo e gire-os. Adicione 130 microlitros de buffer de hibridização ao Conjunto de Códigos Reporter 2 e misture para criar a mistura principal de hibridização.

Em 12 novos tubos de tiras de 0,2 mililitro, adicione 20 microlitros da mistura master de hibridização. Desnature as amostras de microRNA recém-preparadas a 85 graus Celsius por cinco minutos e resfrie-as no gelo. Em seguida, adicione 5 microlitros das amostras de microRNA a cada um dos tubos de tira contendo a mistura master de hibridização.

Programe o termociclador a 65 graus Celsius, a uma temperatura calculada por volume de 30 microlitros, e a tampa aquecida na configuração de tempo Forever para que não diminua para 4 graus Celsius no final da corrida. Adicione 5 microlitros do conjunto de sonda de captura a cada tubo e misture. Então, depois de girá-los para baixo, coloque imediatamente os tubos no termociclador a 65 graus Celsius.

Incubar as amostras durante um mínimo de 12 horas e um máximo de 30 horas. Configure a estação de preparação aquecendo primeiro o cartucho e as placas à temperatura ambiente. Em seguida, gire as placas.

Para carregar a estação de preparação, abra a porta da estação e carregue as placas de reagente, cartucho, pontas de pipeta, amostras preparadas em tubos de tira de 0,2 mililitro e dois tubos vazios de 0,2 mililitro de 12 tubos nos locais apropriados no robô. Remova as tampas dos tubos de tira e a tampa da placa de reagente. Em seguida, feche a porta da estação de preparação e execute o ensaio apropriado no painel de controle.

Para visualizar e contar os códigos de barras dos complexos tripartidos imobilizados e orientados, remova o cartucho da estação de preparação, use a tampa fornecida para selá-lo e coloque-o no analisador digital em qualquer slot disponível. Use a tela sensível ao toque para criar um arquivo de definição de cartucho ou CDF. Certifique-se de que o arquivo de biblioteca do relator apropriado seja atribuído a cada amostra no CDF.

Quando a digitalização estiver concluída, baixe os arquivos de dados do analisador digital usando uma unidade USB ou por e-mail, antes de processar e analisar os dados, de acordo com o protocolo de controle de qualidade e análise associado. O sistema de ensaio de plataforma de expressão gênica reduz o ruído técnico por meio de sua natureza altamente automatizada, e a química exclusiva que ele usa produz dados de expressão gênica de alta precisão. As réplicas técnicas mostradas aqui demonstram a alta reprodutibilidade na quantificação da expressão de microRNAs endógenos e virais que é possível.

Usando este método, microRNAs humanos endógenos e codificados por vírus que mostram desvio da expressão esperada, conforme definido por participantes saudáveis do estudo, podem ser identificados como alvos de interesse na SII. A precisão e a sensibilidade do método permitem que perturbações entre alvos de baixa expressão sejam detectadas, e perturbações sutis também podem ser observadas de forma confiável. Esses números mostram algumas das perturbações nos microRNAs circulantes na SII e nos subtipos de SII, em comparação com controles saudáveis.

Os dois microRNAs diferencialmente elevados mais significativos em participantes da SII são apresentados aqui. As curvas neste gráfico de violino indicam a frequência das contagens de miR-150. As barras verticais representam o primeiro e o terceiro quartis e o quadrado vermelho indica a contagem mediana.

Seguindo este procedimento, ensaios personalizados mais direcionados baseados na mesma tecnologia podem ser realizados para validar assinaturas de biomarcadores em coortes maiores e explorar as associações essenciais de RNA e proteína. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores no campo da pesquisa biomédica desenvolvessem rapidamente, com precisão e exatidão, painéis de biomarcadores diagnósticos para doenças.