Perturbações de circulação miRNAs na Síndrome do Cólon Irritável detectada usando um multiplexado de alta capacidade: Plataforma Gene Expression
30 de novembro de 2016
Descrevemos o uso de uma plataforma de expressão gênica multiplexada de alto rendimento que quantifica a expressão gênica por código de barras e contagem de moléculas em substratos biológicos sem a necessidade de amplificação. Usamos a plataforma para quantificar a expressão de microRNA (miRNA) no sangue total em indivíduos com e sem síndrome do intestino irritável.
O objetivo geral deste protocolo de quantificação multiplex de ácidos nucleicos é quantificar digitalmente a expressão de microRNAs em sangue total. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no estudo de distúrbios digestivos. Ele auxilia na identificação de mecanismos moleculares desregulados e assinaturas de biomarcadores, como os microRNAs.
A principal vantagem desta técnica é que a quantificação de microRNA não depende da amplificação. Esta tecnologia conta digitalmente os alvos moleculares e é amplamente automatizada. Para purificar o RNA total, descongele e incube as amostras de sangue total previamente coletadas e congeladas por duas horas.
Utilize um rotor de balde oscilante para centrifugar os tubos a 5.000 × g, em temperatura ambiente, durante dez minutos. Em seguida, remova os sobrenadantes cuidadosamente derramando ou pipetando para um tubo de resíduo, tomando cuidado para não perturbar o pellet. Adicione quatro mililitros de água livre de RNase ao pellet.
Recoloque firmemente a tampa e vortex até que o precipitado esteja visivelmente dissolvido. Em seguida, centrifugue o tubo novamente e remova o sobrenadante. A seguir, adicione 350 microlitros de tampão BM1 ao precipitado e vortex até que o precipitado esteja visivelmente dissolvido.
Em seguida, transfira a amostra para um tubo de processamento de dois mililitros para extração automatizada de RNA total. Utilizando um kit de extração de RNA comercialmente disponível, realize uma purificação automatizada de RNA intracelular, incluindo microRNA da amostra de sangue total, carregando ponteiras de pipeta pré-carregadas, tubos de centrífuga, tampões e reagentes fornecidos no kit de purificação de RNA no sistema robótico de extração de RNA. No menu de seleção de protocolos, escolha o protocolo Blood miRNA PartA e inicie a execução.
Conclua a extração de RNA e armazene as amostras de acordo com o protocolo descrito no texto. Prepare as amostras de microRNA utilizando primeiro água livre de RNase para normalizar 12 amostras de RNA para 33 nanogramas por microlitro. Com água livre de nucleases, prepare uma diluição de 1 para 500 dos controles de microRNA fornecidos no kit do ensaio e mantenha-os no gelo.
Em seguida, prepare a mistura mestra de anelamento combinando 13 microlitros de tampão de anelamento, 26 microlitros do reagente micro R-tag e 6,5 microlitros dos controles de microRNA. Em cada um dos 12 tubos em fita de 0,2 mililitros, adicione 3,5 microlitros da mistura mestra de anelamento e, em seguida, adicione 3 microlitros da amostra de RNA. Agite levemente os tubos para homogeneizar, centrifugue-os a 2000 × g em uma microcentrífuga de bancada e coloque-os em um termociclador utilizando o seguinte programa.
Em seguida, prepare uma mistura mestra de ligação combinando três microlitros do tampão de ligação e 19,5 microlitros de PEG. Então, adicione 2,5 microlitros da mistura mestra de ligação a cada uma das reações. Após misturar e centrifugar brevemente os tubos, retorne-os ao termociclador a 48 graus Celsius por cinco minutos.
Em seguida, adicione um microlitro de ligase diretamente a cada amostra ainda no bloco do termociclador e incube os tubos usando o seguinte programa. Misture suavemente e centrifugue brevemente os tubos, e adicione um microlitro de enzima de purificação da ligação a cada amostra. Então, incube os tubos no termociclador conforme mostrado aqui.
Após a incubação, adicione 40 microlitros de água livre de RNase às amostras antes de misturá-las e centrifugá-las. Para realizar a hibridização de microRNA, descongele os conjuntos de sondas repórter e de captura fornecidos sobre gelo e centrifugue-os. Adicione 130 microlitros de tampão de hibridização ao Conjunto de Código Repórter 2 e misture para criar a mistura mestra de hibridização.
Em 12 novos tubos em tira de 0,2 mililitro, adicione 20 microlitros da mistura mestra de hibridização. Desnature os amostras de microRNA recém-preparadas a 85 graus Celsius por cinco minutos e resfrie-as em gelo. Em seguida, adicione 5 microlitros das amostras de microRNA a cada um dos tubos em tira contendo a mistura mestra de hibridização.
Configure o termociclador para 65 graus Celsius, com temperatura calculada para um volume de 30 microlitros, e a tampa aquecida na configuração de tempo "Forever", para que não reduza a temperatura até 4 graus Celsius ao final do ciclo. Adicione 5 microlitros do conjunto de sondas de captura a cada tubo e misture. Em seguida, após centrifugar brevemente, coloque imediatamente os tubos no termociclador a 65 graus Celsius.
Incube as amostras por não menos que 12 horas e não mais que 30 horas. Prepare a estação de preparo aquecendo primeiro a cartela e as placas à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugue as placas.
Para carregar a estação de preparo, abra a porta da estação e coloque as placas de reagentes, o cartucho, as ponteiras para pipeta, as amostras preparadas em tubos de fita de 0,2 mililitro e dois tubos de fita vazios de 0,2 mililitro com 12 tubos, nos locais apropriados do robô. Remova as tampas dos tubos de fita e a tampa da placa de reagentes. Em seguida, feche a porta da estação de preparo e execute o ensaio apropriado no painel de controle.
Para visualizar e contar os códigos de barras dos complexos tríplices imobilizados e orientados, remova a cartela da estação de preparo, use a tampa fornecida para selá-la e coloque-a no analisador digital em qualquer slot disponível. Use a tela sensível ao toque para criar um arquivo de definição de cartela, ou CDF. Certifique-se de que o arquivo da biblioteca de marcadores apropriado seja atribuído a cada amostra no CDF.
Após a conclusão da digitalização, baixe os arquivos de dados do analisador digital utilizando uma unidade USB ou por e-mail, antes de processar e analisar os dados, de acordo com o protocolo associado de controle de qualidade e análise. O sistema de ensaio da plataforma de expressão gênica reduz o ruído técnico por meio de sua natureza altamente automatizada, e a química exclusiva que utiliza produz dados de expressão gênica de alta precisão. Os replicados técnicos mostrados aqui demonstram a alta reprodutibilidade possível na quantificação da expressão de microRNAs endógenos e virais.
Utilizando este método, microRNAs codificados pelo vírus e microRNAs humanos endógenos que apresentam desvio na expressão esperada, conforme definido por participantes saudáveis do estudo, podem ser identificados como alvos de interesse na SII. A precisão e sensibilidade do método permitem detectar perturbações entre alvos de baixa expressão, e perturbações sutis também podem ser observadas com confiabilidade. Essas figuras mostram algumas das perturbações nos microRNAs circulantes na SII e em seus subtipos, em comparação com controles saudáveis.
Os dois microRNAs diferencialmente elevados mais significativos em participantes com SII são apresentados aqui. As curvas neste gráfico de violino indicam a frequência de contagens para o miR-150. As barras verticais representam o primeiro e o terceiro quartis, e o quadrado vermelho indica a contagem mediana.
Após este procedimento, ensaios personalizados mais direcionados, baseados na mesma tecnologia, podem ser realizados para validar assinaturas de biomarcadores em coortes maiores e explorar as associações essenciais de RNA e proteínas. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de pesquisa biomédica desenvolvessem rapidamente painéis de biomarcadores diagnósticos para doenças, com precisão e exatidão.
Visão Geral
Este artigo apresenta uma plataforma multiplexada de alto rendimento para expressão gênica projetada para quantificar a expressão de microRNA em amostras de sangue total. O método permite medições precisas sem amplificação, tornando-o adequado para o estudo de condições como a síndrome do intestino irritável.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Análise da expressão gênica
- Quantificação de microRNA
- Pesquisa sobre distúrbios digestivos
Contexto
- Os microRNAs desempenham um papel crucial na regulação gênica.
- Compreender sua expressão pode fornecer informações sobre várias doenças.
- Os métodos atuais frequentemente dependem da amplificação, o que pode introduzir variabilidade.
- Este estudo tem como objetivo superar essas limitações com uma abordagem inovadora.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para a quantificação digital de microRNA no sangue.
- Identificar mecanismos moleculares desregulados na síndrome do intestino irritável.
- Estabelecer assinaturas de biomarcadores para distúrbios digestivos.
Métodos Utilizados
- Extração automatizada de RNA de amostras de sangue total.
- Preparação de amostras de microRNA utilizando reagentes específicos.
- Processos de hibridização e ligação para detecção de microRNA.
- Análise digital de dados de expressão gênica utilizando uma plataforma especializada.
Resultados Principais
- O método demonstrou alta precisão na quantificação dos níveis de microRNA.
- Replicatas técnicas mostraram reprodutibilidade nos resultados.
- Identificou microRNAs que se desviam dos perfis de expressão saudáveis.
- Perturbações sutis em alvos de baixa expressão foram detectadas com confiabilidade.
Conclusões
- A plataforma multiplex fornece uma ferramenta robusta para o estudo de microRNAs no sangue.
- Pode auxiliar na compreensão da base molecular de distúrbios digestivos.
- Essa abordagem pode levar à descoberta de novos biomarcadores para a síndrome do intestino irritável.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Esta plataforma multiplexada de alto rendimento para expressão gênica permite a quantificação robusta e livre de amplificação de miRNAs circulantes, apoiando a descoberta de biomarcadores em distúrbios digestivos, como a síndrome do intestino irritável. Ao fornecer alta sensibilidade e reprodutibilidade na detecção de alterações em miRNAs de baixa expressão, o método aumenta a confiança na validação de alvos e reduz a ambiguidade mecanicista na fase inicial de descoberta. Seu fluxo de trabalho automatizado e abordagem de contagem digital melhoram a padronização e escalabilidade do ensaio para equipes multidisciplinares de P&D.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a identificação de miRNAs circulantes disregulados como possíveis biomarcadores na SII.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica por meio de quantificação precisa e livre de amplificação, que minimiza a variabilidade técnica.
- Valor Preditivo: Facilita a detecção de pequenas perturbações nos miRNAs, aumentando a confiança na relevância do alvo e nas decisões de triagem de portfólio.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera dados quantitativos altamente reprodutíveis de expressão de miRNA adequados para padronização de ensaios e desenvolvimento de painéis de biomarcadores.
- Valor Operacional: Reduz os efeitos do pesquisador por meio da preparação de amostras e processamento robótico em grande parte automatizados, aumentando a produtividade e a consistência.
- Escalabilidade: Permite análise multiplex de até 800 transcritos por reação, possibilitando triagem eficiente de assinaturas de miRNA em coortes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Apoia a validação de biomarcadores de miRNA circulantes descobertos em amostras humanas para investigação pré-clínica adicional.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a correlação entre alterações na expressão de miRNA e subtipos da doença, auxiliando na compreensão fisiopatológica.
- Confiabilidade Preditiva: Permite a detecção confiável de miRNAs de baixa abundância, melhorando a sensibilidade do biomarcador e reduzindo o risco de falsos negativos em estudos translacionais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a triagem de biomarcadores orientada por hipóteses até a validação de ensaios, apoiando a progressão desde a descoberta inicial até a identificação de alvos em pesquisas sobre distúrbios digestivos.
- Biologia da Descoberta: Permite a verificação de hipóteses mediante a quantificação de alterações na expressão de miRNAs em sangue total, esclarecendo as vias moleculares disreguladas na SII.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas prontas para ensaio, com alta linearidade e sensibilidade, apoiando a avaliação confiável de compostos ou biomarcadores.
- Análises: Fornece contagens digitais de códigos de barras e dados de expressão normalizados que facilitam a comparação estatística entre condições e coortes.
- Pesquisa Translacional: Conecta os achados de miRNAs circulantes com a relevância da doença, apoiando a continuidade do biomarcador até a validação pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável e automatizada para perfilagem de miRNAs, aplicável em diversas áreas terapêuticas além dos distúrbios gastrointestinais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir o ruído técnico e permitir a detecção de alterações em miRNAs de baixa expressão.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a padronização por meio da automação, minimizando efeitos de lote e variabilidade entre usuários.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de avanço ou interrupção ao fornecer dados robustos de biomarcadores, reduzindo o risco de falhas em estágios avançados devido a alvos mal validados.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de biomarcadores de miRNA com base em alterações de expressão reprodutíveis e quantificáveis em amostras clinicamente relevantes.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manuseio de ácidos nucleicos, sistemas automatizados de manipulação líquida e análise digital de imagens para quantificação precisa de miARNs.
- Depende do acesso a estações robóticas de preparo, analisadores digitais e conjuntos proprietários de sondas fluorescentes com códigos de barras coloridos.
- Necessita padronização entre equipes nos protocolos de coleta de amostras, normalização de RNA e hibridização para garantir a comparabilidade dos dados.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o ensaio a diferentes biofluidos ou tipos de tecidos além do sangue total.
- Limitado pela necessidade de reagentes e equipamentos especializados, o que pode restringir sua adoção em ambientes com poucos recursos, apesar da alta reprodutibilidade.
