Name: Manipulação neurofarmacologia de contido e vôo livre abelhas do mel, Apis mellifera (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Aprenda métodos de administração de fármacos em abelhas Apis mellifera, incluindo injeções no tórax, ocelo e trato ocelar, além de técnicas orais e por volatilização. Esses protocolos possibilitam estudos neurobiológicos precisos em organismos não modelo.

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Este projeto foi financiado pela DP0986021 de concessão ARC e pela 585442 de concessão do NHMRC. A ABB é apoiada por uma ARC Future Fellowship (FT140100452). O JAP é apoiado por uma bolsa iMQRES concedida pela Macquarie University e por um DAAD-Doktorandenstipendium concedido pelo Serviço Alemão de Intercâmbio Acadêmico. O JMD é apoiado pelo CNRS e pela Universidade Paul Sabatier.

1. Drug Administration para as abelhas aproveitou <ol><li> O tratamento oral <ol><li> Preparar uma solução 1,5 M de sacarose através da mistura de 257 g de sacarose com 500 ml de água (que é mais fácil de dissolver esta quantidade de sacarose em água a ferver). Armazenamento da solução de sacarose a 4 ° C até à sua utilização. NOTA: Solução de sacarose fornece um ambiente muito hospitaleiro para certos microorganismos e, portanto, facilmente torna-se contaminado e intragável para as abelhas. solução de sacarose em massa pode ser dividido em alíquotas e armazenado a -20 ° C até à sua utilização. </li><li> Decidir sobre uma dose droga apropriada (como alcançá-lo, é abordado na seção de discussão abaixo), e preparar uma solução tal que a dose droga preferida é dissolvido em 20 mL da solução de sacarose (por exemplo, para fornecer 20 mg, diluir droga a uma proporção de 1 mg / ml). abelhas arnês de acordo com Felsenberg et al. (2011) 16. Faça este passo, pelo menos, 12 horas antes do tratamento de drogas para garantir que as abelhas não são mais estressado out de aproveitamento quando a solução de fármaco é apresentada. NOTA: Para obter resultados mais consistentes, o melhor é matar de fome as abelhas (colocando as abelhas aproveitado em uma incubadora a 34 ° C e 70% de umidade) O / N. </li><li> Usando uma micropipeta, toque em uma gota de água de sacarose 1,5 M à antena de uma abelha aproveitada. Quando a tromba é estendido, toque em uma gota de 20 mL de 1,5 M de sacarose contendo a droga diretamente para a tromba da abelha. Certifique-se a abelha consome tudo. Como o controle do veículo usar a solução 1,5 M de sacarose sem drogas adicionado. NOTA: A quantidade de solução de sacarose pode ter de ser ajustada com base nos planos experimentais. Se appetitive condicionado destina-se, alimentando as abelhas apenas antes do treino irá interferir com a capacidade de resposta das abelhas. </li><li> Descarte ou anular as abelhas que não consomem toda a sacarose. NOTA: Se um grande número de abelhas deixar de beber a solução de sacarose, o horário de alimentação pode ter de ser ajustada. </li></ol></li><li> Injecção no tórax <ol><li> Prepare droga em mel de abelha Ringer 17 da seguinte forma: <ol><li> Misture e autoclave 7,45 g de NaCl, 0,448 g de KCl, 0,812 g de MgCl 2, 0,735 g de CaCl 2, 54,72 g de sacarose, 4,95 g de D-glucose, e 2,48 g de HEPES em 1.000 ml de água. Tenha cuidado ao armazenar Ringer, pois é facilmente contaminado. Alíquotas e armazenamento de Ringer a -20 ° C até à sua utilização. </li><li> Dissolve-se o fármaco em solução de Ringer e depois dilui-se de modo a que a quantidade desejada está presente em 5 ul. Como um exemplo, se as abelhas são para ser tratados com 5 ug de um fármaco, um g pode ser inicialmente dissolvido em 1 ml de Ringer, antes de ser diluída a 1: 1000 em solução de Ringer para um final de 1 ug / uL. NOTA: Como alternativa, disponível comercialmente de PBS (fosfato tamponado Salin) pode ser usado em vez de solução de Ringer. </li></ol></li><li> Fazer uma microscalpel por romper o canto de uma lâmina de dois gumes com lâminaum suporte de lâmina. Fixe o fragmento de lâmina para um suporte de lâmina para que ele faz um bom lâmina com um ponto de extremidade afiada. </li><li> Sob um microscópio estereoscópico, use cuidadosamente o microscalpel para cortar um buraco 2 milímetros pouco acima do escutelo, ao lado do processo de asa posterior do tórax de uma abelha. Evitar o corte muito profundo, pois isso poderia prejudicar músculos de vôo, e ter cuidado para evitar as dobradiças laterais. Idealmente, só reduzir três lados, de modo que a aba de cutícula pode depois ser dobrada para trás para fechar o local da lesão. </li><li> Usando uma micropipeta, depósito 5 ml·l Ringer (ou PBS) que contém o fármaco no topo do orifício no tórax. monitorizar cuidadosamente sob microscópio para assegurar que toda a gota é absorvida pela hemolinfa. Use campainha (ou PBS) como um controlo do veículo. </li><li> Se possível, coloque a aba cutícula para trás por cima do buraco. Após 5-10 horas, ele vai recolocar e selar. NOTA: Como uma alternativa a esta técnica, injectam-se 1 ul directamente no tórax usando uma seringa de vidro, depois de abrir uma SMALL buraco no meio do freio (linha transversal na região posterior do escutelo) com uma agulha de seringa (diâmetro: 0.6 mm L: 23). Isto evita a necessidade de cortar primeiro o tórax com um bisturi e o local da injecção é menor, mas este método vai deixar o local de injecção exposta. </li></ol></li><li> injeção ocellus NOTA: Este é um método adequado para a entrega de moléculas em toda a cápsula cabeça, na hemolinfa. <ol><li> Prepare drogas como em 1.2.1, mas ajustar as concentrações de fármaco de tal modo que a dose desejada irá ser contida em 1 mL de Ringer ou PBS (menos de volume pode ser absorvida através do orifício ocelo do que através do tórax). </li><li> Prepara-se uma microscalpel como em 1.2.2. Sob um microscópio estereoscópico, bloquear a cabeça de uma abelha aproveitado no lugar preenchendo a fenda no pescoço com cera. Use cera de fusão a baixa temperatura (por exemplo, cera, cirurgia dentária) de modo a evitar os receptores olfactivos antenal nocivos ou outras células que podem ser important para avaliar o comportamento (por exemplo, a aprendizagem olfactiva). Em seguida, remover cuidadosamente a lente do ocelo mediana através da inserção da ponta do microscalpel sob a lente e a lente suavemente quebrar livre a partir da cápsula cabeça. NOTA: É também possível colocar cera cuidadosamente através da antena para evitar o movimento. </li><li> Cuidadosamente pipeta de drogas para o buraco ocellus. Espere até que tudo seja levado para dentro da cápsula cabeça. Remova a cera dental da antenas e permitir que a abelha para descansar um pouco antes de continuar o procedimento experimental. Use campainha (ou PBS) como um controlo do veículo. </li></ol></li><li> Injecção no trato ocelar NOTA: O trato ocelar contém fibras grandes, conectando a maioria das regiões do cérebro central 18. Este método de tratamento permite a aplicação de compostos com apenas o cérebro, mas não segmentação sub-regiões específicas do cérebro. <ol><li> Prepare abelha como em 1.3.2. e remover a lente do ocelo mediana, com o tIP de um microscalpel como em 1.3.3. NOTA: Este pode ser feito até 2 horas antes da injecção. Com base em nossa experiência, as abelhas alimentadas são mais capazes de lidar com esta cirurgia que não as abelhas famintos </li><li> Encher uma seringa de vidro de 10 mL equipado com um calibre pequeno (por exemplo, 33, diâmetro: 210 mm) da agulha com solução de fármaco preparado como no 1.3.1. </li><li> Utilizando um micromanipulador Manual, insira a ponta da seringa através da retina ocelar na cápsula cabeça até uma profundidade de 50 mm e injectar 250 nl de solução. </li><li> Após o uso, lavar a seringa de 3 vezes com água destilada, em seguida, 3 vezes com etanol a 75%. </li></ol></li><li> Microinjecção em particular as estruturas cerebrais NOTA: Para além dos tratamentos sistemáticos mencionados acima, é possível realizar microinjections em particular as estruturas cerebrais. Isto permite a manipulação farmacológica de uma ou mais regiões do cérebro, deixando outras afectada. Isso funcionamelhor com as regiões do cérebro que são fáceis de reconhecer a partir da superfície do cérebro anterior (por exemplo, lobos antenais, cálices cogumelo corpo ou lóbulos verticais, ou os lobos ópticos), mas outras regiões têm sido alvo. Por favor note que a orientação (anterior / posterior, dorsal / ventral) refere-se ao eixo do corpo, em vez, do que para o neuroeixo 19. <ol><li> Prepara-se o fármaco em PBS ou da campainha da mesma maneira como em 1.2.1, adicionando um fluorescente (por exemplo, 0,5 mg / ml de dextrano, Alexa Fluor 546 ou 568) ou de um corante não fluorescente (por exemplo, 1 mM de metileno azul). NOTA: A adição de um corante fluorescente vai permitir a verificação do local de injecção após o experimento é longo (usando microscopia confocal, após dissecção do cérebro), enquanto que corantes não fluorescentes permitem o monitoramento direto durante o experimento. </li><li> Para tornar pipetas de vidro para injeção, insira capilares de vidro do diâmetro correto em grampos titular de um puxador de eletrodo (1,0 mm para o porão padrãoer incluído para o microinjetor mencionado na lista de materiais). Ajustar as configurações de tração e de calor para produzir uma ponta de cerca de 0,5 cm de comprimento (definições serão diferentes para cada extrator, mesmo se o mesmo modelo é utilizado). NOTA: Idealmente, as duas pipetas puxado a partir de um vidro devem ter o mesmo comprimento e forma, de modo que tanto pode ser utilizado. </li><li> Sob um microscópio estereoscópico, quebrar as pontas para obter um diâmetro exterior de cerca de 10-15 uM, com base na estimativa visual utilizando uma escala de uma retícula inserido na ocular. Os passos na escala são definidas pelo fabricante e podem ser corrigidos para a ampliação usada. </li><li> Em seguida, preencha as pipetas de vidro com a solução para injetar. Se são utilizados capilares de vidro com filamentos, encher a pipeta, colocando o lado de trás para dentro da solução de droga, de outro modo preencher ponta utilizando pontas microloader. </li><li> Inserir a pipeta de vidro cheio no suporte do capilar de um microinjector, a qual é controlada por um mi manual ou electrónicocromanipulator. </li><li> Calibrar o microinjector para injectar o volume desejado (0,5-2 nl, dependendo do tamanho da estrutura do cérebro alvo). Para isso, injectar directamente para uma pequena placa de Petri contendo óleo mineral e medir o diâmetro da gotícula com a retícula. Alterar as configurações até que o volume desejado seja alcançado. </li><li> Fixar a cabeça de uma abelha aproveitada usando cera dental macia como em 1.3.2, antes de cortar uma abertura na parte anterior da cápsula cabeça, usando um microscalpel, com três cortes: um pouco abaixo do ocellus mediana (ventral), um de a fronteira da direita ou olho esquerdo e um acima da antena hastes (dorsal). Use um pedaço de cera dental para segurar a aba aberta no lugar. </li><li> empurre cuidadosamente glândulas e traqueia deitado em cima do cérebro de lado usando uma pinça fina, em seguida, fazer uma pequena ruptura no Neurilema (membrana muito fina em torno do cérebro) acima da estrutura do cérebro alvo. NOTA: Se muitas abelhas estão a ser tratados ao mesmo tempo, este procedimentopode ser realizada mais cedo; no entanto, ter cuidado para não deixar abelhas neste estado por muito tempo (não mais de 30 min), como seus cérebros pode desidratar. </li><li> Inserir a ponta na região do cérebro desejado, e ajustar a profundidade perpendicular à superfície do cérebro (por exemplo, 60 uM para cálices corpo de cogumelo). Injectar o volume pré-definido. Para as regiões cerebrais laterais, injetam bilateralmente (ou seja, fazer uma injecção para cada hemisfério). Se um corante não fluorescente é usado, garantir a injeção ocorreu na região direita sobre a observação enquanto está a injectar. Se um corante fluorescente é usado fazer o mesmo sob luz fluorescente usando um estereomicroscópio com um sistema de visualização de fluorescência. </li><li> Em seguida, coloque a tampa traseira aberta sobre a cabeça da abelha. Derreter um cristal de eicosano, que é de aproximadamente 1 mm de diâmetro, usando um fio fino enrolado em torno da ponta do ferro de soldar micro (temperatura de fusão é 35-37 ° C) e selar os cortes. Isto irá reduzir significativamente a mortalidade. </li><li> Liberte oabelha do arnês para a análise comportamental (mas ver discussão), ou manter o arnês para experimentos com abelhas contido - por exemplo, a extensão probóscide reflex (PER) testando 20. </li><li> Se foi utilizado um corante fluorescente, assegurar que a injecção de atingir a área de interesse, após a experiência acabou usando um microscópio de varrimento laser confocal (Figura. 1). NOTA: Isto é particularmente útil quando o direcionamento áreas cerebrais mais profundas (onde seria difícil ver corante não fluorescente durante a fase de injecção). </li></ol></li></ol> 2. Métodos de administração de medicamentos para as abelhas vôo livre <ol><li> O tratamento oral <ol><li> Prepare droga, da mesma forma como nos passos 1.1.1-1.1.2. Adicionar solução de um fármaco a um alimentador e coloque na geladeira para o armazenamento. Nota: Qualquer alimentador vai fazer, como uma tampa de garrafa de cabeça para baixo ou um frasco invertido sobre papel absorvente. </li><li> Treinar abelhas para um alimentador de gravidade contendo 1 M ou 0,5solução de sacarose M, colocando um alimentador perto da colmeia. Uma vez que as abelhas começar forrageamento no alimentador, movê-lo gradualmente mais longe até que ele esteja a uma distância confortável para evitar ser picado (mínimo 5 m). </li><li> abelhas tinta de marca, a fim de manter o controle das abelhas individuais. Faça uma lista de todas as combinações de cores que serão utilizados. Quando uma abelha terras no alimentador, marque cuidadosamente seu abdômen com duas cores, e fazer uma nota na lista que a combinação é tomada. </li><li> Trocar o alimentador de gravidade para um alimentador que contém a solução de fármaco / sacarose. Tome nota das abelhas marcadas que visitam o alimentador. Pegar qualquer abelha sem marcação visitar o alimentador como as abelhas são recrutadores prolíficos, e os números de abelhas que visitam o alimentador drogado pode rapidamente sair do controle. Isto é especialmente problemático se a mesma experiência é para ser realizado em dias sucessivos, como abelhas simples pode não ser ingénuos. NOTA: Como uma alternativa para treinar abelhas individuais para um alimentador, autor anteriors ter alimentado com sucesso água sacarose-atada drogas a todo um ramo de 21-23. </li></ol></li><li> O tratamento tópico NOTA: O objectivo é dissolver o composto de interesse no seio de um solvente que pode penetrar a cutícula cerosa inseto. Diferentes solventes podem ser utilizados para este fim. O mais vulgarmente utilizado incluem acetona, dimetilformamida (DMF) e dimetilsulf óxido (DMSO). <ol><li> Avaliar quais solvente funciona melhor para o composto em questão. Se um fenótipo forte é esperado a partir de uma sobredosagem (por exemplo, paralisia ou morte), abelhas tratar (passo 2.2.2), com uma dose elevada (por exemplo, 20 ug a cocaína 7) Dissolveu-se em cada um dos diferentes solventes e cuidadosamente monitorar o tempo até paralisia ou morte. </li><li> Usando um microcapilar 1 uL (ou uma micro-seringa, que pode ser instalado em um dispensador de repetição apropriado) e titular microcapilar, compre 1 ul da solução do fármaco (por exemplo, 381; g / L de cocaína) para o capilar. Expelir a gota, e pintá-lo com cuidado sobre o tórax de uma abelha marcada. Cubra tão grande de uma área de uma possível com a solução, em vez de deixar uma gota sólida, como a abelha é provável, portanto, para noivo-lo. Tenha cuidado para não permitir que o composto em contato com a asa dobradiças, ou isso pode desenhá-lo fora do tórax e ao longo das asas, onde ele irá evaporar, sem ser absorvido na hemolinfa. NOTA: Dependendo do objectivo de investigação, este método também pode ser utilizado para administrar drogas para o abdómen da abelha. No entanto, drogas atingir o SNC e mais rápido em maiores quantidades quando aplicado ao tórax método .Este 24 funciona igualmente bem com aproveitada como com as abelhas de vôo livre. </li></ol></li><li> tratamento volatilizado <ol><li> Dissolve-se a droga (anteriormente este método foi usado para entregar cocaína para abelhas 10) em 100% de etanol. Para garantir a solubilidade, não use um cloridrato ou outras formas de sal dodroga se possível. Ao fazer uma diluição prepará-lo de modo a que a quantidade a ser entregue a um abelha está presente em 100 ul. O uso do etanol puro como um controlo do veículo. </li><li> Para criar um filamento, utilizar o mesmo procedimento como McClung e Hirsh 25. <ol><li> Resumidamente explicou: acabar fio de nicromo firmemente em torno de um prego e anexar a dois fios elétricos (um em cada extremidade do filamento). Remover o prego. A bobina de nicrómio restante é referido como o filamento. </li><li> Passe os dois fios através de orifícios perfurados no cuidadosamente a tampa de um tubo de centrífuga de 50 ml, o que deve ser resistente à temperatura escolhida. Cole os fios no lugar com silicone líquido. NOTA: Isto fará o hermético tubo. Isto é essencial para evitar a exposição secundária ao experimentador e assegurar que as abelhas são tratados com a dose apropriada. </li></ol></li><li> Anexar os fios que conduzem ao filamento a uma fonte de energia. Usando um termopar para medir a temperatura deo filamento, experiência com diferentes combinações de tensão / corrente até que aquela que resulta em um perfil de temperatura adequado para a droga em questão, de preferência, uma que permite a 10 s de aquecimento ou menos. Isto é muito importante, referem-se a literatura relevante (por exemplo, a fim de cocaína para volatilizar precisa de ser aquecida a pelo menos 200 ° C, mas a temperaturas superiores a 350 ° C, ele é dividido em compostos secundários 26). </li><li> Cuidadosamente Pipetar 100 ul de droga que contém uma solução de etanol para o filamento. Espalhe o líquido sobre a superfície do filamento, tanto quanto possível, pois isso irá aumentar a eficiência da evaporação. Deixar o filamento exposto à temperatura ambiente até todo o etanol se ter evaporado. NOTA: Se o etanol não é suficientemente evaporada, abelhas vai ser tratada tanto com a droga de escolha e etanol. As abelhas são extremamente sensíveis ao etanol, e alguns fármacos têm interacções sinérgicas com etanol, o que vai viés exresultados rimentais. </li><li> Uma vez que o etanol foi completamente evaporado (geralmente precipitado droga pode ser visto sobre o filamento seco sob um microscópio), apanhar um abelha de vôo livre em um tubo de 50 ml. Cuidadosamente fechar a tampa contendo o filamento. </li><li> Ligue a alimentação durante 10 segundos, desligar o gravador, e esperar mais 50 segundos (para permitir que o composto volatilizado para esfriar e, assim, condensar ou depósito). Solte a abelha. NOTA: Embora este método de tratamento funciona de forma excelente para as abelhas de vôo livre, ele pode ser usado apenas como eficazmente com as abelhas aproveitado. Basta conectar a abelha aproveitada dentro de um tubo de 50 ml. Recarregar o filamento tal como descrito no 2.3.4 entre abelhas. Para um maior rendimento, vários filamentos podem ser usados ​​em paralelo. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Os métodos descritos acima permitir um tratamento simples, eficaz e robusto de qualquer vôo livre ou abelhas aproveitado. Estes métodos são compatíveis com diversos paradigmas experimentais e questões biológicas (Tabela 1). Todos os métodos livre de vôo pode ser facilmente aplicado para as abelhas aproveitado. O inverso é menos bem sucedido, no entanto, uma vez restrição temporária e métodos invasivos de tratamento muitas vezes pode comprometer a capacidade de vôo das abelhas. <p class="jove_content...

Desde Karl von Frisch elucidado sua linguagem de dança 1, as abelhas têm permanecido uma espécie de estudo populares para pesquisadores em comportamento animal e neurobiologia. Nos últimos anos uma miríade de novas disciplinas surgiram na interseção desses dois campos, e várias outras disciplinas (por exemplo, biologia molecular, genômica e ciência da computação) surgiram ao lado deles. Isto levou a um rápido desenvolvimento de novas teorias e modelos para a compreensão de como o comportamento resulta de atividade dentro do sistema nervoso. Por causa do estilo de vida único, rico repertório comportamental, e facilidade de manipulação experimental e farmacológico, as abelhas têm-se mantido na vanguarda dessa revolução. As abelhas do mel estão sendo usados para estudar questões neurobiológicas básicos tais como os de aprendizagem subjacentes e memória 2,3, tomada de decisão 4, olfativas 5 ou 6 processamento visual. Nos últimos anos, o honey abelha sequer foi usado como um modelo para o estudo de temas geralmente reservados para a investigação médica, tais como os efeitos das drogas viciantes 7 - 11, o sono 12, o envelhecimento 13, ou os mecanismos subjacentes a anestesia 14. Ao contrário dos clássicos organismos modelo genético (por exemplo, D. melanogaster, C. elegans, M. musculus), há muito poucas ferramentas genéticas disponíveis para manipular as funções neurais em abelhas produtoras de mel, embora isso está mudando 15. Em vez disso, estudos de abelhas têm se baseou principalmente em manipulações farmacológicas. Isso tem sido muito bem sucedida; no entanto, a diversidade de pesquisa abelha é tal que uma série de métodos para a administração farmacológica são necessários. A pesquisa com abelhas aborda mais diversas questões, é estudado por pesquisadores de diferentes disciplinas e experiências, e usa uma variedade de abordagens experimentais. muitos reseperguntas arco exigem abelhas para quer ser livre de vôo, interagindo livremente na sua colónia, ou ambos. Isso pode tornar difícil manter o controle de animais experimentais individuais, e faz a restrições ou a punção inviável. Para acomodar a diversidade de pesquisa da abelha do mel, são necessários uma variedade de métodos de administração de fármacos, permitindo a administração robusto e flexível, assegurando ao mesmo tempo que a perfis farmacocinéticos e farmacodinâmicos, invasividade do método, e a sua fiabilidade, adequar o paradigma em questão. Devido a estas necessidades diversas, a maioria dos grupos de pesquisa têm desenvolvido os seus próprios métodos de administração de medicamentos originais. Até agora, esta tem sido uma força da comunidade de pesquisa de abelhas; que tem levado ao desenvolvimento de matrizes de métodos que permitam a administração do mesmo medicamento em diferentes circunstâncias. Nosso objetivo aqui não é desenvolver um método padronizado único para manipulações farmacológicas de abelhas, mas sim para destacar os métodos queprovaram ser particularmente bem sucedidas, e os investigadores ajuda adoptar estes. Discutimos os princípios básicos de como eles funcionam, bem como suas vantagens e desvantagens.

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td>Qualquer fornecedor fará</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose monohidratada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49159</td><td></td></tr><tr><td>Tampão fosfato salino (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Cera de proteção</td><td>Dentaurum</td><td>124-305-00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>dimetilformamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>95% Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidro</td><td>WPI</td><td>1B100F-3</td><td></td></tr><tr><td>23 G Agulha NanoFil</td><td>WPI</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Forsceps muito fino</td><td>Dumont</td><td>0208-55-PO</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodo extrator</td><td>SRI</td><td>2001</td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td>5247 000.01</td><td></td></tr><tr><td>Eicosane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>219274</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulador manual</td><td>Brinkmann Instrumentenbau</td><td>MM-33</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulador eletrônico</td><td>Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik</td><td>Unidade júnior XYZ</td><td></td></tr><tr><td>estereomicroscópio</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>ferro de solda</td><td>Weller</td><td>WESD51</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 546, 10.000 MW</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D-22911</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 568, 10.000 MW</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D-22912</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri pequena</td><td>Óleo mineral Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td></td></tr> Tubo de centrífuga <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td> Pinça <td>de 339652</td><td></td><td>científica ThermoFisher</td></tr><tr><td></td><td>Suprimentos</td><td></td><td></td>entomológicos australianos</tr><tr><td>Suporte e disjuntor da lâmina</td><td>Suprimentos entomológicos australianos</td><td>E130</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina</td> <td>de barbear de dois gumes de penasThermoFisher Scientific</td><td>50-949-135</td><td></td></tr><tr>Fio <td></td><td></td><td>de nicromo</td><td>Qualquer fornecedor fará</td></tr><tr><td>Fios</td><td></td><td></td> elétricos <td>Qualquer fornecedor fará</td></tr><tr><td>Tinta modelo</td><td>Tamiya USA</td><td>Depende da cor</td><td></td></tr><tr><td>Dispensador de repetição</td><td>Empresa Hamilton</td><td>PB-600-1</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de vidro</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>sistema de visualização de fluorescência</td><td>Nightsea</td><td>SFR-GR</td><td></td></tr><tr><td>gratícula</td><td>ProSciTech</td><td>S8014-24</td><td></td></tr><tr><td>microcapilar com suporte</td><td>Drummond</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Silicone</td><td></td><td></td> líquido <td>Qualquer fornecedor fará</td></tr><tr><td>Termopar</td><td>Digitech</td><td>QM-1324</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

manipulação neurofarmacologia de contido e vôo livre abelhas do mel,<em&gt; apis mellifera</em

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

As abelhas do mel demonstrar capacidades de aprendizagem surpreendentes e comportamento social avançada e comunicação. Além disso, o seu cérebro é pequeno, fácil de visualizar e estudar. Portanto, as abelhas têm sido um modelo preferido entre os neurobiólogos e neuroethologists para estudar as bases neurais do comportamento social e natural. É importante, no entanto, que as técnicas experimentais usadas para estudar abelhas não interferir com o comportamento a ser estudada. Devido a isto, tem sido necessário o desenvolvimento de uma variedade de técnicas para a manipulação farmacológica de abelhas de mel. Neste artigo é demonstrar os métodos para o tratamento de abelhas produtoras de mel contido ou livre de voar com uma vasta gama de agentes farmacológicos. Estes incluem ambos os métodos não invasivos, tais como tratamentos orais e tópicos, assim como métodos mais invasivos que permitem a entrega da droga precisa em qualquer forma sistémica ou localizada. Finalmente, discutimos as vantagens e desvantagens de cada método e descreverobstáculos comuns e como melhor superá-los. Concluímos com uma discussão sobre a importância de adaptar o método experimental para as questões biológicas, em vez do contrário.

Uma selecção de resultados representativos para os métodos acima descritos são representados, principalmente para demonstrar que os métodos de permitir que os agentes farmacológicos para chegar ao cérebro e afectar o comportamento das abelhas de mel. efeitos específicos sobre processos cerebrais podem ser facilmente obtidos após a injecção tórax. Como os agentes farmac...

Este manuscrito descreve vários protocolos para a administração de agentes farmacológicos para as abelhas, incluindo métodos não invasivos simples para abelhas de vôo livre, bem como variantes mais invasivos que permitem que o tratamento localizado precisa de abelhas dispositivos de retenção.

Manipulação neurofarmacologia de contido e vôo livre abelhas do mel,<em&gt; Apis mellifera</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

O objetivo geral desses procedimentos é administrar de forma confiável e robusta agentes farmacológicos ao sistema nervoso central de abelhas melíferas ou insetos semelhantes. Esses métodos podem ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de sociobiologia, neuroetologia e apicultura, como a exploração dos mecanismos neurológicos do comportamento social. A principal vantagem dessas técnicas é que elas permitem o estudo da neurobiologia em organismos não-modelo, como a abelha melífera, nos quais as ferramentas genéticas atualmente são limitadas.A demonstração do procedimento será feita por Jenny Plath, estudante de pós-graduação do Laboratório de Neuroetologia da Universidade Macquarie. As drogas podem ser administradas por via oral ou por injeção. As injeções podem ser feitas no tórax, no olho simples (ocelo) ou no trato ocelar.As injeções em ocelos administram medicamentos em toda a cabeça, enquanto as injeções no trato ocelar visam regiões específicas do cérebro. Para todas as injeções, confeccione um microescalpelo quebrando o canto de uma lâmina de barbear de dupla face com um suporte para lâmina. Fixe o fragmento da lâmina a um suporte de modo que forme uma boa lâmina com uma ponta afiada.Para uma injeção torácica, dissecar um orifício de dois milímetros logo acima do escutelo, ao lado do processo póstero-alar do tórax de uma abelha. Evitar cortar muito fundo, pois isso pode lesar os músculos de voo, e ter cuidado para não atingir as articulações das asas. Idealmente, cortar apenas três lados, de modo que a aba da cutícula possa ser dobrada de volta posteriormente para fechar o local da lesão.Agora injete a droga no tórax. Em seguida, reposicione a aba da cutícula sobre o orifício e, após dez horas, ela se religará e selará. Para acessar o cérebro, fixe a cabeça de uma abelha contida no lugar preenchendo a fenda do pescoço com cera odontológica aquecida manualmente, a fim de evitar danos aos receptores olfativos das antenas ou outras células que possam ser importantes para o comportamento da abelha.A antena também pode ser fixada com cera dental. Em seguida, utilizando o microescalpelo, remova cuidadosamente a lente do ocelo mediano inserindo a ponta do microescalpelo sob a lente e quebrando suavemente a lente, soltando-a da cápsula cefálica. Para que a droga penetre em toda a cápsula cefálica, pipete cuidadosamente a droga sobre o orifício do ocelo e aguarde sua absorção.Alternativamente, sub-regiões do cérebro podem ser alvejadas por injeção através do trato ocelar, por exemplo, injetando 250 nanolitros de fármaco a uma profundidade de 50 micrômetros para atingir estruturas cerebrais adjacentes ao ocelo. Em seguida, remova a cera dental e permita que a abelha descanse por algum tempo antes de continuar o procedimento experimental. Para preparar as agulhas de injeção, puxe tubos de vidro de um milímetro para produzir uma ponta com aproximadamente 0,5 centímetro de comprimento.Em seguida, sob um microscópio estereoscópico, quebre as pontas para fazer uma abertura com diâmetro externo de aproximadamente 10 a 15 mícrons. Isso pode ser medido utilizando uma escala em uma retícula. Agora, carregue uma agulha de injeção com a solução do fármaco.Em seguida, no sistema de injeção, acople a agulha carregada ao micromanipulador. Teste o sistema de injeção em óleo mineral e calibre-o para liberar uma bolus de 0,5 a dois nanolitros, dependendo do tamanho da estrutura cerebral alvo. Utilizando uma retícula, meça o diâmetro das gotas para calcular seu volume.Para fixar a cabeça de uma abelha aparelhada, utilize cera dental macia, como antes. Em seguida, faça uma abertura na parte anterior da cápsula cefálica usando um microbisturi com três cortes: um logo abaixo do ocelo mediano; um na borda do olho direito ou esquerdo; e um acima das hastes das antenas. Utilize um pedaço de cera dental para manter a aba aberta no lugar.A seguir, empurre cuidadosamente as glândulas e a traqueia com pinças finas e faça uma pequena ruptura na neurilema acima da estrutura cerebral alvo. Agora, insira a ponta da pipeta de vidro na região cerebral desejada, idealmente perpendicular à superfície do cérebro, até a profundidade necessária para atingir a estrutura-alvo. Em seguida, injete o bólus do fármaco.Ao direcionar regiões cerebrais pareadas, faça uma injeção em cada hemisfério para afetar ambos os lados. Se um corante fluorescente for injetado junto com o bolo, as regiões cerebrais superficiais poderão ser visualizadas usando luz fluorescente. Outras regiões poderão ser verificadas posteriormente por microscopia confocal.Após a injeção, recoloque a aba da cutícula e feche o corte derretendo um cristal de eicosano com aproximadamente um milímetro de diâmetro sobre a cutícula, utilizando um fio fino ligado a uma microsolda. Isso reduzirá significativamente a mortalidade. Para administrar uma substância tão volátil quanto a proveniente de um filamento de níquel-cromo aquecido, prepare-a dissolvida em etanol puro.Para furar cuidadosamente orifícios na tampa de um tubo de 50 milímetros, passe os dois fios pelos orifícios. Para criar um filamento, enrole firmemente o fio de níquel-cromo ao redor de um prego, conecte o fio de níquel-cromo a dois fios elétricos e, em seguida, remova o prego. Depois, fixe os fios e vedar os orifícios com silicone.Agora conecte os fios a uma fonte de alimentação. E use um termopar para medir a temperatura do filamento. Para calibrar o dispositivo, pipete cuidadosamente dois microlitros de solução do fármaco sobre o filamento e deixe o etanol evaporar completamente à temperatura ambiente.Varie a voltagem na corrente para que o bolo de fármaco volatilize dentro de dez segundos após a aplicação de energia. O fármaco não deve ser destruído por decomposição térmica. O precipitado geralmente pode ser observado no filamento seco se for inspecionado cuidadosamente.Para administrar as drogas a uma abelha, coloque uma abelha livre ou presa na tela dentro do tubo e prenda cuidadosamente a tampa com os fios para fora. Em seguida, ligue a fonte de energia por 10 segundos e aguarde mais 50 segundos para que o composto volatilizado seja completamente absorvido pela abelha antes de removê-la. Efeitos específicos sobre processos cerebrais podem ser facilmente obtidos após injeção no tórax.Por exemplo, bloqueadores da transcrição foram administrados usando esta técnica para identificar fases da memória que requeriam expressão gênica. Foram obtidos efeitos seletivos e dependentes do tempo sobre tarefas de memória. A difusão de moléculas para o hemolinfa da cabeça leva a efeitos rápidos e dependentes da dose, alcançados por injeção no ocelo.Em certas concentrações de dose, as alatostatinas difusamente concentradas reduziram o desempenho em um ensaio de aprendizado olfativo. Para testar as propriedades espaciais e temporais de regiões cerebrais específicas, abelhas imobilizadas foram treinadas em um paradigma de condicionamento olfativo de PER e, em seguida, injetadas com procaina nos cálices do corpo pedunculado ou nos lobos verticais. Quando as abelhas foram submetidas posteriormente a testes de recordação, o desempenho foi prejudicado apenas nas abelhas injetadas bilateralmente.Em uma arena com múltiplos alimentadores, as abelhas foram capturadas suavemente quando estavam prestes a decolar de um alimentador com sacarose a um molar. As abelhas capturadas foram tratadas com 100 microgramas de cocaína na forma de base livre volatilizada, o que resultou em aumento da forrageamento em alimentadores com concentração de meio molar, mas não em alimentadores com dois molares. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como administrar drogas a abelhas em voo livre ou restritas, seja por injeção ou por volatilização.Uma vez dominadas, essas técnicas podem ser facilmente realizadas em um grande número de abelhas em algumas horas. Após este procedimento, outros métodos, como o condicionamento da extensão do probóscide, podem ser realizados para que possamos responder a questões adicionais sobre a neurobiologia da aprendizagem e da memória.

neuropharmacological-manipulation-restrained-free-flying-honey-bees

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Demonstramos como implementar um método de farmacologia comportamental em um paradigma de condicionamento apetitivo olfativa de abelhas (Apis mellifera) por aplicação sistêmica de medicamentos. Este método permite investigação dos mecanismos subjacentes à aprendizagem e formação da memória de uma forma simples e confiável.

Farmacologia Comportamental no condicionamento clássico da Resposta Extensão Proboscis em Abelhas ( Apis mellifera)

Neste protocolo, mostramos como condição aproveitado abelhas aos estímulos táteis e introduzir uma técnica de captura de movimento 2D para analisar a cinemática de multa escala padrão de amostragem antenal.

Condicionado tátil e Análise do Movimento de estratégias de amostragem antenais de abelhas (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Neste protocolo, descrevemos duas estratégias que suprimem simultaneamente dois genes (gene knockdown double) em abelhas. Em seguida, apresentamos como usar a resposta de extensão probóscide (PER) ensaio para estudar o efeito do gene knockdown duplo em mel de abelha percepção gustativa.

RNAi mediado por Gene Knockdown duplo e Mensuração Percepção gustativa em abelhas do mel (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

O protocolo de condicionamento Proboscis Extension Response (PER), desenvolvido para a abelha melífera (Apis mellifera), fornece um meio ecologicamente relevante e facilmente quantificável para estudar vários mecanismos diferentes de aprendizagem em muitas espécies de insetos.

Um protocolo de resposta narigudo Extensão para investigar plasticidade comportamental em Insetos: Aplicação para Basic, biomédica e Pesquisa Agropecuária

Gravações de longo prazo simultâneos extracelulares de duas neuropiles cerebrais diferentes ou dois setores anatômicas diferentes foram estabelecidos em abelhas. Essas gravações permitem a investigação de aspectos temporais de processamento neuronal em diferentes áreas do cérebro, no único neurônio, bem como a nível conjunto em um animal se comportar.

Gravações simultâneas de longo prazo em dois estágios de processamento neuronal em comportar abelhas

Um novo ensaio comportamental é descrito para investigar as respostas gustativas de curto prazo das peças bucais de abelhas que se movem livremente (Bombus terrestris) em relação a nutrientes e toxinas em solução.

A Novel Behavioral Ensaio investigar as gustativas de um indivíduo, livre-se deslocam Bumble abelhas (<em&gt; Terrestris do Bombus</em&gt;)

Aqui nós descrevemos nosso protocolo detalhado para a preparação de colônias de abelhas-coorte único - uma ferramenta útil para analisar a fisiologia trabalhador associada à função. Descrevemos também protocolos detalhados para o tratamento de trabalhadores com hormônio juvenil e ecdisona para avaliar o envolvimento desses hormônios na regulação do comportamento do trabalhador e / ou fisiologia.

Preparação de Colônias-coorte único e tratamento hormonal do trabalhador de abelhas para analisar Fisiologia Associated com a função e / ou sistema endócrino

A perda de colônias de abelhas mel é um desafio para os serviços de polinização de culturas. As atuais práticas de proteção de polinizadores garantem uma abordagem alternativa para minimizar o contato de abelhas com pesticidas nocivos usando produtos químicos repelentes. Aqui, fornecemos métodos detalhados para um protocolo de rastreamento visual para detecção de dissuasores para abelhas.

Protocolo de rastreamento de vídeo para a tela de quimioterapia para abelhas

Este protocolo descreve etapas para usar o novo software, SwarmSight, para o seguimento do frame-por-frame de insetos posições da antena e narigudo de vídeos de câmera web convencional usando computadores convencionais. O software livre, open-source processa quadros cerca de 120 vezes mais rápido do que os seres humanos e realiza-se no melhor do que a precisão humana.

SwarmSight: Acompanhamento em tempo real dos movimentos de antena do inseto e reflexo de extensão Proboscis usando uma preparação comum e Hardware convencional

Para testar os efeitos inibitórios dos agentes farmacológicos na fosfolipase C (PLC) em diferentes regiões do cérebro de abelhas, apresentamos um ensaio bioquímico para medir a atividade PLC nessas regiões. Este ensaio pode ser útil para comparar a atividade PLC entre os tecidos, assim como entre abelhas exibindo comportamentos diferentes.

Deteção da fosfolipase C atividade no cérebro Homogenate da abelha

Apresentado aqui é um protocolo para usar o sistema CRISPR-Cas9 para reduzir a produção de uma proteína no cérebro de abelha adulta para testar a especificidade do anticorpo.

Testes anticorpos anti-RDL e Anti-mglutr1 em seções cerebrais de abelhas usando CRISPR-Cas9

Aprenda métodos de administração de fármacos em abelhas Apis mellifera, incluindo injeções no tórax, ocelo e trato ocelar, além de técnicas orais e por volatilização. Esses protocolos possibilitam estudos neurobiológicos precisos em organismos não modelo.

Manipulação neurofarmacologia de contido e vôo livre abelhas do mel,

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