Name: Gerando De Novo Antígeno-específica T Humano receptores celulares por Transdução retroviral de Centric Hemichain (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprenda a gerar receptores de células T antígeno-específicos de novo por transdução retroviral de hemicadeias centricas. Este método simplifica a engenharia de TCRs para imunoterapia gênica.

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Este trabalho foi apoiado pela concessão R01 CA148673 (NH) do NIH; o Prêmio de Investigador Clínico IA-039 (NH) do Instituto de Pesquisa do Câncer de Ontário; Subsídio de Catalisador BioCanRX (NH); A Fundação do Câncer Princesa Margaret (MOB, NH); Bolsa de Pós-Graduação (TG) do Canadian Institutes of Health Research Canada; Bolsa de Pós-Graduação (TG) do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá; Província de Ontário (TG, MA); e Prêmio Guglietti Fellowship (TO). Os monômeros HLA e CD1d foram gentilmente fornecidos pela instalação central de tetrâmeros do NIH.

1. Preparar Retroviral construção que codifica TCR Hemichain de Interesse <ol><li> Linearizar pMX vector para permitir a inserção de um gene de TCR em passos subsequentes. Digerir o ADN de plasmídeo com enzimas de restrição EcoRI e NotI a 37 ° C durante 3 horas (Tabela 1) 8. </li><li> Realizar a eletroforese do plasmídeo digerido em 1,2% em gel de agarose. Banda especial de consumo de aproximadamente 4.500 pares de base (bps), e eluir em 30 mL de água estéril usando comercialmente disponíveis kits de extração de gel 9. </li><li> Design de 5 &#39;e 3&#39;, os iniciadores para o gene de TCR de interesse que também codificam 15-20 pb que se sobreponham ao local digestão com EcoRI e Notl do vector pMX, respectivamente 8. </li><li> Amplificar o gene do TCR com primers. Efectuar a electroforese do produto de PCR e eluem banda de aproximadamente 1000 pb, tal como descrito na etapa 1.2. </li><li> Clonar o gene do TCR no vector digerido por combinação de cada fragmento linear com o plasmídeo disponível comercialmentemestre montagem reagente mistura e incubando a 50 ° C durante 1 h. NOTA: Consulte o protocolo do fabricante para os volumes relativos de cada componente. Este método de montagem é baseada na técnica originalmente descrita por Gibson et ai. 10. </li><li> (Opcional) Tag gene TCR para marcar as células transduzidas com a forma truncada do receptor do factor de crescimento do nervo humano (ΔNGFR, aminoácidos 1-277) 11 separados por local de clivagem de furina, ligante serina-glicina, e 2A sequências 12,13. sequências de codificação de conceber iniciadores que se sobrepõem as extremidades do fragmento e montar plasmídeo como descrito nas etapas 1,3-1,5. NOTA: Estas sequências podem ser encontradas nas referências 11-13. </li><li> Transformar E. quimicamente competente coli com o plasmídeo montados seguindo o protocolo do fabricante 14. Semente bactérias transformadas sobre placas de agar (20 mg / ml de caldo lisogenia (LB), 15 mg / ml de agar, e 1 ug / ml de ampicilina) e incubar a 37 ° C durante 18 h. </li&gt; <li> A cultura de uma colónia única bactéria em 50 ml de meio LB (20 mg / ml de LB e 1 ug / ml de ampicilina) durante 16 horas numa incubadora com agitação a 37 ° C e 200 ciclos por minuto. </li><li> Purifica-se os plasmídeos utilizando estojos comercialmente disponíveis Midiprep seguindo o protocolo do fabricante. Dilui-se o plasmídeo a concentração de cerca de 1 ug / uL. NOTA: O protocolo de purificação de plasmídeo baseia-se no método de extracção alcalina 15. </li></ol> Linha celular de empacotamento estável 2. Geração NOTA: Tanto as células 293GPG e PG13 são aderentes. Células de cultura de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e 50 ug / ml de gentamicina. 293GPG células de cultura com 1 ug / ml de tetraciclina antes da transfecção. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2 entre todos os passos. <ol><li> 293GPG transfectar células de empacotamento 16 em cultura em balão T75 com o vector que codifica hemichain obtido na etapa 1.9, USIng reagente de transfecção disponíveis comercialmente seguindo o protocolo do fabricante 1 7. NOTA: As células transfectar 293GPG a 50-60% de confluência. </li><li> médio aspirado para 293GPG células e adicionar 10 ml de fresco DMEM meio 1 dia pós transfecção. </li><li> Colheita transitoriamente produzidos vírus a partir de células transfectadas 293GPG 2 dias após o passo 2.2 pela transferência de meio de cultura a seringa e que passa através do filtro de 0,45 um. NOTA: O vírus pode ser utilizada imediatamente ou armazenada a -80 ° C para uso futuro. </li><li> Culturas 1 x 10 5 células em PG13 frasco T25. Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Após um dia, meio de cultura aspirado e adicionar 1,5 ml de vírus 293GPG derivado a partir do passo 2.3 e 1,5 ml de meio DMEM, juntamente com 8 ug / ml de polibreno. </li><li> Mudar a forma como descrito no passo 2.4, uma vez por dia durante 4 dias, para estabelecer que produzem retrovírus estável linha celular de empacotamento PG13 codificando o hemichain TCR de interesse. </li><li> Aspirar médio e substituircom meio DMEM fresco para linhas celulares PG13 24 horas após a última infecção para posterior cultura. NOTA: congelar ou sub-cultura de células por destacando com solução de tripsina-EDTA 0,05%. </li><li> Para produzir vírus de linhas celulares transduzidas PG13, a cultura 2 x 10 6 em células T75 frasco com 10 ml de meio DMEM, e vírus da colheita, tal como descrito na etapa 2.3 três dias após a sementeira das células. NOTA: Vírus é melhor usado imediatamente, mas pode ser armazenado a -80 ° C durante até dois meses. </li></ol> 3. A activação e Transdução de células T humanas NOTA: As amostras humanas são obtidas e utilizadas de acordo com os protocolos aprovados da comissão de ética institucionais. células humanas primárias em cultura de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio suplementado com 10% de soro humano em vez de FCS e 50 ug / ml de gentamicina. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2 entre todos os passos. <ol><li> Isolar células periféricas humanas mononucleares do sangue (PBMC) por densidadeseparação por gradiente seguindo o protocolo do fabricante 18. </li><li> Activar as células T para induzir a proliferação necessário para a infecção retroviral. Cultura de 2 x 10 7 PBMC frescas ou descongeladas por poço em placas de 6 poços, em 5 ml de meio RPMI com 100 UI / ml de recombinante humano IL-2 (rhIL-2) e 50 ng / ml de anticorpo monoclonal anti-CD3 (OKT3 clone). </li><li> Três dias após a estimulação, recolher as células T por pipetagem e centrifugar a 350 g durante 4 min. Elimine o sobrenadante e sementes de 0,5-1 x 10 6 células T por poço em placas de 24 poços ressuspensas em 1 ml de vírus PG13 do passo 2.7, e de 1 ml de meio RPMI suplementado com 200 UI / ml de rhIL-2. Centrifugar a placa 1000 xg e 32 ° C durante 1 h. </li><li> Após 24 horas, recolher as células T por pipetagem e centrifugar a 350 g durante 4 min. Rejeitar sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de vírus PG13 do passo 2.7, e de 1 ml de meio RPMI suplementado com 200 UI / ml de rhIL-2. Repita este passo para um total de 6 Infectíons. NOTA: Número de infecções deve ser optimizada, dependendo título do vírus produzido pela linha celular de empacotamento. Se necessário, as células T por remoção de passagem de 20-30% das células de cada dia para prevenir o crescimento excessivo. </li><li> 24 h após a última infecção, recolher as células T por pipetagem e centrifugar a 350 xg durante 4 min. Rejeitar sobrenadante e ressuspender as células em meio RPMI com 100 UI / ml de rhIL-2 para posterior cultura. </li><li> 2-3 dias após a etapa 3.5, as células T com mancha multímero de HLA, a 4 ° C durante 30 min, em seguida, CD3 anti-humano e anticorpos monoclonais do co-receptor (mAb) a 4 ° C durante 15 min. Analisar por citometria de fluxo. Use multímero irrelevante e / ou células não transduzidas como controlos negativos (Figura 1 - 3) 19. </li><li> Se o hemichain centric introduzido é uma cadeia TCRα, analisar o uso Vp dos de novo multimero células positivas utilizando o painel de anticorpos específicos de Vp comercialmente disponível por citometria de fluxo 20. </li></ol> 4. Clonagem De Novo TCR Counter-hemichains <ol><li> Ordenar o novo população positiva de multimero no passo 3,6 por separação de células assistida por fluxo. </li><li> Isolar o ARN a partir de células T classificados usando o guanidínio ácido tiocianato-fenol-clorofórmio método de extracção de 2 21,2. NOTA: o RNA pode ser armazenado a -80 ° C, mas devem ser utilizadas para gerar ADNc tão rapidamente quanto possível. </li><li> Sintetizar biblioteca de ADNc a partir de ARN extraído utilizando kits de transcriptase reversa-PCR disponíveis comercialmente seguindo o protocolo do fabricante 23,24. </li><li> Se a clonagem TCRβ contra-correntes, projetar gene Vp e região constante primers específicos TCRβ, conforme determinado na etapa 3.7, e clonar full-length TCRβ genes como descrito nos passos 1,3-1,9. Veja o passo 4.5 se contra-corrente é TCRα, caso contrário, continue para o passo 5.1. </li><li> Comercialmente os anticorpos específicos-Va disponíveis estão limitados, assim, o uso de genes Va não podeser determinada por citometria de fluxo. Clone TCRα contra-correntes através de amplificação 5&#39;-rápida de extremidades de cDNA (RACE) 25, utilizando comercialmente disponível 5 kits RACE «6. <ol><li> Sintetizar 5 &#39;RACE de cDNA compatível partir de RNA extraído no passo 4.2, seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> Execute 1º PCR rodada, conforme descrito na Tabela 2. </li><li> Efectuar a electroforese do produto de PCR e eluem banda de aproximadamente 1100 pb, tal como descrito na etapa 1.2. </li><li> Realizar 2 ND ciclo de PCR como descrito na Tabela 3, utilizando-se um produto de PCR como molde redondo r. NOTA: As sequências dos iniciadores mostrados sob Tabela 3 foram desenhados para clonagem EcoRI e NotI digerido vector pMX. </li><li> Efectuar a electroforese do produto de PCR e eluem banda de aproximadamente 1000 pb, tal como descrito na etapa 1.2. </li><li> clonar genes TCRα em EcoRI e Notl vector digerido pMX e puriplasmídeos fy como descrito nos passos 1,5-1,9. </li></ol></li></ol> Clones de TCR antígeno-específica 5. Reconstituting Novel NOTA: Cultura de Jurkat 76 células e linhas celulares subsequentes em meio RPMI suplementado com FCS a 10% e 50 ug / ml de gentamicina. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2 entre todos os passos. <ol><li> Transduzir células Jurkat 76 26 (ou equivalente TCR - / - linha de células T humana) com hemichain TCR centrada utilizando vírus 293GPG produzido no passo 2.3. Para Jurkat 76, semente de 5 x 10 4 culas por po em placa de 24 cavidades com 1 ml de vírus e de 1 ml de meio RPMI. Centrifugar a placa 1000 xg e 32 ° C durante 1 h. </li><li> 24 h após a infecção, recolhe hemichain Jurkat transduzidas 76 células por pipetagem e centrifugar a 350 xg durante 4 min. Elimine o sobrenadante e ressuspender em meio RPMI fresco para posterior cultura. </li><li> Purificar células transduzidas se o hemichain é molecularmente marcado 2-3 dias após o passo 5.2, por coloraçãoing com fluoróforo conjugado anti NGFR-mAb seguido por assistida por fluxo ou célula magnética assistida classificação (opcional) 27. </li><li> Seguindo os passos 2.1 a 2.3, produzem vírus 293GPG que codifica uma cadeia contador de TCR clonado a partir de passos 4.4 ou 4.5. </li><li> Para reconstituir integralmente a TCR, transdução de linha de células T expressando estavelmente o hemichain TCR centric gerado nas etapas 5,1-5,3 utilize o vírus a partir do passo 5.4. Realizar transdução como descrito nos passos 5,1-5,2. </li><li> Purificar CD3 + transfectantes utilizando anti-CD3 separação de células magnética assistida seguindo o protocolo do fabricante, 2-3 dias após o passo 5.5 27. </li><li> Para validar a especificidade do antigénio, manchar os transfectantes que expressam TCR clonotípicas compostos da hemichain TCR centrada emparelhado com vários contra-correntes, com os mAbs co-receptor de anti-CD3 e / ou, e multimero de HLA, 3-5 dias após a purificação CD3. Analise as células por citometria de fluxo (Figura 4-5) 19. </li></ol>

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<li>Chinnasamy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TCR+targeting+the+HLA-A%2A0201-restricted+epitope+of+MAGE-A3+recognizes+multiple+epitopes+of+the+MAGE-A+antigen+superfamily+in+several+types+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer.</a> J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).</li>
</ol>

A University Health Network registrou uma patente relacionada a essa metodologia, na qual N.H., M.N. e T.O. são nomeados como inventores. Os demais autores não têm conflitos de interesse financeiros.

O primeiro requisito para a aplicação bem sucedida deste método é alcançar a eficiência de transdução suficiente de células T primárias com o hemichain de interesse. Na nossa experiência, a combinação de PG13 utilizando como linha celular de empacotamento e pMX como resultado o vector retroviral na expressão estável e eficiente do gene introduzido em células T humanas primárias. células de empacotamento PG13 pode ser clonado de uma única célula para seleccionar para células de empacotamento de título elevado para melhor...

receptores de células T (TCR) são receptores heterodiméricos imunes adaptativas expressa por linfócitos T, compostas por uma cadeia TCRα e TCRβ. Eles são gerados por meio de rearranjo somático de V (D) J segmentos de genes, o que produz um repertório diverso altamente capazes de reconhecer configurações virtualmente ilimitado de complexos de HLA / péptido. Clinicamente, as células T manipuladas para expressar clonotípico TCRs específicos para antigénios associados a tumores demonstraram eficácia em uma variedade de cancros 1. No entanto, muitos TCRs clonados para este propósito não têm afinidade suficiente para o antigénio de interesse, o que limita a sua aplicação terapêutica. Aqui, descrevemos um método para superar esta limitação para TCRs existentes, explorando cadeia de centralidade. Tem sido relatado que um hemichain TCR poderia desempenhar um papel mais dominante no reconhecimento do antigénio alvo 2, aqui denominado centralidade. análises estruturais de cristal têm mostrado que um centradahemichain de um TCR poderia ser responsável pela maior parte da pegada do MHC / péptido complexo 3,4. Utilizando este conceito, já anteriormente demonstrado que a SIG35α TCRα pode emparelhar com um repertório diversificado de cadeias TCRβ e manter a reactividade contra o peptídeo MART1 27-35 apresentado por HLA-A2 5. Resultados semelhantes foram obtidos com o TCR TAK1, onde o hemichain TCRβ centrada emparelhado com várias cadeias TCRα e mantida a reactividade para o péptido WT1 235-243 apresentado por HLA-A24 6. Ambos MART1 e WT1 são antigénios associados a tumores. Chain-centricity também foi aplicado para estudar o reconhecimento do antígeno de TCR CD1d-restritas invariantes natural killer (iNKT), emparelhando a invariante cadeia Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα de TCRs iNKT humanos com diferentes cadeias Vβ11 TCRβ 7. Em todos os casos, fomos capazes de gerar um repertório de novo de TCR por transdução do hemichain TCR centric às células T do sangue periférico, onde a hemichain introduzido emparelhados com o TCRα endógena ou TCRβ contra-correntes. Em essência, o hemichain centrada serve como um isco, que pode ser usado para identificar as contra-correntes adequadas, as quais quando combinadas em conjunto formam TCRs que mantêm a especificidade do antigénio de interesse, mas variando na afinidade. A partir destes novos repertórios, fomos capazes de isolar TCR clonotípicas com uma resistência melhorada contra a interacção do antigénio alvo em comparação com os TCRs pré-existentes. Portanto, acreditamos que este método irá acelerar o gasoduto de identificar TCRs ideais para aplicação clínica.

<table><tbody><tr><td>0,05% de tripsina-EDTA</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>325-043-CL</td><td></td></tr><tr><td>293GPG células</td><td>geradas por Ory et al. (ref 8)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>800-010-CG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>800-015-CG</td><td></td></tr><tr><td>Sal de ampicilina sódica</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>400-110-IG</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>BioShop</td><td>CCL402</td><td></td></tr><tr><td>Desoxinucleotídeo (dNTP) Solução Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, piruvato</td> Life <td>Technologies</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>EZ-10 Kit de Extração de Gel DNA de Coluna de Rotação</td><td>BS353</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Life Technologies</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Corning</td><td>431220</td><td>Membrana SFCA de poro de 0,45 mm Membrana</td></tr><tr><td>anti-CD271 humana conjugada com FITC (NGFR) mAb</td><td>Biolegend</td><td>345104</td><td>clone ME20.4</td></tr><tr><td>Clone anti-humano conjugado com FITC CD3 mAb</td><td>Biolegend</td><td>300440</td><td>clone UCHT1</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611L</td><td>usado para montagem de DNA de várias peças</td></tr><tr><td>Pentâmero HLA-A2</td><td>Proimmune</td><td>depende do peptídeo antigênico</td><td>O multímero HLA-A2/MART1 usado aqui foi comprado de</td></tr><tr><td>monômeros HLA/CD1d</td> Proimmune <td>NIH Tetramer Core Facility</td><td></td><td>multimerizar monômeros de acordo com o protocolo fornecido pela instalação central de tetrâmero do NIH</td></tr><tr><td>Soro AB humano</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>microesferas CD3 humanas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-101</td><td></td></tr><tr><td>IOTest Beta Mark TCR V beta Kit de repertório</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM3497</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat 76 células</td><td>Gerado por Heemskerk et al. (ref 10)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>800-060-LG</td><td></td></tr><tr><td>LS MACS coluna</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alfa Competente E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td><td>usado para digestão EcoRI e NotI</td></tr><tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td>usado para purificação de plasmídeo</td></tr><tr><td>PC5 conjugado anti-humano CD8 mAb</td><td>Beckman Coulter</td><td>B21205</td><td>clone B9.11</td></tr><tr><td>Células PG13</td><td>ATCC</td><td>CRL-10686</td><td></td></tr><tr><td>Phusion HF Buffer Pack</td><td>New England Biolabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion&nbsp; DNA polimerase de alta fidelidade</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>pMX vetor retroviral</td><td>Cell Biolabs</td><td>RTV-010</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-9268</td><td></td></tr><tr><td>Proleucina (interleucina-2 humana recombinante)</td><td>Novartis</td><td>by Rx apenas</td><td>produto equivalente pode ser adquirido da Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD3 humano purificado</td><td>Biolegend</td><td>317301</td><td>clone OKT3, usado para estimulação de células T</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>SA-PE</td><td>Life Technologies</td><td>S866</td><td>usado para multimerizar monômeros da instalação central de tetrâmero do NIH</td></tr><tr><td>SMARTer RACE 5'/3'&nbsp; Kit</td><td>Clontech</td><td>634858</td><td></td></tr><tr><td>Água estéril</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>809-115-LL</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Sistema de Síntese de Fita Inicial</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td>para síntese de cDNA</td></tr><tr><td>Seringa</td><td>BD</td><td>301604</td><td>10 ml, ponta deslizante</td></tr><tr><td>Cloridrato de tetraciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-293</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2700</td><td>usado para transfectar células 293GPG</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td></td></tr></tbody></table>

gerando<em&gt; de novo</em&gt; antígeno-específica t humano receptores celulares por transdução retroviral de centric hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

receptores de células T (TCR) são utilizados clinicamente para dirigir a especificidade das células T para tumores alvo promissor como uma modalidade de imunoterapia. Por conseguinte, a clonagem de TCR específicos para vários antigénios associados a tumor tem sido o objectivo de muitos estudos. Para provocar uma resposta eficaz de células T, o TCR deve reconhecer o antigénio alvo com afinidade óptima. No entanto, a clonagem, tais TCRs tem sido um desafio e muitos TCRs disponíveis possuem afinidade sub-ótima para o antigénio correspondente. Neste protocolo, descrevemos um método de clonagem de novo de alta afinidade TCRs antígeno-específicas usando TCRs existentes, explorando hemichain centralidade. Sabe-se que para algumas TCR, cada TCRα ou TCRβ hemichain não contribuem igualmente para o reconhecimento do antigénio, e a hemichain dominante é referido como o hemichain centrada. Nós mostramos que, emparelhando o hemichain centrado com contra-correntes diferentes da cadeia contador original, somos capazes de manter o antígeno specificity, enquanto modula a sua força de interação para o antigénio cognato. Assim, o potencial terapêutico de um determinado TCR pode ser melhorada pela optimização do emparelhamento entre as centrais e contador hemichains.

Sem o conhecimento prévio de que hemichain cadeia é centrada, a cadeia TCRα e TCRβ deve ser clonadas separadamente e transduzidos para células T de sangue periférico, o que foi feito no caso do HLA-A24 / WT1 reactivo TAK1 TCR (Figura 1). Transdução de TAK1β produziram uma frequência notavelmente mais elevada de células T específicas de antigénio. Por outro lado, a transdução de um hemichain não centrada não produziria de novo as células T positivas multímero, co...

Descreve-se aqui um novo método para gerar receptores de células T específicas para o antigénio (TCR) por emparelhamento a TCRα ou TCRβ de um TCR existente, possuindo a especificidade do antigénio de interesse, com hemichain complementar do repertório do receptor de células T periféricas. Os TCRs gerados de novo manter-antigénio com especificidade uma afinidade variável.

Gerando<em&gt; De Novo</em&gt; Antígeno-específica T Humano receptores celulares por Transdução retroviral de Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

O objetivo geral deste procedimento experimental é gerar receptores de células T de novo, ou TCRs, que reconheçam um antígeno específico de interesse. Este método pode auxiliar no isolamento de receptores de células T ideais em um campo de imunoterapia com engenharia genética. A principal vantagem desta técnica é que apenas uma cadeia hemi-alfa ou hemi-beta precisa ser isolada para gerar novos receptores de células T específicos para o antígeno.Após a eluição do TCR, clone o gene por meio da combinação de cada fragmento linear com um agente comercial de mistura mestra para montagem e incube a mistura a 50 graus Celsius por uma hora. Ao final da incubação, transforme E. coli quimicamente competente com o plasmídeo montado seguindo o protocolo do fabricante e plaque as bactérias transformadas em placas de ágar para incubação de 18 horas a 37 graus Celsius. No dia seguinte, transfira uma única colônia bacteriana para 50 mililitros de meio de caldo de lisogenia e incube por 16 horas em banho térmico agitado a 37 graus Celsius e 200 rotações por minuto.Em seguida, utilizando um kit Midiprep comercialmente disponível, conforme o protocolo do fabricante, purifique o plasmídeo e dilua o DN

generating-de-novo-antigen-specific-human-t-cell-receptors-retroviral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós apresentamos um protocolo para a produção de antígenos específicos do mouse células T usando transdução...

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

Um protocolo rápido, simples e de baixo custo para a geração de doador-derivado multivirus específico CTLs (rctl) para infusão de células-tronco hematopoéticas alogênico transplante (TCTH) destinatários em risco de desenvolver infecções CMV, EBV ou Adv. Este processo de fabricação é compatível com GMP e deve garantir a mais ampla implementação de T-cell imunoterapia além de centros especializados.

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Este vídeo demonstra uma técnica para fabricar células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) ex vivo. As células T humanas são incubadas com esferas magnéticas revestidas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, juntamente com um meio suplementado com interleucina-2 (IL-2), levando à ativação e proliferação de células T. Vetores lentivirais transgênicos são introduzidos, permitindo que o RNA transgênico se integre ao genoma do hospedeiro e expresse o transgene. Isso resulta nas células T...

Uma técnica ex vivo para fabricar células T receptoras de antígeno quimérico

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) específico do antígeno por meio de transdução retroviral. As células T CD8+ murinas ativadas são adicionadas a uma placa de micropoços revestida com fragmentos de fibronectina recombinante. Vetores retrovirais contendo RNA transgênico que codifica um receptor de antígeno quimérico específico do antígeno (CAR) são então introduzidos e a placa é centrifugada para facilitar a transdução. Após a incubação,...

Uma técnica para a geração de células T CAR específicas para antígenos

Adenoviral de transferência do gene em células T CD4 naive com a expressão transgénica do receptor de adenovirus Coxsackie possibilita a análise molecular da diferenciação de células T...

Transdução de adenovírus Naive CD4 células T para estudar a diferenciação Treg

Este artigo descreve um método para a geração e propagação de clones de células T humanas que respondem especificamente a um aloantígeno definido. Este protocolo pode ser adaptado para clonagem de células T humanas específicas para uma variedade de ligantes peptídicos-MHC.

Geração de Células T humanas alo-específicos a partir de Sangue Periférico

Apresentamos um protocolo rápido e flexível para um único sistema de expressão in vivo baseado em receptor de células T (TCR) retroviral.  Vetores retrovirais são usados para transduzir células progenitoras da medula óssea para estudar o desenvolvimento de células T e a função de um único TCR in vivo como uma alternativa aos camundongos transgênicos TCR.

Transdução retroviral de Células de Medula Óssea progenitoras para gerar células T Receptor Retrogenic Mice

O atual combina de protocolo único celular emparelhado humana TCR alfa e beta cadeia sequenciamento com simplificada geração de vetores retrovirais compatíveis com expressão de TCR in vitro e in vivo .

Aerodinâmico única célula TCR isolamento e geração de vetores retrovirais para In Vitro e In Vivo de expressão de TCRs humanas

Esse protocolo agiliza a produção de vetores retrovirais e a transdução de células T murinas, facilitando a geração eficiente de células CAR-T em camundongos.

Geração Eficiente de Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Murino (CAR)-T

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho simplificado para gerar e testar células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Geração de células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano

Um protocolo detalhado é fornecido para o uso da tecnologia CRISPR / Cas9 para obter knock-in direcionado altamente eficiente de grandes construções multicistrônicas em células T humanas primárias por meio da via de reparo de DNA de junção de extremidade mediada por homologia (HMEJ). As células T projetadas com este protocolo adaptável ao cGMP mantêm excelente expansão celular, citotoxicidade e produção de citocinas.

Engenharia não viral de células T humanas primárias por meio de integração direcionada de junção de extremidade mediada por homologia de grandes modelos de DNA

Aprenda a gerar receptores de células T antígeno-específicos de novo por transdução retroviral de hemicadeias centricas. Este método simplifica a engenharia de TCRs para imunoterapia gênica.

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