Name: Transdução retroviral de células T helper como uma abordagem genética para estudar mecanismos que controlam a sua diferenciação e função (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Aprenda a isolar células T helper murinas primárias e transduzi-las com vetores retrovirais para estudar vias reguladoras na diferenciação celular. Este método eficiente permite analisar a função de microRNAs na biologia de células T.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Conselho de Pesquisa em Biotecnologia e Ciências Biológicas (BBSRC) (BB/H018573/1) e uma bolsa da BD Biosciences.

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Os autores não têm interesse conflitante na publicação deste trabalho.

Retroviral superexpressão de genes mediada é uma maneira poderosa para analisar a função das células T helper, como seu desenvolvimento e função é muitas vezes determinada pelo nível de reguladores chaves expressão. No entanto, a interpretação cuidadosa dos resultados é necessária porque os níveis de expressão significativamente superiores aos do gene endógeno pode introduzir muitos artefatos. Portanto, esta técnica deve ser combinada com outros para verificar a relevância da função. Por exemplo, a sobre-expressão deve ser complementada por uma expressão reduzida usando siRNAs ou nocaute de genes, se disponível. Com miRNAs, nós complementada experimentos superexpressão com os de bloqueio usando vírus que overexpressed miRNA artificial alvejando sites que atuaram como inibidores competitivos para um miRNA 15. células transduzidas retrovirais podem também ser utilizados em ensaios bioquímicos envolvendo ARN e análise de proteínas. No entanto, a principal limitação destas experiências é a eficiência de transdução resulting numa população mista de células transduzidas e não transduzidas. Portanto, estes ensaios irá provavelmente exigir triagem da GFP + população. Finalmente, em ensaios in vitro de diferenciação deverá ser combinado com experiências in vivo, e uma maneira que isso pode ser conseguido é por transferência adoptiva, as células T transduzidas em murganhos e após a sua diferenciação e o seu efeito sobre a resposta imune. Uma das limitações principais do presente sistema é o tamanho do genoma de ARN que podem ser embalados na cápside retroviral. Em nossa experiência, o tamanho máximo de inserção para o sistema retroviral MIG que dá uma boa produção de vírus é 3-3,5 kb. Portanto, os genes maiores não podem ser analisados ​​com este sistema, uma vez que os títulos de vírus dar pobres. No entanto, a maioria dos genes são menores do que este tamanho de modo que este sistema é útil para uma grande variedade de estudos de genes. Com a transdução retroviral, várias alternativas dentro destes Protocols têm sido utilizados. Muitos investigadores têm utilizado as linhas de células de empacotamento que expressam de forma estável os genes retrovirais (por exemplo de referência 16). No entanto, temos obtido os títulos mais elevados utilizando células HEK 293T padrão com co-transfecção do vírus auxiliar vector PCL-Eco. Isolamento de células auxiliares T ingénuos também pode ser alcançada através de separação de células, em vez do protocolo coluna de pérolas e a separação magnética de células, mas isto requer o acesso a um seleccionador de células, e os custos de tempo tipo são tipicamente mais elevado do que os reagentes de grânulo. Finalmente, existem variações sobre condições de ativação usados ​​para diferenciar células T helper para os diferentes subgrupos. Por exemplo, a estimulação de TCR de células para muito tempo antes da exposição a condições de indução Treg podem inibir a indução 16. Isto pode ser um problema porque a expressão retroviral requer a divisão celular induzida por estimulação das células. No entanto, descobrimos indução Treg eficiente usando este protocolo com O activ / Nção antes da transdução retroviral. Dentro destes protocolos, a aplicação bem-sucedida requer vários fatores. preparações retrovírus elevado título precisa transfecção eficiente das células 293T HEK DNA tão alta qualidade e precisão preparado 2x HBS são importantes. Além disso, a densidade de células das células HEK 293T necessita de ser cerca de 50% no ponto de transfecção porque boa expressão do ADN transfectado requer que as células estão a crescer activamente, e este será inibida se as células são demasiado escasso ou densa. Células na densidade ideal durante a transfecção deve chegar a confluência em algum momento durante as etapas de coleta de vírus, mas eles vão continuar a produzir stocks de vírus de título elevado durante todo o tempo para a última coleção. A diferenciação eficiente de células T auxiliares exige uma boa qualidade célula para assegurar que as células são isoladas a pureza ilustrado na Figura 1. De igual modo, a qualidade das células é dependente da FR murganhosom que foram isolados. Para estes estudos, utilizou-se 6-8 semanas de idade C57BL / 6. ratos mais velhos podem ter células menos ingênuos, e outras linhagens podem diferir em sua diferenciação. Por exemplo, ratinhos BALB / c são mais propensas a respostas Th2 do que murganhos C57BL / 6 17, de modo tal como acima referido, C57BL / 6, as células T podem ser difíceis de induzir uma resposta de Th2. Além disso, nenhuma das condições de diferenciação pode variar um pouco, de laboratório para laboratório, e o efeito de sobre-expressão de genes só pode tornar-se aparente em condições sub-óptimas de modo concentrações de citocinas nas diversas condições de polarização pode precisar de ser ajustada. Por fim, os efeitos do gene sobre-expresso ou as condições de polarização na proliferação das células pode influenciar a eficiência de transdução de medição para que os efeitos do gene de interesse pode requerer optimização do tempo e da concentração dos reagentes de polarização. Optimizando todos estes fatores devem levar a resultados informativos com este sistema.

A resposta imune deve ser altamente regulada para eliminar infecções, mas evitar ataques ao auto-tecido que levam à autoimunidade. As células T auxiliares desempenham um papel essencial na regulação da resposta imune, e um grande esforço tem sido realizado para entender seu desenvolvimento e função (ilustrado em várias revisões recentes 1-3). No entanto, muitas questões permanecem e muitas abordagens têm sido utilizadas para estudar os mecanismos que controlam o desenvolvimento e a função das células T auxiliares. Estes variaram desde o uso de sistemas de cultura de células in vitro até animais inteiros. Os sistemas de cultura de células, especialmente aqueles que usam linhagens celulares, oferecem o benefício da facilidade de uso e a capacidade de gerar grande quantidade de material para fazer análises bioquímicas sofisticadas. No entanto, eles sofrem de sua capacidade limitada de reproduzir as condições reais que ocorrem em uma resposta imune. Em contraste, experimentos com animais inteiros oferecem o benefício da relevância, mas podem sofrer de dificuldades de manipulação e capacidade de realizar controles precisos, além de seus grandes custos e implicações éticas. No entanto, a grande maioria dos estudos com células T auxiliares hoje ainda requer o uso de experimentos com animais inteiros envolvendo células T primárias devido à incapacidade das linhagens celulares de duplicar as etapas exatas que ocorrem em todo o animal. Portanto, é essencial utilizar abordagens econômicas que sejam altamente informativas. 
A genética é uma ferramenta poderosa para estudar o desenvolvimento e a função das células T auxiliares, mas os métodos tradicionais que envolvem nocautes de genes ou transgenes são demorados e caros, por isso muitas vezes estão fora do alcance de pequenos laboratórios. No entanto, a transdução retroviral oferece uma abordagem genética poderosa, rápida e econômica para estudar os mecanismos de produtos gênicos específicos. Portanto, é comumente usado em artigos que estudam o desenvolvimento e a função das células T auxiliares. 
Otimizamos um procedimento para transdução retroviral de células T auxiliares. Ele utiliza o vetor de expressão retroviral pMIG (vírus de células-tronco murinas-sítio de entrada ribossômico interno-proteína fluorescente verde), no qual o gene de interesse pode ser clonado e, assim, expresso a partir da repetição terminal longa (LTR) do retrovírus 4. Além disso, a jusante do gene inserido de interesse está uma sequência de entrada de ribossomo interno (IRES) seguida pelo gene da proteína fluorescente verde (GFP) para que as células transduzidas possam ser facilmente seguidas por sua expressão de GFP. O vetor foi originalmente derivado dos vetores do vírus de células-tronco murinas (MSCV), que contêm mutações nos locais de ligação repressora nos LTRs, tornando-os resistentes ao silenciamento e, portanto, dando alta expressão em muitos tipos de células, incluindo células T auxiliares 5,6. A produção de retrovírus de alto título requer um protocolo simples de transfecção transitória de células 293T do rim embrionário humano (HEK) com o vetor MIG e um vetor de vírus auxiliar que expressa os genes retrovirais GAG, Pol e Env. Para isso, o vetor 7 do vírus auxiliar pCL-Eco funciona bem na produção de retrovírus incompetentes de replicação de alto título. 
Aqui esses protocolos para produção retroviral e transdução de células T murinas primárias são descritos, além de alguns de nossos resultados usando essa abordagem para estudar a regulação de miRNAs da expressão gênica que controla a diferenciação de células T auxiliares. Os miRNAs são pequenos RNAs de aproximadamente 22 nucleotídeos de comprimento que regulam pós-transcricionalmente a expressão gênica, visando sequências homólogas em proteínas que codificam RNAs mensageiros e suprimem a tradução e induzem instabilidade da mensagem 8,9. Os miRNAs desempenham papéis críticos na regulação gênica do desenvolvimento. Eles são essenciais nos estágios iniciais de desenvolvimento, pois os embriões que não conseguem produzir miRNAs morrem em um estágio muito precoce 10. Além disso, os miRNAs são importantes mais tarde no desenvolvimento de muitos tecidos. Acredita-se que eles funcionem ajustando a expressão de genes necessários para programas de desenvolvimento 1. Nas células T auxiliares, os miRNAs desempenham múltiplos papéis e são necessários para o desenvolvimento de células T reguladoras (Treg) 11-14. Usamos a transdução retroviral como meio de dissecar os mecanismos de regulação do miRNA da diferenciação de Treg 15. Por meio de tais estudos, importantes miRNAs individuais foram determinados por superexpressão mediada por retrovírus. Posteriormente, genes relevantes regulados por esses miRNAs foram identificados a fim de entender as vias moleculares reguladas por miRNAs na diferenciação de células T auxiliares.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>Solução de penicilina estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MIG vector</td><td></td><td>Addgene Plasmid 9094</td><td></td></tr><tr><td>vetor pCL-Eco</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 12371</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Contas magnéticas kit de células CD4 de camundongo&nbsp;</td><td>Invitrogen (Dynabeads)</td><td>11415D</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Beads&nbsp;</td>Colunas de separação de células MS <td>Miltenyi Biotech</td><td>130-048-102</td><td></td></tr><tr><td>Colunas de separação de células</td> LS <td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Colunas de separação de células LS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD25 Biotenilated MAb&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>85059</td><td>clone 7D4</td></tr><tr><td>CD62L Biotenilated MAb&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553149</td><td>clone MEL-14</td></tr><tr><td>Polybrene (Hexadimethrine Brometo)</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>eBiosciences</td><td>16-0031-85</td><td>clone 145-2C11&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD28</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td>clone 37.51&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-IL-4</td><td>BD Biosciences</td><td>559062</td><td>clone 11B11</td></tr><tr><td>Anti-IFN-gama</td><td>BD Biosciences</td><td>559065</td><td>clone XMG1.2</td></tr><tr><td>Anti-IL-2</td><td>BD Biosciences</td><td>554425</td><td>cloneJES6-5H4</td></tr><tr><td>IL-12 p70 recombinante</td><td>eBiosciences</td><td>14-8121</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 recombinante</td><td>BD Biosciences</td><td>550067</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta recombinante</td><td>eBiosciences</td><td>14-8342-62</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 recombinante</td><td>eBiosciences</td><td>14-8061</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 recombinante</td><td>eBiosciences</td><td>14-8021</td><td></td></tr><tr><td>PMA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>eBiosciences</td><td>00-4506</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>16005</td><td>O paraformaldeído é tóxico, então use o cuidado apropriado ao manusear&nbsp;</td></tr><tr><td>Conjunto de tampão de coloração Foxp3</td><td>eBiosciences</td><td>00-5523</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4&nbsp; FITC</td><td>eBiosciences</td><td>11-0041</td><td>clone GK1.5&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD8a perCP-cy5.5</td><td>eBiosciences</td><td>45-0081-80</td><td>clone 53-6.7&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-MHCII PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0920</td><td>&nbsp; clone HIS19</td></tr><tr><td>Anti-CD25 PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0251-82</td><td>&nbsp; clone PC61.5&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD62L PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0621-82</td><td>clone MEL-14&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD44 APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-0441</td><td>clone IM7&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-IFN-gama FITC&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>11-7311-81</td><td>clone XMG1.2</td></tr><tr><td>Anti-IL-4 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554435</td><td>clone 11B11</td></tr><tr><td>Anti-IL-9 PE ou APC</td><td>eBiosciences/Biolegend</td><td>50-8091-82/514104</td><td>clone RM9A4</td></tr><tr><td>Anti-IL-17a PE</td><td>BD Biosciences</td><td>559502</td><td>clone TC11-18H10</td></tr><tr><td>Anti-Foxp3&nbsp; APC ou PE</td><td>eBiosciences</td><td>17-5773-82/12-5773-80&nbsp;</td><td>clone FJK-16s</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4-2H2O</td><td>Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose/Glicose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, ácido livre</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Dissódico</td><td>Sigma</td><td>D2900000</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>237205</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr></tbody></table>

transdução retroviral de células t helper como uma abordagem genética para estudar mecanismos que controlam a sua diferenciação e função

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

O desenvolvimento e a função das células T auxiliares devem ser rigidamente regulados para induzir uma resposta imune apropriada que elimine patógenos específicos, mas evite a autoimunidade. Muitas abordagens envolvendo diferentes organismos modelo têm sido utilizadas para entender os mecanismos que controlam o desenvolvimento e a função das células T auxiliares. No entanto, estudos usando modelos de camundongos provaram ser altamente informativos devido à disponibilidade de sistemas genéticos, celulares e bioquímicos. Uma abordagem genética em camundongos usada por muitos laboratórios envolve a transdução retroviral de células T auxiliares primárias. Esta é uma abordagem poderosa devido à sua relativa facilidade, tornando-a acessível a quase todos os laboratórios com habilidades básicas em biologia molecular e imunologia. Portanto, vários genes em formas selvagens ou mutantes podem ser prontamente testados quanto à função em células T auxiliares para entender sua importância e mecanismos de ação. Otimizamos essa abordagem e descrevemos aqui os protocolos para produção de retrovírus de alto título, isolamento de células T auxiliares murinas primárias e sua transdução por retrovírus e diferenciação para os diferentes subconjuntos auxiliares. Finalmente, o uso dessa abordagem é descrito na descoberta de mecanismos utilizados por microRNAs (miRNAs) para regular as vias que controlam o desenvolvimento e a função das células T auxiliares.

O sucesso deste sistema experimental requer populações altamente pura de células T e preparações retrovirais de título elevado. Os resultados representativos são mostrados aqui como exemplos de experiências bem sucedidas. A Figura 1 mostra o grau de pureza típico das populações pré e pós-seleccionado, em cada fase do protocolo de isolamento de células auxiliares T ingénuas. Figura 2 e 3 ilustram a análise da produção de retrovírus, através da expressão de GFP nas células de HEK 293T transfectadas (Figura 2) e as células T transduzidas (Figura 3). Eficiências de transfecção das células HEK 293T pode variar significativamente com diferentes construções retrovirais, mas isso nem sempre se correlaciona com o nível de produção de retrovírus observados com o número de células GFP + T. Além disso, o número de células GFP + T podem variar dependendo das condições de polarização. Além disso, o MEAN nível de expressão de GFP e o gene inserido pode variar, dependendo do número de cópias de vírus integrado, o efeito do local de integração na transcrição, e mecanismos de regulação pós-transcricional que afectam a transcrição viral. Finalmente, a Figura 4 mostra alguns resultados típicos que temos observado com a diferenciação das células T auxiliares quando o miARNs miR-15b / 16 são sobre-expressos. Estes resultados mostram um pouco da variabilidade que pode ocorrer dentro de um experimento indivíduo efeitos tão verdadeiro deve ser fundamentada pela análise estatística de múltiplas experiências de repetição usando diferentes preparações de células T auxiliares. Nestas experiências, as respostas de Th2 pode ser difícil observar na / 6 linha C57BL usado aqui, porque eles são propensos a respostas Th1. Do mesmo modo, IL-9 de coloração pode ser difícil de detectar acima do fundo. Portanto, é imperativo fazer controlos isotípicos e configurar uma compensação adequada para garantir ga corretating da expressão das citocinas. Nos nossos resultados verificou-se que o miR-15b / 16 aumenta a indução iTreg através da inibição da via de sinalização de mTOR através da repressão da expressão do Rictor componentes e mTOR 15. miR-15b / 16 pode, por vezes, influenciar Th0, Th1, Th17 e diferenciação em experiências individuais, mas não há nenhum efeito significativo, quando examinado em várias experiências repetidas. Em contraste miR-15b / 16 superexpressão não suprimir significativamente a diferenciação Th9 (ver referência 18). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig1.jpg" /> Figura 1. pureza típica de células T auxiliares em cada fase de isolamento. Citometria de fluxo representativas resultados dos antigénios indicados são mostrados desde a porta de células vivas designados na dispersão frontal (FSC) e os gráficos de dispersão lateral (SSC). Seleção negativa (A) pré e pós-CD4. perfis de expressão de CD4,CD8a e MHCII são mostrados. Estes ilustram o enriquecimento de células T auxiliares e a perda das células T citotóxicas e MHC da classe II que expressam as células. Uma boa purificação deve resultar em ~ 90% de células T CD4 +, nesta fase. (B) a seleção CD25. À esquerda são os perfis de CD4, CD8a e MHCII expressão, e à direita são a CD4 e expressão CD25 perfis pré e seleção post. Neste ponto,&gt; 95% das células CD25 seleccionadas negativamente deve ser CD4 + CD25 -. (C) CD62L selecção. CD4, CD8a, e MHCII perfis de expressão estão apresentados à esquerda. À direita dos perfis de expressão de CD62L e CD44 são mostrados para células pré e pós-CD62L selecionados juntamente com CD4 e CD62L perfil de pós selecionadas células expressão. Após a seleção CD62L praticamente todas as células de memória (CD44 +) são removidos deixando uma população altamente enriquecido de células T helper ingênuos que contém 10-15% de células efetoras (CD62L baixo). Para todosperfis FACS, configurações equivalentes e balanças de um parâmetro específico foram mantidos por toda parte. Os números representam a percentagem de células dentro de uma população fechado. A ligeira diminuição no tamanho das células após a seleção inicial é presumivelmente devido ao estresse mecânico durante o protocolo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig2.jpg" /> Figura 2. Análise de células HEK 293T transfectadas com retrovírus. Expressão da GFP é mostrado em células HEK 293T que eram ou não transfectadas ou transfectadas e analisados após a colheita dos sobrenadantes de cultura viral. análise GFP foi feito em células vivas a partir do portão do FSC e enredo SSC no primeiro painel. Os números representam a percentagem de GFP + células dentro da região fechada. típico teficiências ransfection variar entre 30-90%. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig3.jpg" /> Figura 3. Análise de células T auxiliares retrovirais transduzidas. Expressão da GFP é mostrado em células T auxiliares retrovirais transduzidas após a diferenciação em Th0, Th1, Th2, Th9, Th17, e as condições de polarização Treg para três dias. A análise foi fechado em células vivas e ativados indicados no painel FSC / SSC. eficiências de transdução pode variar entre 10-75%, dependendo da construção e as condições de polarização. Da mesma forma, a intensidade de fluorescência média de expressão GFP pode variar. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 4. Efeito de miR-15b / 16 superexpressão na diferenciação de células T helper em diferentes condições de polarização. Perfis de citocinas representativos são mostrados na GFP + população de células da Figura 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698table1.jpg" /> Tabela 1:. Os tampões utilizados nestes protocolos <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">por favor, clique aqui para baixar esta tabela como uma planilha Excel.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Ajudantecondições de polarização de células T </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th0 </td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th1 </td><td> recombinante-IL-12 </td><td> 20 ng / mL </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th2 </td><td> IL-4 recombinante </td><td> 40 ng / mL </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th9 </td><td> TGF-β recombinante </td><td> 2,5 ng / mL </td></tr><tr><td></td><td> IL-4 recombinante </td><td> 40 ng / mL </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 10 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th17 </td><td> TGF-β recombinante </td><td> 2,5 ng / mL </td></tr><tr><td></td><td> IL-6 recombinante </td><td> 50 ng / mL </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-2 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tregs </td><td> TGF-β recombinante </td><td> 2,5 ng / mL </td></tr><tr><td></td><td> IL-2 recombinante </td><td> 5 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tabela 2: subconjunto de células condições de polarização T helper.

Muitos sistemas experimentais foram utilizados para compreender os mecanismos de regulação do desenvolvimento e função de células T numa resposta imunitária. Aqui uma abordagem genética utilizando transdução retroviral é descrito, que é económico, eficiente tempo, e, o mais importante, altamente informativos na identificação de vias reguladoras.

Transdução retroviral de células T helper como uma abordagem genética para estudar mecanismos que controlam a sua diferenciação e função

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

O objetivo geral deste protocolo é isolar células T auxiliares primárias de camundongos e transduzi-las com construtos de expressão retrovirais para um gene de interesse. Muitos sistemas experimentais têm sido utilizados para compreender os mecanismos que regulam o desenvolvimento e a função das células T em uma resposta imune. Aqui descrevemos uma abordagem genética utilizando transdução retroviral, que é econômica, eficiente em termos de tempo e altamente informativa na identificação de vias regulatórias.Utilizamos esta técnica para analisar a função de microRNAs, que são reguladores importantes da expressão gênica. Usando a transdução retroviral, temos sido capazes de testar a função de microRNAs individuais e a diferenciação de células T auxiliares. Meu colaborador, Oliver Garden, demonstrará o isolamento de células T primárias, e eu demonstrarei a transdução retroviral.24 horas antes da transfeção, divida uma placa de células confluentes na proporção de 1:10 em uma placa de 10 centímetros, de modo que as células estejam cerca de 50% confluentes no dia seguinte. Aproximadamente uma hora antes da transfeção, remova o meio das células e adicione cuidadosamente 9 mililitros de meio fresco para HEK293 T, para evitar que as células se desprendam da placa. Em um tubo cônico de fundo redondo de seis mililitros ou em um tubo cônico de 15 mililitros, adicione cinco microgramas de DNA retroviral, cinco microgramas de DNA do vírus auxiliar e água até um volume de 420 microlitros.Em seguida, adicione 80 microlitros de cloreto de cálcio 2,5 M para atingir um volume final de 500 microlitros. Depois disso, adicione lentamente 500 microlitros de HBS 2x gota a gota à mistura de DNA, sob leve agitação em vórtex, de modo que a solução seja continuamente misturada e os precipitados de fosfato de cálcio se formem em cristais de tamanho uniforme. Posteriormente, transfira a mistura de DNA com fosfato de cálcio para uma câmara de cultura de tecidos.Adicione lentamente a mistura às células, agitando constantemente e suavemente a placa, antes de colocar as células de volta no incubador. Para coletar o vírus no dia seguinte, remova o meio e adicione 10 mililitros de meio fresco HEK293 T às células, tomando cuidado para não destacar as células da placa. À noite, adicione 3,5 mililitros de meio fresco HEK293 T às células e incube-as a quatro graus Celsius por 12 horas.Após aproximadamente 12 horas, colete o meio e alimente as células novamente com 3,5 mililitros de meio fresco para HEK293 T. Repita a coleta do meio mais duas vezes, em intervalos de aproximadamente 12 horas, o que resulta na coleta de cerca de 10 mililitros de estoque viral. Neste procedimento, adicione o baço e os linfonodos ao filtro celular e macere usando a extremidade do êmbolo de uma seringa de cinco mililitros.Em seguida, lave-os com um a dois mililitros de meio R10. Então, transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros e complete o volume até 14 mililitros com R10. Centrifugue as células a 600 ×g durante cinco minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, descarte o sobrenatante vertendo-o com um único movimento limpo, para evitar perturbar o pellet celular. A seguir, adicione dois mililitros de tampão frio de lise de células vermelhas às células. Misture e, então, coloque as células no gelo por 3,5 minutos, com mistura suave durante todo o período.Em seguida, adicione 12 mililitros de meio R10 e centrifugue imediatamente a 600 ×g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Realize os passos de lavagem mais duas vezes com meio R10 para remover qualquer resíduo de tampão de lise de hemácias das células, evitando a morte dos linfócitos. Nesta etapa, distribua alíquotas de oito a dez vezes dez à sétima potência de células por tubo cônico e centrifugue-as a 600 ×g durante cinco minutos a quatro graus Celsius.Descarte o sobrenadante com um único movimento limpo, para evitar perturbar o pellet celular. Em seguida, re-suspenda as células em 100 microlitros de FBS inativado pelo calor. A seguir, adicione 100 microlitros da mistura de anticorpos às células e incube por 30 minutos a quatro graus Celsius, com mistura suave em um agitador rotativo.Em seguida, re-suspenda as microesferas no frasco, agitando-as em vórtex por mais de 30 segundos. Em seguida, transfira as microesferas para um tubo cônico de 15 mililitros e adicione 2 mililitros de meio R10 por mililitro de microesferas. Coloque o tubo no ímã por um minuto.Em seguida, descarte o sobrenatante e re-suspenda as microesferas em quatro mililitros de meio R10. Lave as células ao final da incubação com o anticorpo, adicionando 10 mililitros de meio R10 por tubo e centrifugando a 600 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Derrame o sobrenatante com um único movimento limpo para evitar perturbar o pellet celular e, em seguida, re-suspenda as células em 1 mililitro de meio R10.Posteriormente, adicione 2 mililitros das esferas lavadas ao tubo com células tratadas com anticorpo e incube por 30 minutos a quatro graus Celsius, com mistura suave em rolo. Em seguida, re-suspenda a mistura de células e esferas, pipetando suavemente cinco vezes antes de colocar o tubo no ímã de esferas por dois minutos. Transfira o sobrenadante contendo as células selecionadas negativamente para um novo tubo e repita a seleção negativa mais uma vez.Neste procedimento, centrifugue as células T positivas para CD4 a 600 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius e re-suspenda em 150 a 200 microlitros de meio R10 por dez elevado à oitava potência de células. Em seguida, adicione dois microlitros do anticorpo monoclonal CD25 biotinilado em estoque às células e incube por 30 minutos a quatro graus Celsius com mistura suave em rolo. Posteriormente, lave as células adicionando 10 mililitros de tampão para coluna de separação de células e centrifugue a 600 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, remova o máximo possível do sobrenatante e re-suspenda as células em um volume final de aproximadamente 90 microlitros por 10 elevado à sétima células. Posteriormente, adicione 20 microlitros de microesferas de estreptavidina por 10 elevado à sétima células e misture com movimentos suaves. Em seguida, incube por 15 minutos a quatro graus Celsius.Enquanto incuba as células, prepare as colunas MS. Ao final da incubação, lave as células adicionando 10 mililitros de tampão para coluna de separação de células e centrifugue a 600 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Re-suspenda as células em 500 microlitros de tampão para coluna de separação de células, por 10⁸ células.Em seguida, aplique 500 microlitros de suspensão celular na coluna e colete o fluxo que passa. Passe-o pela coluna mais uma vez e colete novamente o fluxo que passa. Depois, lave a coluna três vezes com 500 microlitros de tampão de separação de células, e adicione cada fluxo coletado às células negativas para CD25 já coletadas.Realize a lavagem, a ligação das microesferas de estreptavidina e a preparação da coluna de separação celular conforme mencionado anteriormente, mas utilize a coluna LS. Desta vez, descarte o fluxo que passa e elua as células da coluna com o êmbolo fornecido. Enquanto estiver isolando os linfócitos T ingênuos, recubra uma placa de cultura de tecidos de 24 poços com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 diluídos em DPBS e incube por duas horas a 37 graus Celsius.Imediatamente antes de cultivar as células, lave a placa com 250 microlitros de DPBS por poço, para remover o anticorpo não ligado. Em seguida, remova o DPBS e adicione 1 mililitro de células T CD4 positivas ingênuas em meio R10 durante a noite. No dia seguinte, centrifugue as células a 900 vezes G durante 10 minutos a 30 graus Celsius.Em seguida, colete o meio e adicione 1 mililitro de sobrenadante de cultura viral, preparado a partir do protocolo de produção de vírus. Posteriormente, adicione 1 microlitro de polibreno a 8 miligramas por mililitro e 10 microlitros de HEPES a 1 molar, para auxiliar na captação viral antes de centrifugar as células a 900 ×g durante 90 minutos a 30 graus Celsius. Para diferenciar as células, remova cuidadosamente o sobrenadante de cultura viral e adicione 1 mililitro do meio coletado anteriormente, pois ele contém IL2 e outros fatores de crescimento de linfócitos T.Em seguida, adicione os reagentes indicados na Tabela 2 do manuscrito suplementar e cultive as células por três a quatro dias para diferenciar as células em subconjuntos específicos. Esta figura mostra a pureza típica das populações antes e após a seleção em cada estágio do protocolo de isolamento de células T auxiliares naïve. Os perfis de expressão de CD4, CD8A, MHC II, CD25, CD62L e CD44 ilustram a perda de células MHC Classe 2, além de células T citotóxicas, regulatórias e de memória.Isso resulta em uma população maior que 95% de células T positivas para CD4, com aproximadamente 85% a 90% sendo células naïve e as restantes 10% a 15% sendo células efetoras. Nesta figura, a expressão de GFP é mostrada em células HEK293T, que foram ou não transfectadas, e analisadas após a coleta dos sobrenadantes de cultura viral. A análise de GFP foi realizada em células viáveis a partir do gate no gráfico FSE e SSE.As eficiências típicas de transfeção variam entre 30% e 90%. Aqui, a expressão de GFP é mostrada em células T auxiliares transduzidas por retrovírus após diferenciação em condições de polarização Th0, Th1, Th2, Th9, Th17 e Treg por três dias. As eficiências de transdução variam entre 10% e 75%, dependendo do construto e das condições de polarização. Abaixo estão os perfis representativos de citocinas na diferenciação de células T auxiliares em diferentes condições de polarização.Uma vez dominadas, essas técnicas podem ser uma maneira poderosa de analisar a função gênica e o desenvolvimento e funcionamento dos linfócitos T auxiliares. Lembre-se apenas de que resultados informativos dependem da qualidade das células e dos reagentes. Portanto, é importante otimizar os protocolos de transdução, bem como o isolamento e a diferenciação dos linfócitos T auxiliares.

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