Um modelo murino de Grupo B Streptococcus Colonização Vaginal

O objetivo geral deste modelo animal é estabelecer o Streptococcus do grupo B, ou colonização por GBS do trato vaginal murino. Este método pode nos ajudar a entender questões-chave sobre a colonização estreptocócica do grupo B, como quais são os fatores bacterianos que são importantes para a colonização, bem como como as respostas do hospedeiro afetam a persistência vaginal. A principal vantagem dessa técnica é que a inoculação, normalmente, resulta em mais de 90% de colonização sem o uso de anestesia, imunossupressores ou agentes espessantes.

Comece com o vórtice de 0,5 miligramas de beta-estradiol, por camundongo, em um tubo cônico de 15 mililitros até que todos os caroços sejam removidos e o beta-estradiol apareça como um pó fino. Em seguida, filtre 100 microlitros de óleo de gergelim, por mouse, no tubo através de um filtro de 0,45 mícron e vortex o tubo novamente. Quando o hormônio é distribuído como uma suspensão homogênea por todo o óleo, coloque o reagente em uma nova seringa de 10 mililitros e conecte uma agulha de calibre 18 e uma polegada.

Alicote 100 microlitros da suspensão em uma seringa de tuberculina de um mililitro, por mouse, e equipe cada seringa de tuberculina com uma agulha estéril, calibre 26, de meia polegada. Em seguida, administre 100 microlitros de beta-estradiol no quadrante inferior esquerdo ou direito da cavidade peritoneal de cada animal. No mesmo dia da injeção, cultive uma cultura líquida de cinco mililitros durante a noite da cepa GBS de interesse no caldo Todd Hewitt, ou THB, a 37 graus Celsius.

Na manhã seguinte, subcultive o GBS em um volume de um a 10 em THB fresco por uma incubação de duas a três horas a 37 graus Celsius, até que a bactéria atinja a fase intermediária. Em seguida, transfira a subcultura para um tubo cônico estéril de 15 mililitros e centrifugue as células bacterianas. Ressuspenda o pellet em 200 microlitros de PBS estéril.

Em seguida, aumente o volume total da suspensão para um mililitro de PBS por 10 camundongos, para atingir um OD600 de 0,4 em um novo tubo de cultura de cinco mililitros. Transfira a cultura para um novo tubo de 15 mililitros e reproduza as bactérias. Em seguida, ressuspenda as células em PBS em um décimo do volume original.

Reserve 50 microlitros da bactéria para diluição em série e plaqueamento em ágar THB, para determinar a UFC exata do inóculo. Em seguida, coloque 10 microlitros de GBS em uma ponta de pipeta de carregamento de gel de 200 microlitros e prenda manualmente a pele solta na nuca do pescoço, do primeiro animal, entre o polegar e o indicador, seguida de imobilização da cauda. Insira a ponta da pipeta de 5 a 10 milímetros no lúmen vaginal e dispense todo o volume do inóculo.

Em seguida, solte imediatamente a nuca e levante a cauda para elevar a extremidade traseira do animal, enquanto caminha com as patas dianteiras em uma superfície dura. Após um minuto, inspecione visualmente a abertura vaginal em busca de refluxo de inóculo. Pouco antes de esfregar, pré-molhe o algodão em PBS e contenha um dos ratos como acabamos de demonstrar.

Insira o cotonete 10 milímetros no lúmen vaginal e gire suavemente quatro vezes no sentido horário e quatro vezes no sentido anti-horário, enquanto aplica uma leve pressão na parede vaginal. Coloque o cotonete em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 100 microlitros de PBS e vortex o tubo e o cotonete por cerca de 15 segundos para liberar as bactérias das fibras de algodão. Em seguida, dilua em série cada amostra em PBS e coloque 20 microlitros de um a 10 a um a 10.000 diluições em placa de ágar médio diferencial, preparada de acordo com as instruções do fabricante, para incubação a 37 graus Celsius por 24 horas.

As colônias de GBS aparecerão como rosa brilhante ou malva. Para coletar a lavagem vaginal, use uma ponta de pipeta de carregamento de gel de 200 microlitros para dispensar 20 microlitros de PBS no lúmen vaginal. Pipete suavemente todo o volume para cima e para baixo quatro vezes dentro do lúmen.

Em seguida, usando a mesma ponta, retire todo o volume. Para análise do fluido de lavagem a jusante, dispense a lavagem em um tubo de microcentrífuga de 0,7 mililitro. Para a homogeneização da dissecção tecidual, borrife no abdômen ventral de um animal sacrificado com 70% de etanol e use uma tesoura estéril para abrir a cavidade abdominopélvica.

Deslocar os intestinos para que o trato reprodutivo fique exposto. Em seguida, corte os dois chifres uterinos, no meio do comprimento, entre o corpo uterino e os ovários. Usando tesouras e pinças, separe a gordura visceral, as membranas e a bexiga urinária do trato reprodutivo, movendo os tecidos caudalmente.

Em seguida, corte transversalmente a vagina o mais próximo possível da vulva, para separar o trato reprodutivo do corpo. Transfira o trato reprodutivo intacto para uma placa de Petri estéril e use uma nova lâmina de barbear para separar o útero do colo do útero em um único corte transversal. Separe o colo do útero da vagina com outro corte transversal.

Em seguida, use uma pinça estéril para transferir cada um dos tecidos para tubos individuais, pré-pesados, de dois mililitros contendo 500 microlitros de PBS e grânulos homogeneizadores. Pesar cada tubo de 2 mililitros para determinar os pesos dos tecidos. Em seguida, feche bem os tubos com tampa de rosca e homogeneize os tecidos, por um minuto, na velocidade máxima, em um homogeneizador de tecidos.

Para quantificar a carga bacteriana, diluir em série 25 microlitros de homogeneizado de tecido e colocar em placas de um a 10 a 10.000 diluições em placas de ágar médio diferencial, para uma incubação de 24 horas, a 37 graus Celsius. Para armazenar amostras para quantificação de citocinas, congele os homogeneizados a menos 20 graus Celsius. Nessas imagens, os quatro estágios do ciclo estral do camundongo, conforme determinado pelo fluido de lavagem vaginal em câmara úmida, são demonstrados.

Os camundongos inoculados no estágio de proestro foram colonizados com GBS por mais tempo do que qualquer outro estágio de estro, particularmente aqueles em diestro no momento da inoculação. O estro sustentado promove a persistência do GBS A909 em camundongos CD-1 com uma colonização de 90% observada duas semanas após a inoculação. Em um experimento típico com uma dose de beta-estradiol antes da inoculação, apenas 40 a 50 por cento dos camundongos foram colonizados uma semana após a inoculação, com um GBS médio recuperado que imita a porcentagem de colonização.

Demonstrando que a manutenção do estro contínuo promove a persistência vaginal do GBS na maioria dos camundongos CD-1. O GBS A909 persiste no trato vaginal em camundongos CD-1 endogâmicos e camundongos FVB endogâmicos por, aproximadamente, uma semana. Considerando que a maioria dos camundongos BALB/c e C57BL/6 endogâmicos são colonizados em uma semana por um mês ou mais.

A visualização de GBS positivo para GFP em animais inoculados demonstra a presença de GBS aderido ao epitélio vaginal murino e próximo a outras flora vaginal nativa. É importante evitar o refluxo, durante a inoculação, para garantir que todos os camundongos sejam colonizados. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em uma a duas horas, dependendo do número de animais.

Este modelo permite que pesquisadores no campo das interações hospedeiro / patógeno explorem a capacidade de bactérias, como estreptococos do grupo B, de colonizar o trato reprodutivo feminino. Este procedimento pode ser usado para testar novos compostos ou tratamentos probióticos para responder a perguntas adicionais sobre intervenções terapêuticas.