Name: Análise do SCAP N -glycosylation E Tráfico de Células Humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Aprenda a analisar a N-glicosilação do SCAP e seu tráfego em células humanas usando western blot e microscopia confocal. Este método simplificado facilita o estudo do metabolismo lipídico e doenças metabólicas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Somos gratos aos Drs. Mike S. Brown e Joseph L. Goldstein por sua concordância em publicar este método de acordo com os métodos descritos em suas publicações. Agradecemos ao Dr. Peter Espenshade por compartilhar o plasmídeo GFP-SCAP. Este trabalho foi apoiado por bolsas do NIH NS072838 e NS079701 para D.G., American Cancer Society Research Scholar Grant RSG-14-228-01-CSM para D.G. e OSUCCC Pelotonia Postdoctoral Fellowship para C.C. Também agradecemos o apoio do Ohio State Neuroscience Core (P30 NS038526) e do Programa Terapêutico Translacional OSUCCC e fundos iniciais para D.G.

1. Detecção de proteína endógena em células humanas SCAP <ol><li> Cultura Celular e Tratamento <ol><li> Semear as células ~ U87 1 x 10 6 em um prato de 10 cm, com Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS) e incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas antes do tratamento. </li><li> Lave as células uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS), em seguida, mudar as células para meio DMEM fresco com ou sem glicose (5 mM) durante 12 h. </li></ol></li><li> Preparação de Membrana Celular frações e Nucleares Extractos <ol><li> Lavar as células uma vez com PBS, raspar em 1 ml de PBS, e centrifugar a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender as células num tampão gelado contendo 10 mM de HEPES-KOH (pH 7,6), KCl 10 mM, MgCl2 1,5 mM, ácido etilenodiaminotetracético de sódio 1 mM (EDTA), ácido etileno de sódio glicol-tetraacético 1 mM (EGTA), 250 mM sacarose, e uma mistura de inibidores de protease (5 μg / ml de pepstatina A, 10 ug / ml de leupeptina, 0,5 fluoreto de fenilmetilsulfonilo mM (PMSF), 1 mM de ditiotreitol (DTT), e 25 ug / ml de N-acetil-Leu-Leu-Norleu-al (ALLN)) durante 30 min no gelo. </li><li> Passa extractos de células através de uma 22 L x 1 1/2 agulha 30 vezes e centrifugar a 890 xg, a 4 ° C durante 5 min para isolar núcleos. </li><li> Utilizar o sobrenadante para a separação de fracções de membrana (passo 1.2.7). Ressuspender o sedimento nuclear em 0,1 mL de tampão C (20 mM de HEPES / KOH pH 7,6, 0,42 M de NaCl, 2,5% (v / v) de glicerol, MgCl2 1,5 mM, EDTA de sódio 1 mM, EGTA de sódio 1 mM e uma mistura de inibidores da protease (5 ug / ml de pepstatina A, 10 ug / ml de leupeptina, PMSF 0,5 mM, DTT 1 mM, e 25 ug / ml ALLN)). </li><li> Rodar a suspensão a 4 ° C durante 60 minutos e centrifugar a 20000 xg numa microcentrífuga durante 20 min a 4 ° C. O sobrenadante é designado como &quot;extractos nucleares&quot;. </li><li> Aquece-se os extractos nucleares a 100 ° C durante 10 min com tampão de carregamento de 5x (312,5 mM de Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% de glicerol, 12,5% β-mercaptoetanol e 0,05% de azul de bromofenol) antes de se submeter a SDS-PAGE. </li><li> Centrifuga-se o sobrenadante a partir de centrifugação a 890 xg original a 20.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Para a análise Western blot subsequente, dissolve-se o sedimento em 0,1 ml de tampão SDS de lise (Tris-HCl 10 mM pH 6,8, NaCl 100 mM, 1% (v / v) de sulfato de dodecilo de sódio (SDS), EDTA de sódio 1 mM, e 1 mM EGTA de sódio). Esta é designada &quot;fracção de membrana&quot;. NOTA: Nós usamos 20.000 xg por 20 min para sedimentar membranas. 100.000 xg durante 10 - 20 min foi usado nos papéis de laboratório Brown e Goldstein 15. </li><li> Incubar a fracção da membrana a 37 ° C durante 30 min e determinar a concentração de proteína pelo ensaio de proteína de Bradford. Adicionar uma solução de azul de bromofenol ul 100x antes de submeter as amostras a SDS-PAGE. </li><li> Carga 25 - 50 ug de proteínas de membrana totais num gel de SDS-PAGE a 10% 39. Submeter o gela 80 V durante 15 min, em seguida, mudar para 130 V e correr para outro 115 min. Transferir a 140 mA para 130 min 39. <ol><li> Para a análise de transferência de Western, utilize anticorpo anti-SCAP para detectar a proteína total SCAP. Use isomerase de dissulfito de proteína (PDI), uma proteína residente do ER-40, como um controlo interno. Use anticorpo anti-SREBP-1 para detectar a banda N-terminal de SREBP-1. Use Lamin A como um controlo interno para os extractos nucleares 31. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Análise do SCAP -glycosylation N em células humanas <ol><li> Cultura de células, transfecção, tratamento e <ol><li> Para a análise de membrana, células HEK293T semente ~ 1 x 10 6 em um prato de 10 cm, com meio DMEM suplementado com FBS a 5% e incuba-se as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas antes da transfecção. </li><li> Diluir 4-8 ug GFP-SCAP plasmídeo (uma oferta do Dr. Peter Espenshade) 22 em 1 ml reduzidos meio de soro e misture delicadamente. </li><li> Adicionar 8-16 mL de reagente DNA transfecção pipetando diretamente nos 1 ml reduzidos meio de soro contendo plasmídeos e misture delicadamente. </li><li> Incubar o complexo de reagentes / plasmídeo de transfecção durante 25 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar complexo de transfecção para as células com meio fresco e continuar a cultura durante 24 horas a 5% de CO 2 e 37 ° C. </li><li> Lavar uma vez com PBS e tratar as células durante 12 h com ou sem glicose (5 mM) na presença ou na ausência de tunicamicina (1 ug / ml), um inibidor de N -glycosylation. </li></ol></li><li> Prepare pelotas da membrana celular como descrito nos passos 1.2.1, 1.2.2, 1.2.3 e 1.2.7. </li><li> Detecção de -glycosylation N SCAP <ol><li> tripsina proteólise <ol><li> Ressuspender as peletes de membrana a partir de células que sobre-expressam GFP-SCAP em 114 ul de tampão contendo HEPES 10 mM-KOH (pH 7,4), 10 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, EDTA de sódio 1 mM, e NaCl 100 mM. </li><li> incubar 57l alíquotas de proteínas de membrana na ausência ou na presença de 1 ul de tripsina (1 mg / mL), num volume total de 58 uL, durante 30 min a 30 ° C; 81. </li><li> Pare reacções pela adição de 2 ul (400 unidades) de inibidor de tripsina de soja. </li></ol></li><li> A desglicosilação por pï¿½tido N- glicosidase F (PNGase F) <ol><li> Por tratamento subsequente com PNGase F, adicionar 10 ul de uma solução contendo 3,5% (p / v) de SDS e 7% (vol / vol) de 2-mercaptoetanol a cada amostra. </li><li> Após aquecimento a 100 ° C durante 10 min, adiciona-se sequencialmente 7 ul de fosfato de sódio 0,5 M (pH 7,5), 7 mL de 10% (v / v) de Nonidet P-40 com inibidores de 12 × de protease, e 2 ul (0,5 U / ul) de PNGase F. </li><li> Após incubação a 37 ° C durante 3 h, parar as reacções pela adição de tampão de carregamento de 5x (Tris-HCl 312,5 mM, pH 6,8, 10% SDS, 50% de glicerol, 12,5% β-mercaptoetanol e 0,05% de azul de bromofenol). Aquecer as misturas a 100 ° C durante 10 me sujeita a SDS-PAGE. Carga 25-50 ug de proteínas de membrana totais num gel de SDS-PAGE a 10% 39. Submeter o gel a 80 V durante 15 min, em seguida, altere a 130 V por mais 115 min. Transferir a 140 mA para 130 min. </li><li> Para o Western blot, utilize anticorpo anti-SCAP ug / ml 10 (9D5) para detectar N -glycosylation e proteína total SCAP. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Detecção de SCAP Tráfico de RE para o Golgi utilizando GFP-SCAP em células humanas <ol><li> Semente de 2,5 x 10 5 células U87 de um prato de 60 milímetros com DMEM suplementado com FBS a 5% e incuba-se as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas antes da transfecção. </li><li> Dilui-se 4 ug de GFP-SCAP plasmídeo em 0,5 ml de meio de soro reduzido e misturar. </li><li> Adicionar 8 mL de reagente DNA transfecção pipetando diretamente em 0,5 ml de meio de soro reduzido contendo plasmídeos e misture delicadamente. </li><li> Incubar o complexo de reagentes / plasmídeo de transfecção durante 25 min a salatemperatura. </li><li> Adicionar complexo de transfecção para as células com meio fresco e continuar a cultura durante 24 horas a 5% de CO 2 e 37 ° C. </li><li> Repropagação 5 - 10 x 10 4 células para uma placa de 6 poços contendo uma lamela de vidro (22 mm x 22 mm) e continuar a cultura a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas. </li><li> Lavar uma vez com PBS e tratar as células durante 12 h com ou sem glicose (5 mM) na presença ou na ausência de tunicamicina (1 ug / ml). </li><li> Lave as células uma vez com PBS e fixar em 4% de formaldeído, durante 10 min. </li><li> Lave as células três vezes com PBS, inverter as lamelas, montagem em lâminas juntamente com antifade reagente, e selar as lamelas usando unha polonês. </li><li> Verifique o tráfico GFP-SCAP usando uma objectiva de imersão em óleo de 63X em uma varredura a laser microscópio confocal 41. </li></ol>

<ol><li>Ru, P., Williams, T. M., Chakravarti, A., Guo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metabolism+of+malignant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Tumor metabolism of malignant gliomas.</a> Cancers (Basel). 5, 1469-1484 (2013).</li>
<li>Moon, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Scap%2FSREBP+pathway+is+essential+for+developing+diabetic+fatty+liver+and+carbohydrate-induced+hypertriglyceridemia+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">The Scap/SREBP pathway is essential for developing diabetic fatty liver and carbohydrate-induced hypertriglyceridemia in animals.</a> Cell metabolism. 15, 240-246 (2012).</li>
<li>Guo, D., Bell, E. H., Chakravarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+emerges+as+a+promising+target+for+malignant+glioma+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Oncology%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism emerges as a promising target for malignant glioma therapy.</a> CNS Oncology. 2, 289-299 (2013).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AMPK+agonist+AICAR+inhibits+the+growth+of+EGFRvIII-expressing+glioblastomas+by+inhibiting+lipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The AMPK agonist AICAR inhibits the growth of EGFRvIII-expressing glioblastomas by inhibiting lipogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12932-12937 (2009).</li>
<li>Menendez, J. A., Lupu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+synthase+and+the+lipogenic+phenotype+in+cancer+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis.</a> Nat Rev Cancer. 7, 763-777 (2007).</li>
<li>Guo, D., Cloughesy, T. F., Radu, C. G., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK%3A+A+metabolic+checkpoint+that+regulates+the+growth+of+EGFR+activated+glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">AMPK: A metabolic checkpoint that regulates the growth of EGFR activated glioblastomas.</a> Cell Cycle. 9, 211-212 (2010).</li>
<li>Goldstein, J. L., DeBose-Boyd, R. A., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+sensors+for+membrane+sterols%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Protein sensors for membrane sterols.</a> Cell. 124, 35-46 (2006).</li>
<li>Shao, W., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+Roles+for+SREBP+in+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">Expanding Roles for SREBP in Metabolism.</a> Cell metabolism. 16, 414-419 (2012).</li>
<li>Nohturfft, A., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+lipid+metabolism+in+membrane+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Coordination of lipid metabolism in membrane biogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 25, 539-566 (2009).</li>
<li>Jeon, T. I., Osborne, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SREBPs%3A+metabolic+integrators+in+physiology+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+endocrinology+and+metabolism%3A+TEM%22%5BJournal%5D)">SREBPs: metabolic integrators in physiology and metabolism.</a> Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 23, 65-72 (2012).</li>
<li>Sato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+the+membrane+attachment%2C+DNA+binding%2C+and+transcriptional+activation+domains+of+sterol+regulatory+element-binding+protein-1+%28SREBP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Assignment of the membrane attachment, DNA binding, and transcriptional activation domains of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1).</a> The Journal of biological chemistry. 269, 17267-17273 (1994).</li>
<li>Sakai, J., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins+%28SREBPs%29+at+site-1+requires+interaction+with+SREBP+cleavage-activating+protein.+Evidence+from+in+vivo+competition+studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Cleavage of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) at site-1 requires interaction with SREBP cleavage-activating protein. Evidence from in vivo competition studies.</a> The Journal of biological chemistry. 273, 5785-5793 (1998).</li>
<li>Sakai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+complexes+between+the+COOH-terminal+domains+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins+%28SREBPs%29+and+SREBP+cleavage-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of complexes between the COOH-terminal domains of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) and SREBP cleavage-activating protein.</a> The Journal of biological chemistry. 272, 20213-20221 (1997).</li>
<li>Hua, X., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterol+resistance+in+CHO+cells+traced+to+point+mutation+in+SREBP+cleavage-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sterol resistance in CHO cells traced to point mutation in SREBP cleavage-activating protein.</a> Cell. 87, 415-426 (1996).</li>
<li>Nohturfft, A., Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+of+SREBP+cleavage-activating+protein%2C+a+polytopic+membrane+protein+with+a+sterol-sensing+domain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Topology of SREBP cleavage-activating protein, a polytopic membrane protein with a sterol-sensing domain.</a> The Journal of biological chemistry. 273, 17243-17250 (1998).</li>
<li>Nohturfft, A., Hua, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+G-to-A+substitution+in+a+single+codon+of+SREBP+cleavage-activating+protein+causes+sterol+resistance+in+three+mutant+Chinese+hamster+ovary+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Recurrent G-to-A substitution in a single codon of SREBP cleavage-activating protein causes sterol resistance in three mutant Chinese hamster ovary cell lines.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13709-13714 (1996).</li>
<li>Espenshade, P. J., Hughes, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+sterol+synthesis+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of sterol synthesis in eukaryotes.</a> Annu Rev Genet. 41, 401-427 (2007).</li>
<li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+step+in+cholesterol+homeostasis%3A+sterols+promote+binding+of+SCAP+to+INSIG-1%2C+a+membrane+protein+that+facilitates+retention+of+SREBPs+in+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crucial step in cholesterol homeostasis: sterols promote binding of SCAP to INSIG-1, a membrane protein that facilitates retention of SREBPs in ER.</a> Cell. 110, 489-500 (2002).</li>
<li>Yabe, D., Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insig-2%2C+a+second+endoplasmic+reticulum+protein+that+binds+SCAP+and+blocks+export+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Insig-2, a second endoplasmic reticulum protein that binds SCAP and blocks export of sterol regulatory element-binding proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12753-12758 (2002).</li>
<li>Yabe, D., Xia, Z. P., Adams, C. M., Rawson, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+mutations+in+sterol-sensing+domain+of+SCAP+block+interaction+with+insig+and+render+SREBP+cleavage+insensitive+to+sterols%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Three mutations in sterol-sensing domain of SCAP block interaction with insig and render SREBP cleavage insensitive to sterols.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 16672-16677 (2002).</li>
<li>Espenshade, P. J., Li, W. P., Yabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterols+block+binding+of+COPII+proteins+to+SCAP%2C+thereby+controlling+SCAP+sorting+in+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sterols block binding of COPII proteins to SCAP, thereby controlling SCAP sorting in ER.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11694-11699 (2002).</li>
<li>Nohturfft, A., Yabe, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+step+in+cholesterol+feedback+localized+to+budding+of+SCAP+from+ER+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulated step in cholesterol feedback localized to budding of SCAP from ER membranes.</a> Cell. 102, 315-323 (2000).</li>
<li>Sakai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterol-regulated+release+of+SREBP-2+from+cell+membranes+requires+two+sequential+cleavages%2C+one+within+a+transmembrane+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sterol-regulated release of SREBP-2 from cell membranes requires two sequential cleavages, one within a transmembrane segment.</a> Cell. 85, 1037-1046 (1996).</li>
<li>Wang, X., Sato, R., Brown, M. S., Hua, X., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SREBP-1%2C+a+membrane-bound+transcription+factor+released+by+sterol-regulated+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SREBP-1, a membrane-bound transcription factor released by sterol-regulated proteolysis.</a> Cell. 77, 53-62 (1994).</li>
<li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteolytic+pathway+that+controls+the+cholesterol+content+of+membranes%2C+cells%2C+and+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of membranes, cells, and blood.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11041-11048 (1999).</li>
<li>Rawson, R. B., DeBose-Boyd, R., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+to+cleave+sterol+regulatory+element-binding+proteins+%28SREBPs%29+causes+cholesterol+auxotrophy+in+Chinese+hamster+ovary+cells+with+genetic+absence+of+SREBP+cleavage-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Failure to cleave sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) causes cholesterol auxotrophy in Chinese hamster ovary cells with genetic absence of SREBP cleavage-activating protein.</a> J Biol Chem. 274, 28549-28556 (1999).</li>
<li>Zelenski, N. G., Rawson, R. B., Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+topology+of+S2P%2C+a+protein+required+for+intramembranous+cleavage+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane topology of S2P, a protein required for intramembranous cleavage of sterol regulatory element-binding proteins.</a> J Biol Chem. 274, 21973-21980 (1999).</li>
<li>Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Century+of+Cholesterol+and+Coronaries%3A+From+Plaques+to+Genes+to+Statins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Century of Cholesterol and Coronaries: From Plaques to Genes to Statins.</a> Cell. 161, 161-172 (2015).</li>
<li>Espenshade, P. J., Cheng, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocatalytic+processing+of+site-1+protease+removes+propeptide+and+permits+cleavage+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Autocatalytic processing of site-1 protease removes propeptide and permits cleavage of sterol regulatory element-binding proteins.</a> The Journal of biological chemistry. 274, 22795-22804 (1999).</li>
<li>Guo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCAP+links+glucose+to+lipid+metabolism+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Oncol%22%5BJournal%5D)">SCAP links glucose to lipid metabolism in cancer cells.</a> Mol Cell Oncol. 3, (2016).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-Mediated+N-glycosylation+of+SCAP+Is+Essential+for+SREBP-1+Activation+and+Tumor+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Glucose-Mediated N-glycosylation of SCAP Is Essential for SREBP-1 Activation and Tumor Growth.</a> Cancer Cell. 28, 569-581 (2015).</li>
<li>Shao, W., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+Makes+Fat+by+Talking+to+SCAP%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Sugar Makes Fat by Talking to SCAP.</a> Cancer Cell. 28, 548-549 (2015).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+signaling+through+an+Akt-SREBP-1-dependent%2C+rapamycin-resistant+pathway+sensitizes+glioblastomas+to+antilipogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">EGFR signaling through an Akt-SREBP-1-dependent, rapamycin-resistant pathway sensitizes glioblastomas to antilipogenic therapy.</a> Sci Signal. 2, 82(2009).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+LXR+agonist+promotes+GBM+cell+death+through+inhibition+of+an+EGFR%2FAKT%2FSREBP-1%2FLDLR-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">An LXR agonist promotes GBM cell death through inhibition of an EGFR/AKT/SREBP-1/LDLR-dependent pathway.</a> Cancer Discov. 1, 442-456 (2011).</li>
<li>Guo, D., Bell, E. H., Mischel, P., Chakravarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+SREBP-1-driven+lipid+metabolism+to+treat+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Targeting SREBP-1-driven lipid metabolism to treat cancer.</a> Curr Pharm Des. 20, 2619-2626 (2014).</li>
<li>Bell, E. H., Guo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+for+malignant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Malignant+Gliomas%2C+Radiation+Medicine+Rounds%22%5BJournal%5D)">Biomarkers for malignant gliomas.</a> Malignant Gliomas, Radiation Medicine Rounds. 3, 339-357 (2012).</li>
<li>Geng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+SOAT1+suppresses+glioblastoma+growth+via+blocking+SREBP-1-mediated+lipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of SOAT1 suppresses glioblastoma growth via blocking SREBP-1-mediated lipogenesis.</a> Clin Cancer Res. , (2016).</li>
<li>Ru, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+Loop+Regulation+of+SCAP%2FSREBP-1+by+miR-29+Modulates+EGFR+Signaling-Driven+Glioblastoma+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Feedback Loop Regulation of SCAP/SREBP-1 by miR-29 Modulates EGFR Signaling-Driven Glioblastoma Growth.</a> Cell Rep. , (2016).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition)</a>. , (2012).</li>
<li>Uehara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-nitrosylated+protein-disulphide+isomerase+links+protein+misfolding+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">S-nitrosylated protein-disulphide isomerase links protein misfolding to neurodegeneration.</a> Nature. 441, 513-517 (2006).</li>
<li>Miyashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy+for+intracellular+co-localization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy for intracellular co-localization of proteins.</a> Methods Mol Biol. 1278, 515-526 (2015).</li>
<li>Cao, J., Guo, S., Arai, K., Lo, E. H., Ning, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+extracellular+signaling+utilizing+a+glycoproteomic+approach%3A+lectin+blot+surveys%2C+a+first+and+important+step%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying extracellular signaling utilizing a glycoproteomic approach: lectin blot surveys, a first and important step.</a> Methods Mol Biol. 1013, 227-233 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Neste estudo, descrevemos um protocolo para o isolamento de fracções de membrana de células de origem humana e para a preparação das amostras para a detecção de -glycosylation SCAP N e proteína total, utilizando Western blot. Nós fornecemos também um método para monitorar o tráfico SCAP usando GFP-rotulagem e microscopia confocal. O método é utilizado especificamente para analisar proteína de membrana e é uma ferramenta importante para investigar SCAP N -glycosylation e tráfico. <p class="jove_cont...

A desregulamentação do metabolismo lipídico é uma característica comum de câncer e doenças metabólicas 1-6. Nestes processos, esterol de proteínas reguladoras de ligação ao elemento (SREBPs), uma família de factores de transcrição, desempenham um papel crítico no controle da expressão de genes importantes para a absorção e síntese de colesterol, ácidos gordos, fosfolípidos e 7-10. SREBPs, incluindo SREBP-1a, SREBP-1c, e de SREBP-2, são sintetizadas como precursores inactivos que se ligam à membrana do retículo endoplasmático (ER), em virtude de dois domínios transmembranares 7. O N-terminal da SREBPs contém um domínio de ligação de ADN para a transactivação de genes alvo 11. O C-terminal dos precursores SREBP liga-se ao de SREBP proteína de activação de clivagem (SCAP) 12,13, uma proteína de membrana politópica que desempenha um papel fundamental na regulação da estabilidade e SREBP activação 14-16. a implemenção da função da transcrição requer a translocação do complexo SCAP / SREBP do RE para o Golgi, onde duas proteases clivam sequencialmente SREBP e libertar o seu fragmento N-terminal, o qual então entra para dentro do núcleo para a transactivação de genes lipogênicas 7. Nestes processos, os níveis de esteróis na membrana do RE controlar a saída do complexo SCAP / SREBP do ER 7,17. Sob condições de elevada esterol, esterol SCAP se liga a ou ER-residente induzida por insulina do gene da proteína-1 (Insig-1) ou -2 (Insig-2), aumentando a associação de SCAP com Insigs que retêm o complexo SCAP / SREBP na ER 18-20. Quando os níveis de esteróis diminuir, SCAP dissocia com Insigs. Isto leva a uma alteração conformacional SCAP, que permite a interacção com proteínas de revestimento SCAP comuns complexo (COP) II. O complexo medeia a incorporação do complexo SCAP / SREBP para as vesículas do brotamento e dirige o seu transporte do RE para o Golgi 21,22. Após a translocção para o Golgi, SREBPs são sequencialmente clivada por Site-1 e Site-2 proteases, levando à libertação de N-terminal 7,23-29. Proteína SCAP carrega três N -ligada oligossacarídeos na asparagina (N) posiciona N263, N590 e N641 15. Recentemente, revelou que mediada por glicose N -glycosylation de SCAP nestes locais é uma condição prévia para o tráfico SCAP / SREBP do RE para o Golgi sob baixas condições de esterol 30-32. Perda de glicosilação através de mutação de SCAP todos os três asparagina a glutamina (NNN para qqq) desactiva o tráfico do complexo SCAP / SREBP e resulta na instabilidade de proteínas SCAP e redução da activação SREBP 31. Nossos dados recentes também demonstram que SREBP-1 é altamente ativada no glioblastoma e regulamentada pela SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. Segmentação / sinalização SCAP SREBP-1 está a emergir como uma nova estratégia para o tratamento de doenças malignas e s metabólicosyndromes 1,3,35-38. Portanto, é importante desenvolver um método eficaz para analisar os níveis de proteína SCAP e N -glycosylation e monitorar o seu tráfico de células humanas e tecidos de pacientes. A região da proteína luminal SCAP (aminoácidos 540-707) no ER contém dois locais -glycosylation N (N590 e N641) que estão protegidos contra a proteólise quando as membranas intactas são tratadas com tripsina 15. Este fragmento luminal tem um peso molecular de ~ 30 kDa, que é suficientemente pequeno para permitir a resolução de variantes glicosiladas de SCAP individuais por electroforese em gel de sulfato de poliacrilamida dodecil de sódio (SDS-PAGE) 15,31. Aqui, nós fornecemos um método para detectar N -glycosylation do SCAP e a proteína total em células humanas. Este protocolo é derivado a partir do método descrito nas publicações de laboratório Brown e Goldstein 15 e nossa publicação recente 31. O protocolo pode ser utilizado em tele estudo de proteínas a partir de células de mamífero SCAP.

<table><tbody><tr><td>X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEMI medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>tripsina&nbsp;</td><td>Inibidor</td> de tripsina de soja Sigma <td>T6567</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>T9777</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F&nbsp;</td><td>Anticorpo Sigma</td><td>P7367</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SCAP (9D5)&nbsp; &nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-13553</td><td></td></tr><tr><td>GFP anticorpo&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo SREBP-1 (IgG-2A4)</td><td>BD Pharmingen</td><td>557036</td><td></td></tr><tr><td>PDI Anticorpo (H-17)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-30932</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Lamin A (H-102)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20680</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo SCAP (a.a 450-500)</td><td>Bethyl Laboratories, Inc.</td><td>A303-554A</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia modificada' s meio (DMEM) sem glicose, piruvato e glutamina&nbsp; &nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>17-207-CV</td><td>Adicione 1 mM de Pyravate e 4 mM de Glutamina antes de usar</td></tr><tr><td>22 G x 1 1/2 agulha</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>pepstatina A</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>leupeptina</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>TDT</td><td>Sigma</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>ALLN</td><td>Sigma</td><td>A6185</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulose</td><td>GE</td><td>RPN3032D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Solution 0,5 M pH 8,5 100 ml</td><td>VWR</td><td>82023-102</td><td></td></tr><tr><td>EGTA 0,5 M estéril (pH 8,0) 50 ml</td><td>Fisher Scentific</td><td>50255956</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS</td><td>Thermo scientific</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>azul de bromofenol</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>prolonga o ouro anti-reagente anti-desvanecimento com dapi</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>pirovato de sódio</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr></tbody></table>

análise do scap<em&gt; n</em&gt; -glycosylation e tráfico de células humanas

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

A lipogênese elevada é uma característica comum do câncer e das doenças metabólicas. As proteínas de ligação ao elemento regulador de esteróis (SREBPs), uma família de fatores de transcrição ligados à membrana que controlam a expressão de genes importantes para a síntese de colesterol, ácidos graxos e fosfolipídios, são frequentemente reguladas positivamente nessas doenças. No processo de translocação nuclear de SREBP, a proteína ativadora de clivagem SREBP (SCAP) desempenha um papel central no tráfego de SREBP do retículo endoplasmático (ER) para o Golgi e na subsequente ativação da proteólise. Recentemente, descobrimos que a N-glicosilação mediada por glicose de SCAP é uma condição de pré-requisito para a saída de SCAP / SREBP do ER e movimento para o Golgi. A N-glicosilação estabiliza o SCAP e direciona o tráfego de SCAP/SREBP. Aqui, descrevemos um protocolo para o isolamento de frações de membrana em células humanas e para a preparação das amostras para a detecção de N-glicosilação SCAP e proteína total usando western blot. Além disso, fornecemos um método para monitorar o tráfego SCAP usando microscopia confocal. Este protocolo é apropriado para a investigação da N-glicosilação de SCAP e do tráfego em células de mamíferos.

A Figura 1 mostra a detecção da proteína endógena e SCAP forma nuclear de SREBP-1 em células U87 de glioblastoma humanas em resposta à glicose estimulação utilizando Western blot. O SCAP proteína da membrana é detectada no &quot;fracção de membrana&quot;. A forma do núcleo (N-terminal) de SREBP-1 é detectada no &quot;Extractos nucleares&quot;. O nível de proteína de SCAP (PDI serve como um controlo interno de proteínas de membrana ER) e forma nuclear de SREBP-1 são...

Descreve-se um método modificado para o isolamento de fracção de membrana a partir de células humanas e de preparação da amostra para a detecção de -glycosylation SCAP N e proteína total, utilizando Western blot. Nós introduzimos ainda um método de rotulagem GFP para monitorar o tráfico SCAP usando microscopia confocal. Este protocolo pode ser utilizado em laboratórios de biologia regulares.

Análise do SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation E Tráfico de Células Humanas

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

O objetivo geral deste protocolo é fornecer uma abordagem simples para analisar a N-glicosilação de SCAP e seu tráfego em células humanas. Este método é utilizado para analisar a N-glicosilação de SCAP, que é indispensável para o tráfego de SCAP e para a ativação do metabolismo lipídico mediado por SREBP em células de mamíferos. Em comparação com o método convencional que utiliza lectinas, nosso método oferece um procedimento simples para identificar a N-glicosilação de SCAP, detectando sua mudança de mobilidade após a remoção da N-glicana com PNGase.Embora este método possa fornecer uma perspectiva sobre o câncer, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como doenças cardiovasculares e síndromes metabólicas. Para iniciar este procedimento, semeie um vezes 10 à sexta potência de células U87 em uma placa de 10 centímetros com DMEM suplementado com 5% de FBS, e incube as células a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 24 horas antes do tratamento. Em seguida, lave as células uma vez com PBS.Em seguida, substitua o PBS por meio DMEM fresco com ou sem glicose por 12 horas. Para preparar frações de membrana celular e extratos nucleares, lave as células uma vez com PBS. Em seguida, des

analysis-of-scap-n-glycosylation-and-trafficking-in-human-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós descrevemos um método para análise da alteração da N-glicanos ligados através do início da vida de glicoproteínas após a sua biossíntese em células de mamíferos. Isto é conseguido através de pulso-chase análise de glicanos metabolicamente marcados, a liberação enzimática das glicoproteínas e análise por HPLC.

Pulso-chase Análise de Cadeias N-linked Açúcar de Glicoproteínas em células de mamíferos

Um método específico e sensível para obter informações sobre o perfil de expressão de antígenos glicoesfingolipídeos em órgãos e células do sistema imunológico é descrito. O método tira partido da espectrometria de massa de iões armadilha permitindo passo a passo de fragmentação de moléculas de glicoesfingolipídeos para análise estrutural em comparação com padrões de síntese química.

Análise por espectrometria de massa de Antígenos glicoesfingolipídeos

Descreve-se um protocolo de coloração de anticorpo padrão para utilização em microscopia para determinar a expressão e localização da membrana de gangliósidos em repouso e as células naive humanas activadas T CD4 +. Também estão descritos em tempo real utilizando experiências de PCR &lt;40.000 células que não requerem kits adicionais baixos de ARN de entrada.

Preparação de CD4<sup&gt; +</sup&gt; As células T para Análise de GD3 e GD2 gangliï¿½idos Membrane Expressão por microscopia

Apresentamos abordagens para a caracterização estrutural e biofísica das glicoproteínas com a dobra de imunoglobulina por cristalografia de raios x, Calorimetria de Titulação Isotérmica e interferometria de biolayer.

Caracterização de Glicoproteínas com Dobra da Imunoglobulina por Cristalografia de Raios-X e Técnicas Biofísicas

Aqui apresentamos um protocolo que combina um sistema de cocultura neural-endotelial in vitro e incorporação metabólica de sialoglicano com grupos funcionais bioortogonais para expandir as células primárias de tronco neural e progenitoras e rotular sua superfície sialoglycoproteínas para a análise da imagem latente ou da massa-espectrometria de marcadores da superfície da pilha.

Identificando marcadores de superfície celular da haste neural primária e células progenitoras por rotulagem metabólica de Sialoglycan

Transporte retrógrado de proteínas de superfície celular para o Golgi é essencial para manter a homeostase de membrana. Aqui, descrevemos um método para analisar bioquimicamente transporte de superfície-para-Golgi celular de proteínas recombinantes usando funcionalizados nanobodies em células HeLa.

Análise de absorção endocítica e transporte retrógrado à rede Trans-Golgi usando funcionalizados Nanobodies em culturas de células

Modificações pós-translacionais (PTMs) alteram estruturas e funções proteicas. Métodos para o enriquecimento simultâneo de vários tipos de PTM podem maximizar a cobertura nas análises. Apresentamos um protocolo utilizando cromatografia de afinidade metálica ti(IV) automobilizada duplamente, seguida de espectrometria de massa para o enriquecimento simultâneo e análise da proteína N-glicosilação e fosforilação em tecidos pancreáticos.

Uma estratégia de enriquecimento de ponta de spin para análise simultânea de N-glicopeptídeos e Fosfopeptídeos de Tecidos Pancreáticos Humanos

Este protocolo descreve vários métodos que podem ajudar no estudo da biologia da ATG9A, incluindo imunofluorescência seguida de análise de imagem, considerações de superexpressão transitória e investigação do estado de glicosilação da ATG9A usando western blot.

Imagem ATG9A, uma proteína de membrana multi-spanning

Este protocolo detalha o método glicoproteômico guiado por glicômica, uma tecnologia ômica integrada que oferece informações abrangentes sobre o glicoproteoma heterogêneo em microambientes tumorais complexos necessários para entender melhor a glicobiologia dos cânceres.

A glicoproteômica guiada por glicômicos facilita o perfil abrangente do glicoproteoma em microambientes tumorais complexos 

Aqui, propomos um protocolo simples que combina engenharia de oligossacarídeos metabólicos, química de clique e microscopia de expansão que permite a bioimagem de N-glicoproteínas sialiladas intracelulares com resolução aprimorada usando equipamentos de microscopia de rotina.

Visualização da Sialilação Intracelular com Química Click e Microscopia de Expansão

Aprenda a analisar a N-glicosilação do SCAP e seu tráfego em células humanas usando western blot e microscopia confocal. Este método simplificado facilita o estudo do metabolismo lipídico e doenças metabólicas.

Análise do SCAP

Explorar mais vídeos