detecção de Trypanosoma brucei Switching Variant glicoproteína de superfície por Magnetic celular ativado Seleção e citometria de fluxo

O objetivo geral deste método é isolar tripanossomas que expressam uma variante específica de glicoproteína de superfície ou VSG do resto da população e identificar parasitas que mudaram do VSG dominante inicial para qualquer outro VSG. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia do tripanossomo, como quais são os fatores ou eventos que influenciam a troca de VSG em uma população de parasitas. A principal vantagem dessa técnica é que ela é mais rápida do que os métodos publicados anteriormente e permite uma fácil quantificação de células switch para não switch.

Quando o laboratório começou a trabalhar na variação antigênica, o primeiro problema era como detectar switchers raros. Esse tipo de problema foi resolvido em imunologia há alguns anos, por meio do uso de classificação de células ativadas por magnetismo para enriquecer células negativas para uma característica específica. Portar o processo de não seleção para a variação antigênica parecia uma ideia realmente promissora.

Para começar, os tripanossomas da corrente sanguínea da cepa Lister 427 devem ser cultivados até uma densidade de 0,5 a 100.000 por mililitro. Alíquota de 50 vezes 10 para a amostra de seis células em um tubo de 15 mililitros e depois centrifugue. Guarde uma vez 10 para as seis células e cultura para serem usadas posteriormente como controles de anticorpos positivos e negativos.

Pipete a maior parte do sobrenadante, deixando cerca de 750 microlitros no tubo. Transfira as células para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Finalmente, centrifugue as células a quatro graus Celsius por quatro minutos a 2800 vezes g.

E então pipetar todo o sobrenadante. Ressuspenda as células em 150 microlitros de meio de cultura, mais anticorpo anti-glicoproteína de superfície antivariante primário ou anti VSG na diluição apropriada. Em seguida, vórtice as células a quatro graus Celsius por 10 minutos.

Lave com 800 a 1000 microlitros de meio de cultura a frio. Centrifugue as células a quatro graus Celsius por quatro minutos a 5200 vezes g. Depois de aspirar o sobrenadante, lavar as células com um mililitro de meio de cultura e centrifugar novamente.

Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 100 microlitros de meio de cultura. Adicione 110 microlitros de microesferas de classificação de células ativadas magneticamente do tipo apropriado para o anticorpo primário. Misture bem pipetando para cima e para baixo e depois vórtice.

Enquanto as células estão em vórtice, configure uma coluna de separação ativada por magnetismo. Coloque um tubo de 15 mililitros embaixo dele para coletar o meio de escorva. Adicione dois mililitros de meio de cultura para preparar a coluna.

Em seguida, remova a amostra do vórtice e adicione 800 a 1000 microlitros de meio de cultura a frio. Centrifugue a amostra e, em seguida, remova o sobrenadante para remover o anticorpo não ligado. Lavar as células peletizadas com um mililitro de meio de cultura e centrifugar novamente.

Desta vez, aspirar o sobrenadante, mas deixar 100 microlitros no tubo. Agite vigorosamente o tubo da centrífuga até que o pellet esteja totalmente ressuspenso. Adicione um mililitro de meio de cultura e pipete para cima e para baixo para ressuspender totalmente as células.

Remova o tubo cônico de 15 milímetros usado para coletar o meio de escorva e substitua-o por um novo cônico de 15 mililitros para coletar o fluxo contendo os parasitas trocados. Aplique a suspensão da célula na coluna preparada. Colete o fluxo em um tubo de 15 mililitros abaixo, que normalmente leva de seis a sete minutos para um mililitro de meio mais tripanossomos.

Em seguida, lavar a coluna duas vezes com um mililitro de meio de cultura e recolher o fluxo no mesmo tubo. Divida o fluxo, que deve totalizar cerca de três mililitros, em dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, coloque os tubos no gelo.

Adicione três mililitros de meio de cultura à coluna e mergulhe a coluna em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Isso obterá as células que expressam o VSG dominante inicial. Retire 300 microlitros deste material eluído e mantenha-o no gelo, o resto pode ser descartado.

Para criar um controle positivo, pegue aproximadamente 100.000 células da cultura inicial de células e pipete-as para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Repita isso para criar um controle negativo. Centrifugue as amostras de fluxo contínuo e a amostra de controle positivo.

E então remova e descarte o sobrenadante. Ressuspender as células de controlo positivo em 100 microlitros de meio de cultura com anticorpo anti VSG marcado com fluoróforo primário na diluição adequada. Em seguida, ressuspenda um pellet de fluxo contínuo em 100 microlitros de meio de cultura com anticorpo anti VSG marcado com fluoróforo primário na diluição apropriada.

Use a suspensão para ressuspender o pellet no segundo tubo de fluxo, resultando em um tubo de piscina. Misture bem pipetando para cima e para baixo. Vortex as células e, em seguida, adicione 800 a 1000 microlitros de meio de cultura a frio.

Centrifugar as amostras a quatro graus Celsius durante quatro minutos a 5200 vezes g e, em seguida, rejeitar o sobrenadante para remover qualquer anticorpo não ligado. Lave as células com um mililitro de meio de cultura e, em seguida, centrifugue as células. Os controles positivo e negativo e as células eluídas previamente armazenadas no gelo.

Descarte o sobrenadante. Em seguida, adicionar 148,5 microlitros de meio de cultura às amostras. Em seguida, adicione 25 microlitros de contas de contagem absoluta, seguidas por 1,5 microlitros de solução de coloração de iodeto de propídio.

Ressuspenda os pellets de controle positivo e negativo com 175 microlitros de meio de cultura. As amostras agora podem ser executadas no citômetro de fluxo. Esses gráficos de citometria de fluxo mostram resultados da separação celular de populações de tripanossomas induzidos para criar uma quebra de DNA de fita dupla versus células não induzidas.

Os painéis da esquerda mostram a dispersão frontal versus lateral, o que permite a elucidação das células vivas versus mortas e contas adicionadas à amostra. Podem ser geradas portas que as determinam com base nas características de dispersão. Os painéis da direita mostram apenas as células que podem ser classificadas como ativas com base nas portas de dispersão geradas nos painéis da esquerda.

O VSG inicial dominante neste caso foi o VSG dois. As células que se coram positivamente para iodeto de propídio são células mortas. E estes são vistos nas regiões Q um e Q dois da trama.

As células que se coram positivamente para o VSG dominante e negativamente para PI caem na região Q três e são contaminantes. Finalmente, as células em Q quatro são células vivas que se coram negativamente para o VSG dominante, que são consideradas switchers. Este gráfico mostra as frequências de comutação observadas calculadas das populações de tripanossomas com versus sem quebras induzidas.

O nível de comutação estocástica in vitro é bastante baixo. Embora a indução de uma quebra resulte em significativamente mais células, a mudança para o VSG não dominante. Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em cerca de três horas.

Ao tentar este procedimento, é importante manter as amostras frias e ressuspender adequadamente os pellets, especialmente antes do isolamento na coluna. Seguindo este procedimento, outros métodos, como o sequenciamento de RNA, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como quais VSGs estão sendo expressos em uma população de switches. Esse método é normalmente usado para medir a comutação de VSG, também pode ser usado para o isolamento e quantificação de parasitas que expressam qualquer proteína de superfície de interesse.