Name: detecção de Trypanosoma brucei Switching Variant glicoproteína de superfície por Magnetic celular ativado Seleção e citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprenda a isolar Trypanosoma brucei expressando glicoproteínas de superfície variantes específicas usando seleção magnética ativada por células. Este método permite detectar raros parasitas que sofreram switching de VSG de forma rápida e quantitativa.

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Nós gostaríamos de agradecer George Cross para o conselho geral sobre a biologia do tripanossoma. Este trabalho também foi apoiado por uma Fundação Bill e Melinda Gates concessão GCE para DS, a NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1325261) para MRM e um NIH / NIAID (concessão # AI085973) para FNP. Agradecemos Galadriel Hovel-Miner para o uso da estirpe contendo o local de gene e reconhecimento I-SCEI.

NOTA: Durante o procedimento, é necessário manter as células no gelo. media frias também devem ser utilizados por toda parte. Colheita 1. Amostra <ol><li> Crescer Lister 427 tripanossomas tensão da corrente sanguínea até uma densidade de 0,5 - 1 milhão / ml. É melhor iniciar culturas com um pequeno número de parasitas. Girar 50 X 10 6 células / amostra durante 10 min a 1500 x g. Certifique-se de deixar 1 x 10 6 células em cultura para mais tarde usar controles de anticorpos como positivos e negativos. NOTA: Este protocolo também pode ser usado em tripanossomas isolados de sangue animal (ver discussão para mais detalhes). </li><li> Pipeta ou deitar fora a maior parte do sobrenadante (deixar cerca de 750 mL). Transferir as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Girar as células a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg numa microcentrífuga e remover o sobrenadante. </li></ol> 2. Etiquetagem Magnética <ol><li> Ressuspender as células em 150 ul de meio de cultura (HMI-9 with soro, por exemplo) + anticorpo anti-VSG primário na diluição apropriada. NOTA: O anticorpo anti-VSG é feita em casa e usado numa diluição de 1:50. É importante a utilização de um anticorpo anti-VSG primário que não é marcado com um fluoróforo. </li><li> Vortex células utilizando um vórtice adaptador-60 a uma velocidade de 6 - 8 numa sala fria a 4 ° C durante 10 min. Lavar com 800 - 1.000 l fria HMI-9 com soro. </li><li> Centrifugação a 4 ° C durante 4 min a 5200 xg e o sobrenadante aspirado. Lava-se com 1 ml de HMI-9 com soro e rodar como acima. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 100 ul de HMI-9 com soro. </li><li> Adicionar 110 ul de células magnético ativado triagem microesferas (MSC). Use anti-rato, anti-coelho, ou grânulos anti-biotina, conforme apropriado para o anticorpo anti-VSG primária. Misture bem. células de vórtice em uma sala fria a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Enquanto as células são vortex, configure uma separação coluna / amostra magnética ativado em um ímã separação. Certifique-se de ter um receptacle (usamos um tubo de centrífuga de 15 ml) na coluna para recolher o fluxo de passagem. Configurar o aparelho em uma sala fria. </li><li> Adicionar 2 ml de HMI-9 com soro à coluna prime. Após o condicionamento lugar um tubo de centrífuga de 15 ml, sob a coluna para recolha de escoamento a partir de cada amostra. </li><li> Após os 10 minutos de incubação na etapa 2.4, adicione 800-1.000 ul frio HMI-9 com soro. Centrifugação a 4 ° C durante 4 min a 5200 x g e remover o sobrenadante para remover o anticorpo não ligado. Lava-se com 1 ml de HMI-9 com soro e repetir deixando 100 l de sobrenadante. </li><li> Flick o tubo de centrífuga vigorosa e inspeccionar visualmente o tubo a certeza de que o pelete é ressuspenso completamente. Adicionar 1 ml de HMI-9 com soro e pipeta-se para baixo e para certificar-se que as células ressuspensas são bem. </li></ol> 3. Separação Magnética <ol><li> Certifique-se de que as colunas são preparados como descrito acima. Aplicar células de coluna. Recolha de fluxo com células que expressam o VS não-dominanteG. 1 ml de meio + tripanossomas tipicamente leva 6-7 min a fluir através da coluna. </li><li> Lavar 2x com 1 ml de HMI-9 com soro e recolher o fluxo através do mesmo tubo como no passo 3.1. </li><li> Divide escoamento (3 mL) em dois tubos de microcentrifugação de 1,5 ml. NOTA: Estes podem ser combinados mais tarde ou meia pode ser usado para isolar o ARN, etc. </li><li> Remover coluna de ímã. Adicionar 3 ml de HMI-9 com soro à coluna e mergulhar coluna para um tubo de centrífuga de 15 ml para se obter células que expressam a partida, VSG dominante. Retirar 300 ul de material fluido para análise posterior. Manter essas células em gelo. </li><li> Para utilização como um positivo e um controlo negativo, demora aproximadamente 1 milhão de células a partir da cultura inicial de células de controlo em crescimento a 37 ° C (aqueles não esperado para mudar frequentemente) e pipeta-os para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. NOTA: células de controlo positivo serão coradas com anticorpo marcado com fluoróforo na etapa 4.1. As células de controlo negativo Remana imaculada em todo o resto do protocolo. </li><li> amostras de spin fluxo e amostra de controlo de anticorpos positivo a 4 ° C durante 4 min a 5200 xg e remover o sobrenadante. NOTA: Outra alíquota de 300 ul de células eluídas pode ser utilizado como um controlo positivo para a coloração anti-VSG. </li></ol> 4. A coloração para a identificação de contaminantes e comutadores <ol><li> amostras de fluxo através Ressuspender as células de controlo positivo e em 100 ul de HMI-9 com soro + primário, anti-VSG anticorpo, marcado com fluoróforo na diluição apropriada. NOTA: O anticorpo anti-VSG marcado é feito em casa e usado numa diluição de 1: 1000. A marcado com fluoróforo, anti-VSG pode ser a partir da mesma fonte que o anticorpo não marcado na separação MACS step.There deve ser de 3 ml de amostra por escoamento em dois tubos de microcentrifugação seguintes passo 3.5. </li><li> Para analisar a totalidade do fluxo através de citometria de fluxo, combinar as pelotas em dois tubos de microcentrifugação durante a re-SUSenquanto se aguardam as amostras em 100 l de HMI-9 com anticorpos séricos + anti-VSG. Misture bem. </li><li> células de vórtice em uma sala fria a 4 ° C durante 10 min. Adicionar 800 - 1.000 l fria HMI-9 com soro. amostras de rotação a 4 ° C durante 4 min a 5200 x g e remover o sobrenadante para remover o anticorpo não ligado. </li><li> Lave as células com 1 ml de HMI-9 com soro. amostras de rotação a 4 ° C durante 4 min a 5200 xg e remover o sobrenadante. Durante esta última rotação, girar os-amostras eluídas a partir do passo 3.4 e a amostra de controlo negativo. </li><li> Ressuspender todos escoamento e amostras eluídas em: 148,5 ul HMI-9 com soro, 25 uL grânulos de contagem absoluta e 1,5 ul de solução de iodeto de propídio (175 ul total) coloração. Ressuspender amostras de controlo de anticorpos positivos e negativos em 175 ul HMI-9 com soro. Certifique-se de anotar o número de contas de contagem absolutos / 25 ul para o lote específico utilizado. </li><li> Executar todas as amostras através de um citômetro de fluxo e recolher dados. células mortas da mancha o PI <sup&gt; +. Contaminantes manchar como PI - VSG +. Switchers manchar como PI - VSG - 8. </li><li> Calcular as frequências utilizando citometria de fluxo de dados de comutação. NOTA: Para obter instruções sobre como calcular as frequências de comutação, consulte o arquivo suplementar <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">Citometria de Fluxo Calculations.docx</a> e Tabela 1. </li></ol>

<ol><li>Horn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+in+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation in African trypanosomes.</a> Molecular & Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).</li>
<li>Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigen+switching+rates+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).</li>
<li>Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+exchange+can+be+an+important+mechanism+of+variant+surface+glycoprotein+gene+switching+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).</li>
<li>Turner, C. M., Barry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei+rhodesiense+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections.</a> Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).</li>
<li>Miller, E. N., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigenic+types+appearing+in+first+relapse+populations+of+clones+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).</li>
<li>Horn, D., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Trypanosoma+brucei+vsg+expression+site+switching+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro.</a> Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).</li>
<li>Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histone+methyltransferase+modulates+antigenic+variation+in+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes.</a> PLoS Biol. 6 (7), e161(2008).</li>
<li>Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast-endonuclease-generated+DNA+break+induces+antigenic+switching+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).</li>
<li>Engstler, M., Pfohl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Flow-Mediated+Protein+Sorting+on+the+Cell+Surface+of+Trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes.</a> Cell. 131 (3), 505-515 (2007).</li>
<li>Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+dynamics+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei.</a> Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

No que diz respeito à técnica experimental, o componente mais importante do protocolo é manter todas as amostras frias. Tripanossomas internalizar muito rapidamente anticorpo ligado à sua superfície 9, mas este processo é dependente da motilidade, e não influencia o ensaio, enquanto as células são mantidas a 4 ° C. Todas as amostras devem sempre ser mantidos em gelo, e pipetagem deve ser feito rapidamente para minimizar a exposição ao ambiente C laboratório 25 °. Frio HMI-9 com soro deve estar disponível no i...

O parasita protozoário, o Trypanosoma brucei, é um agente causador de doenças que afetam os seres humanos (via Trypanosoma brucei gambiense e Trypanosoma brucei rhodesiense) e animais (via Trypanosoma brucei brucei) em toda a África Sub-Sahariana. Ele é transmitido para o hospedeiro mamífero através da saliva do vector mosca tsé-tsé. Ambos Humana e tripanossomíase Africano Animal causar uma carga económica grave em regiões endêmicas, e poucas drogas são disponíveis ou em desenvolvimento para o tratamento de qualquer doença. Compreender mecanismos de evasão imunitária é crítico para o desenvolvimento de drogas para a tripanossomíase. A variação antigênica do revestimento denso, Variante glicoproteína de superfície (VSG) que cobre o parasita é um dos meios primários pelos quais T. brucei evita a resposta do anticorpo de mamífero. Cerca de 2000 variantes do gene VSG existem no genoma tripanossoma, mas só um é transcrito em qualquer momento a partir de uma de ~ 15 expresSites SION. &#39;Comutação&#39; da VSG expresso pode ocorrer quer por cópia de um gene de VSG no local de expressão activa, ou por activação da transcrição de um local de expressão anteriormente silenciosos (revisto em 1). Embora muito trabalho foi dedicado à compreensão variação antigênica em T. brucei, os fatores que influenciam a freqüência de comutação são ainda pouco compreendidos. Estudos até à data têm sido dificultados pelo fato de que, enquanto a comutação ocorre estocasticamente in vitro, freqüências de chaveamento são muito baixos, da ordem de 1 a cerca de 10 6 células 2. Isso torna difícil para medir se um fator dadas aumenta ou diminui frequência de comutação, uma vez que a mudança é difícil de detectar, em primeiro lugar. Antes de 2009, os métodos para isolar switchers em uma dada população foram longo e trabalhoso. Estas células Passaging tripanossomas através de ratinhos imunizados contra o VSG dominante e em seguida colhem incluídosum dias mais tarde três, contando ou centenas de células por imunofluorescência 4,5. Outra estratégia baseia-se na seleção para resistência a drogas para isolar switchers 6. Porque tripanossomas africanos cultivadas in vitro são geralmente composta de uma população grande expressando uma variante importante, e uma população muito menor de switchers que expressam variantes alternativas, referimo-nos à grande variação ao longo deste artigo como o, VSG começando dominante. Ao fazê-lo, nós, de modo algum pretendo afirmar que este importante variante tem maior aptidão do que outras variantes na população. Aqui nós descrevemos um método que pode medir de forma confiável o número de tripanossomas expressando um VSG não dominante numa dada população em 3-4 horas. Este método é particularmente útil para quando se quer determinar se um dado manipulação genética ou tratamento medicamentoso aumenta o número de células ligadas em uma população. Em vez de libertar a população de células que expressam a fazerminant, começando VSG através de drogas ou por meios imunológicos, estas células são eliminadas por primeiro revestindo-os com pérolas magnéticas acopladas a anticorpos contra a VSG dominante e em seguida isolá-los sobre uma coluna magnética. A população ligado é então recolhido no fluxo de passagem e coradas novamente com um anticorpo marcado com fluoróforo anti-VSG para a identificação de contaminantes. A quantificação é conseguida através da adição de um número definido de pérolas de contagem absoluta de cada amostra de modo que a razão de pérolas para células pode ser determinada e utilizada para quantificar o número de comutadores na população 7.

<table><tbody><tr><td>anticorpo anti-VSG não marcado</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>O anticorpo VSG é fabricado internamente</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-VSG marcado com fluoróforo</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>O anticorpo VSG é fabricado internamente</td></tr><tr><td>HMI-9 Mídia</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>HMI-9 é fabricado internamente</td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>BD Pharmingen</td><td>556463</td><td></td></tr><tr><td>CountBright contas de contagem absoluta</td><td>Thermofisher Colunas Scientific</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>LD</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Ímã MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Separador magnético MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>adaptador de vórtice-60</td><td>ThermoFisher citômetro de</td> fluxo <td>AM10014</td><td></td>científico</tr><tr><td></td><td>Coulter</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>software de análise de citômetro de fluxo</td><td>FloJo</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

detecção de<em&gt; trypanosoma brucei</em&gt; switching variant glicoproteína de superfície por magnetic celular ativado seleção e citometria de fluxo

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, um parasita protozoário que causa tripanossomíase africana humana e animal (conhecida como doença do sono e nagana, respectivamente) alterna entre um vetor tsé-tsé e um hospedeiro mamífero. Ele escapa do sistema imunológico do hospedeiro mamífero trocando periodicamente a glicoproteína de superfície densa e variante (VSG) que cobre sua superfície. A detecção de variação antigênica em Trypanosoma brucei pode ser complicada e trabalhosa. Aqui, apresentamos um método para quantificar o número de parasitas que 'mudaram' para expressar um novo VSG em uma determinada população. Os parasitas são primeiro corados com um anticorpo contra o VSG inicial e, em seguida, corados com um anticorpo secundário ligado a um cordão magnético. Os parasitas que expressam o VSG inicial são então separados do resto da população, passando os parasitas por uma coluna presa a um ímã. Os parasitas que expressam o VSG inicial dominante são retidos na coluna, enquanto o fluxo contém parasitas que expressam um novo VSG, bem como alguns contaminantes que expressam o VSG inicial. Essa população de fluxo contínuo é corada novamente com um anticorpo marcado com fluorescência contra o VSG inicial para rotular contaminantes e iodeto de propídio (PI), que rotula células mortas. Um número conhecido de contas de contagem absoluta que são visíveis por citometria de fluxo é adicionado à população de fluxo. A proporção de grânulos para o número de células coletadas pode então ser usada para extrapolar o número de células em toda a amostra. A citometria de fluxo é usada para quantificar a população de switchers contando o número de células PI negativas que não se coram positivamente para o VSG inicial dominante. A proporção de comutadores na população pode então ser calculada usando os dados de citometria de fluxo.

O método aqui descrito foi utilizado para demonstrar que as quebras de cadeia dupla no interior do local de expressão VSG aumentou o número de comutadores numa população 8. Aqui, mostramos resultados representativos de uma população de tripanossomas que têm sido igualmente induzidos para gerar uma ruptura de fita dupla no local expressão. Nós comparar estes tripanossomas para aqueles que não tenham sido induzidas a gerar uma ruptura de fita dupla. A Figura 1 m...

Os tripanossomas africanos cultivados in vitro sofrem variação antigênica em uma taxa baixa, de modo que as populações são compostas de parasitas que expressam um tipo de glicoproteína de superfície variante dominante (VSG) e uma pequena população de variantes "trocadas". Este protocolo descreve um método rápido para detectar e quantificar essas populações.

detecção de<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variant glicoproteína de superfície por Magnetic celular ativado Seleção e citometria de fluxo

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

O objetivo geral deste método é isolar tripanossomos que expressam uma determinada glicoproteína de superfície variante ou VSG do restante da população e identificar parasitas que mudaram da VSG dominante inicial para qualquer outra VSG. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia dos tripanossomos, como, por exemplo, quais são os fatores ou eventos que influenciam a troca de VSG em uma população de parasitas. A principal vantagem desta técnica é que ela é mais rápida do que os métodos publicados anteriormente e permite a quantificação fácil de células que mudaram em relação às que não mudaram.Quando o laboratório começou a trabalhar com variação antigênica, o primeiro problema foi como detectar mudanças raras. Esse tipo de problema já havia sido resolvido na imunologia alguns anos antes, por meio da utilização de triagem celular ativada por campo magnético para enriquecer células que eram negativas para uma característica específica. Adaptar esse processo de não seleção à variação antigênica parecia uma ideia muito promissora.Para iniciar, os tripanossomos sanguíneos da linhagem Lister 427 devem ser cultivados até uma densidade de 0,5 a 100.000 por mililitro. Aliquotar uma amostra de 50 vezes 10 elevado a 6 células em um tubo de 15 mililitros e, em seguida, centrifugar. Reservar 1 vez 10 elevado a 6 células e cultivar para serem utilizadas posteriormente como controles positivo e negativo de anticorpo.Retire com pipeta a maior parte do sobrenatante, deixando aproximadamente 750 microlitros no tubo. Transfira as células para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Por fim, centrifugue as células a quatro graus Celsius durante quatro minutos a 2800 vezes g.Em seguida, aspire todo o sobrenadante. Re-suspenda as células em 150 microlitros de meio de cultura, acrescido do anticorpo primário anti glicoproteína de superfície variante ou anti VSG na diluição apropriada. A seguir, agite as células em vórtex a quatro graus Celsius por 10 minutos.Lave com 800 a 1000 microlitros de meio de cultura frio. Centrifugue as células a quatro graus Celsius por quatro minutos a 5200 vezes g. Após a aspiração do sobrenadante, lave as células com um mililitro de meio de cultura e centrifugue novamente.Remova o sobrenatante e ressuspenda o pellet em 100 microlitros de meio de cultura. Adicione 110 microlitros de microesferas magnéticas de separação celular do tipo apropriado para o anticorpo primário. Misture bem pipetando para cima e para baixo e, em seguida, use vórtex.Enquanto as células estão sendo vortexadas, prepare uma coluna de separação ativada por imã. Coloque um tubo de 15 mililitros abaixo dela para coletar o meio de condicionamento. Adicione dois mililitros de meio de cultura para condicionar a coluna.Em seguida, retire a amostra do vórtex e adicione de 800 a 1000 microlitros de meio de cultura frio. Centrifugue a amostra e, em seguida, remova o sobrenadante para eliminar o anticorpo não ligado. Lave as células do sedimento com um mililitro de meio de cultura e centrifugue novamente.Neste momento, aspire o sobrenadante, mas deixe 100 microlitros no tubo. Agite vigorosamente o tubo de centrífuga até que o precipitado seja completamente ressuspenso. Adicione um mililitro de meio de cultura e pipeteie para cima e para baixo para ressuspender completamente as células.Remova o tubo cônico de 15 milímetros usado para coletar o meio de pré-lavagem e substitua-o por um novo tubo cônico de 15 mililitros para coletar o eluato contendo os parasitas trocados. Aplique a suspensão celular na coluna previamente equilibrada. Colete o eluato em um tubo de 15 mililitros posicionado abaixo, o que normalmente leva de seis a sete minutos para um mililitro de meio mais tripanossomos.Em seguida, lave a coluna duas vezes com um mililitro de meio de cultura e colete o fluxo passante no mesmo tubo. Divida o fluxo passante, que deve totalizar aproximadamente três mililitros, em dois tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro. Em seguida, coloque os tubos sobre gelo.Adicione três mililitros de meio de cultura à coluna e mergulhe a coluna em um tubo cônico de 15 mililitros. Isso permitirá obter as células que expressam a VSG dominante inicial. Retire 300 microlitros deste material eluído e mantenha-o em gelo; o restante pode ser descartado.Para criar um controle positivo, retire aproximadamente 100.000 células da cultura inicial de células e pipete-as para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. Repita este procedimento para criar um controle negativo. Centrifugue as amostras de fluxo passante e a amostra de controle positivo.Em seguida, remova e descarte o sobrenatante. Ressuspenda as células do controle positivo em 100 µL de meio de cultura com anticorpo primário marcado com fluoróforo anti-VSG na diluição apropriada. A seguir, ressuspender um pellet de fluxo passante em 100 µL de meio de cultura com anticorpo primário marcado com fluoróforo anti-VSG na diluição apropriada.Utilize a suspensão para, em seguida, ressuspender o pellet no segundo tubo de fluxo passante, resultando em um único tubo de pool. Misture bem pipetando para cima e para baixo. Vortexe as células e então adicione de 800 a 1000 microlitros de meio de cultura frio.Centrifugue as amostras a quatro graus Celsius durante quatro minutos a 5200 ×g e, em seguida, descarte o sobrenadante para remover qualquer anticorpo não ligado. Lave as células com um mililitro de meio de cultura e depois centrifugue as células. Os controles positivo e negativo e as células eluídas previamente armazenadas em gelo.Descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione 148,5 microlitros de meio de cultura às amostras. Depois, adicione 25 microlitros de microesferas de contagem absoluta, seguidos por 1,5 microlitro de solução corante de iodeto de propídio.Resuspenda os pellets de controle positivo e negativo com 175 microlitros de meio de cultura. As amostras podem agora ser analisadas no citômetro de fluxo. Esses gráficos de citometria de fluxo mostram os resultados da separação celular de populações de tripanossomos induzidos a criar uma quebra de dupla fita no DNA em comparação com células não induzidas.Os painéis do lado esquerdo mostram a dispersão direta versus dispersão lateral, o que permite distinguir as células vivas das mortas e das microesferas adicionadas à amostra. Pode-se então criar janelas que determinam essas populações com base nas características de dispersão. Os painéis do lado direito mostram apenas aquelas células que puderam ser classificadas como vivas com base nas janelas de dispersão definidas nos painéis do lado esquerdo.O VSG inicial dominante neste caso foi o VSG dois. Células que se coram positivamente para iodeto de propídio são células mortas. E essas são observadas nas regiões Q um e Q dois do gráfico.Células que apresentam coloração positiva para a VSG dominante e negativa para o PI estão na região Q3 e são consideradas contaminantes. Por fim, as células no quadrante Q4 são células viáveis que apresentam coloração negativa para a VSG dominante e são consideradas células trocadoras. Este gráfico mostra as frequências de troca observadas e calculadas nas populações de tripanossomos com e sem quebras induzidas.O nível de comutação estocástica in vitro é bastante baixo. Embora a indução de uma quebra resulte em um número significativamente maior de células, comutando para o VSG não dominante. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cerca de três horas.ao realizar este procedimento, é importante manter as amostras frias durante todo o processo e ressuspender adequadamente os pellets, especialmente antes do isolamento na coluna. Após este procedimento, outros métodos, como o sequenciamento de RNA, podem ser utilizados para responder perguntas adicionais, como quais VSGs estão sendo expressos em uma população de troca. Esse método é tipicamente usado para medir a troca de VSG, mas também pode ser empregado para o isolamento e quantificação de parasitas que expressam qualquer proteína de superfície de interesse.

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Este manuscrito descreve o uso de uma cepa bioluminescente de tripanossomas africanos para permitir o rastreamento de infecções em estágio avançado e demonstra como imagens ao vivo in vivo podem ser usadas para visualizar infecções no sistema nervoso central em tempo real.

Bioluminescência de imagem para detectar a infecção fase tardia Africano Tripanossomíase

A adição de uma etiqueta a uma proteína é uma maneira poderosa de obter informações sobre sua função. Aqui, descrevemos um protocolo para marcar endogenamente centenas de proteínas de Trypanosoma brucei em paralelo, de modo que a marcação em escala de genoma seja alcançável.

De alto rendimento Gene Tagging no<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Vírus ou vesículas extracelulares foram imunocapturados com nanopartículas magnéticas de 15 nm acopladas a anticorpos que reconhecem antígenos de superfície. Os vírions ou vesículas capturados foram marcados com anticorpos fluorescentes contra outros antígenos de superfície. Os complexos resultantes foram separados em alto campo magnético e analisados com citômetros de fluxo convencionais acionados por fluorescência.

Fluxo Virometry para analisar antigênica Spectra de viriões e Extracelular vesículas

Este método de separação de tripanossoma do sangue varia de acordo com sua carga de superfície, sendo menos negativo do que células de sangue de mamíferos. Sangue contaminado é colocado e tratado em uma coluna de permutador de aniões. Esse método, o mais apropriado diagnóstico para tripanossomíase africana, fornece parasitas purificadas para investigações de imunológicos, biológicas, bioquímicas, farmacêuticas e de biologia molecular.

Purificação de tripanosomas extracelulares, incluindo africanos, de sangue por permutadores de aniões (colunas de celulose-Diethylaminoethyl)

A aspiração fina da agulha é uma técnica, por meio de que as pilhas são obtidas de uma lesão ou de um órgão usando uma agulha fina. Os materiais aspirados são manchados, manchados e examinados um microscópio para o diagnóstico ou usados para a biologia molecular, a citometria ou a análise in vitro. É barato, simples, rápido e provoca um trauma mínimo.

Deteção de parasitos extravascular do Trypanosoma pela aspiração fina da agulha

O objetivo geral deste protocolo é fornecer instruções sobre como medir a capacidade dos anticorpos presentes no soro ou plasma de indivíduos, naturalmente expostos à infecção por Plasmodium falciparum, para opsonizar e induzir fagocitose dos eritrócitos infectados por parasitas (IEs).

Medindo anticorpos indutores de fagocitose naturalmente adquiridos para parasitas plasmodium falciparum por um ensaio baseado em citometria de fluxo

Parasitas sanguíneos médicos em todo o mundo foram rastreados automaticamente usando passos simples em uma plataforma de IA low-code. O diagnóstico prospectivo de filmes de sangue foi aprimorado com o uso de um método de detecção e classificação de objetos em um modelo híbrido de aprendizagem profunda. A colaboração de monitoramento ativo e modelos bem treinados ajuda a identificar focos de transmissão de tripanossomas.

Auto-Identificação Superior de Parasitas Tripanossomas Usando um Modelo Híbrido de Aprendizagem Profunda

Descrevemos um método para estudar como o pH responde a pistas ambientais nos glicossomas da forma sanguínea de tripanossomas africanos. Essa abordagem envolve um sensor de proteína hereditária sensível ao pH em combinação com citometria de fluxo para medir a dinâmica do pH, tanto como um ensaio de curso de tempo quanto em um formato de tela de alto rendimento.

Medindo as alterações dinâmicas do pH glicossomal em Trypanosoma brucei vivo

Aprenda a isolar Trypanosoma brucei expressando glicoproteínas de superfície variantes específicas usando seleção magnética ativada por células. Este método permite detectar raros parasitas que sofreram switching de VSG de forma rápida e quantitativa.

detecção de Trypanosoma brucei Switching Variant glicoproteína de superfície por Magnetic celular ativado Seleção e citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal

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