Análise de importação proteína em cloroplastos isolados de plantas estressadas

O objetivo geral desta metodologia é estudar a importação de proteínas codificadas no núcleo para os cloroplastos, com foco particular nos efeitos do estresse. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do cloroplasto, como como a importação de proteínas do cloroplasto é regulada. Uma vantagem particular dessa técnica é que ela permite avaliar os efeitos do estresse na importação de proteínas do cloroplasto.

Embora este método tenha sido desenvolvido para uso com a planta modelo Arabidopsis thaliana, ele pode ser modificado e adaptado para uso com outros sistemas, como plantas cultivadas. Demonstrando o procedimento estará Qihua Ling, um pós-doutorado do meu laboratório. Para começar, primeiro cultive as plantas Arabidopsis conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.

Então, quando as plantas tiverem oito dias de idade, faça um tratamento de estresse. Raspe suavemente as plantas da placa de ágar com a mão e coloque-as em um frasco esterilizado de meio líquido MS contendo o estressor. Colocar plantas adicionais em um frasco semelhante sem estressor como controle também pode ser necessário, dependendo da natureza do experimento.

Cubra a boca dos frascos com papel alumínio esterilizado e deixe as plantas crescerem por mais dois dias em um agitador orbital com agitação suave. Prepare um gradiente de densidade contínuo misturando primeiro 13 mililitros de Percoll, 13 mililitros de dois tampão de isolamento de cloroplasto e cinco miligramas de glutationa em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Em seguida, centrifugue a mistura.

Após a centrifugação, manuseie o tubo com cuidado para evitar perturbar o gradiente e mantenha-o no gelo para usar mais tarde. Em seguida, transfira 100 mililitros de tampão de isolamento de cloroplasto por condição para um béquer de um litro. Remova as mudas do meio líquido despejando-as em uma peneira.

Em seguida, transfira-os para o copo contendo tampão de isolamento de cloroplasto. Enxágue o tecido com o tampão para remover qualquer meio residual e, em seguida, substitua o tampão por 100 mililitros de tampão de isolamento fresco. Para a primeira rodada de homogeneização, transfira o tecido vegetal para um copo de 50 mililitros manualmente, permitindo que o tampão anterior escorra pelos dedos.

Em seguida, coloque a sonda do homogeneizador de tecidos no tecido e homogeneize com dois pulsos de um a dois segundos cada. Filtrar o homogeneizado através de duas camadas de pano de filtração para um tubo de centrifugação de 250 mililitros. Termine apertando suavemente o pano.

Reter o filtrado e transferir o tecido vegetal de volta para o copo de 50 ml. Em seguida, coloque um segundo tampão de isolamento de cloroplasto de 20 mililitros no copo de 50 mililitros e adicione qualquer tecido restante que não tenha sido usado na primeira rodada de homogeneização. Repita as etapas de homogeneização e filtração mais quatro vezes.

Centrifugar o homogeneizado agrupado a 1 000 vezes g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Despeje o sobrenadante imediatamente após a centrifugação, tomando cuidado para não perturbar o pellet. Coloque o tubo no gelo e ressuspenda o pellet no sobrenadante residual, agitando suavemente o tubo.

Em seguida, use uma pipeta Pasteur para transferir suavemente o homogeneizado para o topo do gradiente de densidade contínuo pré-fabricado através da parede do tubo receptor. Em seguida, centrifugue a amostra e o gradiente em um rotor de balde oscilante a 7.800 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius com o freio desligado. Quando terminar, observe as duas faixas verdes que podem ser vistas no gradiente.

Descarte a banda superior, que contém cloroplastos quebrados, e use uma pipeta Pasteur para transferir a banda inferior contendo cloroplastos intactos para um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros. Em seguida, adicione 25 mililitros de tampão HMS no tubo e inverta o tubo duas vezes para lavar o Percoll dos cloroplastos. Em seguida, coloque o tubo de volta no rotor do balde oscilante e repela os cloroplastos.

Despeje o sobrenadante e ressuspenda o pellet no tampão residual, agitando suavemente o tubo no gelo. Adicione mais 100 a 300 microlitros do tampão HMS, se necessário, mas tente não diluir muito a amostra. Armazene os cloroplastos ressuspensos no gelo.

Comece adicionando cinco microlitros dos cloroplastos isolados a 495 microlitros de tampão HMS em um tubo de 1,5 mililitro. Inverta o tubo para misturar suavemente a solução. Em seguida, coloque uma lamínula em cima da câmara de contagem de um hemacitómetro.

Pipetar lentamente 40 a 60 microlitros da suspensão diluída de cloroplastos no espaço entre a lamínula e a câmara de contagem. Usando um microscópio de contraste de fase, faça a imagem dos cloroplastos com uma objetiva de 20x. Os cloroplastos intactos parecem redondos e brilhantes e são cercados por um halo de luz.

Em seguida, use a objetiva de 10x para o número de cloroplastos em 10 quadrados grandes. O número de cloroplastos por quadrado grande deve ficar em média entre 10 e 30. Se estiverem presentes cloroplastos demasiado poucos ou demasiados, ajustar o factor de diluição e repetir o procedimento.

Uma vez dentro da faixa adequada, calcule o número de cloroplastos por mililitro, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Para executar um curso de tempo com três pontos de tempo, prepare três tubos, cada um contendo uma alíquota de 130 microlitros de tampão de parada de importação, e deixe-os no gelo. Em um tubo de dois mililitros, prepare a reação de importação contendo o tampão de reação e a proteína precursora radiomarcada.

Observe que deve haver uma reação para cada condição a ser testada. Use aproximadamente 10 milhões de cloroplastos por ponto de tempo. Incube o tubo de reação a 25 graus Celsius em banho-maria sob uma quantidade limitada de luz.

Ocasionalmente, sacuda os tubos para ressuspender os cloroplastos. Conduzir um curso de tempo, com alíquotas de 130 mililitros da reação nos pontos de tempo necessários dentro da faixa linear de importação. Imediatamente após a retirada, transferir cada alíquota de 130 microlitros para um tubo de tampão de importação gelado misturado batendo suavemente no tubo e colocar os tubos no gelo até que o curso de tempo tenha sido concluído.

Uma vez removida a última amostra, centrifugar todas as amostras durante 30 segundos a 12 000 vezes g numa Microfuga. Em seguida, descarte os sobrenadantes e ressuspenda os pellets em 15 microlitros de dois tampão de carga de proteína. Em seguida, misture as amostras por vórtice.

Finalmente, analise todas as amostras, além de um controle de entrada precursor, usando SDS-PAGE padrão e autorradiografia, fluorografia ou fosforimaging. PsaD é um componente de 18 kilodalton do fotossistema I que é sintetizado como um precursor maior de 23 kilodaltons. O processamento para a forma madura de 18 kilodalton indica que ocorreu importação para os cloroplastos.

O mutante sp1 de Arabidopsis aqui estudado carrega um defeito em um importante regulador da maquinaria de importação de proteínas do cloroplasto, a proteína sp1. Sob condições de estresse, a quantidade de importação de proteína PsaD em cloroplastos mutantes sp1 é aumentada em relação ao tipo selvagem, mas não em condições normais não estressantes. Enquanto a forma proteica madura de PsaD se acumulou de maneira dependente do tempo com cloroplastos de ambos os genótipos de plantas, a taxa de importação foi significativamente maior para cloroplastos mutantes sp1 do que para cloroplastos do tipo selvagem.

Esses resultados implicam um papel importante para a proteína sp1 na regulação da importação de proteínas do cloroplasto sob condições de estresse. Uma vez dominado, esse método, desde o isolamento do cloroplasto até a conclusão do ensaio de importação, pode ser concluído em cinco a seis horas, se for executado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de realizar todas as etapas de isolamento do cloroplasto a quatro graus Celsius para garantir que os cloroplastos mantenham a atividade máxima.

Após seu desenvolvimento inicial há várias décadas, o ensaio de importação de proteína de cloroplasto in vitro abriu caminho para pesquisadores da área explorarem muitos aspectos diferentes do mecanismo de importação de proteína de cloroplasto. O refinamento aqui apresentado permite investigar os efeitos das condições de estresse na importação de proteínas. Não se esqueça de que trabalhar com material radioativo requer cuidados especiais.

Precauções como usar luvas, jaleco e óculos de segurança devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.