Geração rápida e eficiente de células-tronco pluripotentes Recombinante Humana pela recombinase mediada troca cassete no AAVS1 Locus

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma edição rápida e eficiente do genoma direcionado no AAVS1 de células-tronco pluripotentes humanas, ou PSCs humanas, usando uma abordagem flippase, Mediada por Recombinase, Cassette Exchange, ou RMCE. O RMCE melhora a inserção alvo de uma sequência no locus AAVS1, o que é de grande importância para a biologia das células-tronco, pois permite testes rápidos sobre a função de uma molécula por superexpressão ou knockdown. A principal vantagem desta técnica é que as linhas PSC humanas livres de eventos de integração aleatória, ainda pluripotentes e quando cariótipos normais podem ser criadas em apenas 15 dias.

Este método fornece uma ferramenta útil para a transgênese, no locus AAVS1, mas também pode ser aplicado a outros loci permissivos humanos. Para começar, cultive linhagens de células mestras PSC humanas sob procedimentos padrão dentro ou fora de fibroblastos embrionários de camundongos inativados ou iMEFs, em seis placas de poços. Quando as células atingem 60% a 70% de placa de confluência, iMEFs resistentes a medicamentos usando primeiro solução de gelatina a 0,1% para revestir os poços necessários de uma placa de 12 poços e incubar a placa em temperatura ambiente por cinco minutos.

Em seguida, coloque 125.000 iDR4s por poço e incube as culturas durante a noite com meio iMEF. No dia seguinte, pré-incube culturas de PSC humanas com meio fresco, incluindo inibidor de ROCK 10 micromolares a 37 graus Celsius por uma hora. Enquanto isso, leve a solução de transfecção ESC humana e o agente de dissociação celular à temperatura ambiente.

Preparar um mililitro de meio de plaqueamento de nucleofecção por condição de nucleofecção. Em seguida, remova o meio iDR4 dos poços, use um mililitro de PBS em temperatura ambiente para lavar as células e adicione o meio de plaqueamento de nucleofecção. Transfira 500 microlitros por amostra de meio de revestimento para tubos estéreis de 1,5 mililitro e armazene a 37 graus Celsius até o revestimento.

Para separar as PSCs humanas em uma suspensão de célula única, remova o meio, use PBS em temperatura ambiente para lavar as células e adicione um mililitro de 0,05% de tripsina ou Accutase em culturas de hPSC alimentadoras ou sem alimentador, respectivamente. Incube as culturas a 37 graus Celsius. Em seguida, remova cuidadosamente a placa da incubadora e, sem permitir que as células se desprendam, aspire o agente de dissociação e adicione 1 mililitro de meio PSC humano.

Dissocie as células soltas lavando suavemente o meio na superfície da placa, evitando a formação de espuma. Recolher as células numa suspensão unicelular num tubo limpo e estéril de 15 ou 50 mililitros. Em seguida, use 1 mililitro de meio hESC para lavar as células e coletá-las no mesmo tubo.

Pegue uma alíquota de 50 microlitros de suspensão de células para contar e centrifugue as células restantes a 300 vezes g em temperatura ambiente por cinco minutos. Contar as células com um dispositivo de contagem de células enquanto a suspensão está a ser centrifugada. Remova o sobrenadante e use PBS em temperatura ambiente para ressuspender suavemente a cor da célula para 10 elevado à sexta célula por mililitro.

Em seguida, transfira dois mililitros por condição experimental para tubos estéreis limpos de 15 mililitros e repita a centrifugação. Enquanto as amostras estão girando, prepare misturas de plasmídeos em três tubos limpos de 1,5 mililitro com proporções moleculares de flippase de doadores de 0:1, 2:1 e 2:0 usando 2,5 microgramas de plasmídeo flippase. Para prosseguir com a nucleofecção, remova a placa iDR4 e o tubo de 1,5 mililitro com meio de revestimento da incubadora.

Um tubo de cada vez, sem perturbar o pellet, pipetar cuidadosamente o PBS, removendo o máximo possível do tampão. Use 100 microlitros de solução de transfecção para ressuspender o pellet pipetando suavemente. Em seguida, transfira a suspensão celular para o tubo de 1,5 mililitro contendo as misturas de plasmídeo e misture suavemente.

Transfira a mistura de DNA celular para a cubeta tranfector, prestando atenção para não introduzir bolhas. Insira a cubeta no dispositivo nucleofector e execute o programa A13 para células cultivadas em alimentadores ou F16 para transfecção sem alimentador. Remova a cubeta e use as pipetas de transferência descartáveis do kit para adicionar 0,5 mililitros de meio de revestimento na cubeta suavemente, mas rapidamente e em um movimento.

Em seguida, recupere o volume da mesma maneira e coloque-o gota a gota na placa de 12 poços contendo o iDR4 e o meio de revestimento. Coloque a placa de cultura em uma prateleira na incubadora e mova-a lentamente para frente e para trás e de um lado para o outro para distribuir uniformemente a suspensão celular. Incube o prato por 24 horas antes de trocar o meio.

Dois a três dias após a transfecção, inicie a seleção. Aspire o meio, use 1 mililitro de PBS para lavar as células e, em seguida, adicione o meio ESC humano com 100 nanogramas por mililitro de puromicina. Observe o crescimento celular e aumente a concentração de puromicina de acordo até um máximo de 250 nanogramas por mililitro, continuando a seleção de puromicina por sete dias.

Após três a quatro dias na seleção de puromicina, comece a seleção com fialuridina 0,5 micromolar ou FIAU. Alterar o meio diariamente e manter a UAIF durante não mais de sete dias contínuos. Após a conclusão da seleção, por volta dos dias 14 a 15, colônias RMCE resistentes estarão presentes e constituirão a nova linhagem RMCE.

Divida as células na proporção de 1:2 seguindo os procedimentos padrão. Quando os poços da Chave 1 estiverem prontos para se dividir, dissocie o poço para caracterização em uma única suspensão celular, conforme descrito anteriormente no vídeo, e colete as células em um tubo de 15 mililitros. Gire as células a 300 vezes g em temperatura ambiente por cinco minutos.

Em seguida, use um mililitro de PBS para ressuspender as células e dividir a amostra em duas. Um filtrado usando um filtro de células para realizar citometria de fluxo e o outro para análise de DNA de acordo com o protocolo de texto. Após a transfecção com flippase recombinase e o doador tdT RMCE, as hPSCs formaram pequenos grupos de células distribuídas uniformemente sobre a camada iDR4 MEF e expressaram GFP constitutiva e tdT transitória.

A seleção positiva usando puromicina favorece a inserção do doador RMCE, em seguida, a seleção negativa usando FIAU seleciona apenas eventos de recombinação mediados por FRT sem TK. Por volta do sexto dia após a transfecção, pequenos aglomerados de células RMCE GFP-negativas e tdT-positivas podem ser identificadas. Conforme demonstrado aqui, as colônias de RMCE GFP-negativas e tdT-positivas estão presentes apenas quando o doador RMCE e a flippase são usados, enquanto o RMCE não ocorre na ausência de flippase. A caracterização por citometria de fluxo das linhagens RMCE recém-geradas, que são as colônias RMCE resistentes à puromicina e FIAU, combinadas em uma população de células não clonais, confirma que 100% das células representam o fenótipo RMCE GFP-negativo, tdT-positivo.

Quando doadores RMCE sem atividade de gravador em hPSC são usados, 100% das células são GFP-negativas. A caracterização por PCR mostrada aqui da linhagem RMCE não clonal, demonstra a troca completa de e que o programa de seleção utilizado gera linhagens aleatórias livres de integração, tanto do doador RMCE quanto do vetor que expressa flippase. Em resumo, este método RMCE simplifica significativamente a edição de genes em hPSCs para um locus definido em comparação com nucleases direcionadas.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 15 dias. Portanto, o RMCE é uma ferramenta de edição de genes muito rápida que permitirá estudos comparativos em um ambiente isogênico. Ao usar este procedimento, é importante ter eficiências de transfecção superiores a 30% e pré-executar o agente de seleção de armazenamento de núcleo apropriado.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como realizar o RMCE no locus AAVS1 de PSCs humanas e como caracterizar a linha recombinada.