Name: Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprenda a gerar células T regulatórias antígeno específicas a partir de células iPSC para imunoterapia contra artrite autoimune. Este método produz células uniformes e funcionais para aplicações clínicas.

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Este projecto foi financiado, em parte, sob bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (R01AI121180, R21AI109239 e K18CA151798), a American Diabetes Association (1-16-IBS-281), e do Departamento de Pensilvânia da Saúde (tabaco fundos de liquidação) para JS

<ol><li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+concepts+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolving concepts of rheumatoid arthritis.</a> Nature. 423, 356-361 (2003).</li>
<li>Ferraro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interindividual+variation+in+human+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interindividual variation in human T regulatory cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E1111-E1120 (2014).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-expanded+antigen-specific+regulatory+T+cells+suppress+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes.</a> J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).</li>
<li>van Herwijnen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+that+recognize+a+ubiquitous+stress-inducible+self-antigen+are+long-lived+suppressors+of+autoimmune+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells that recognize a ubiquitous stress-inducible self-antigen are long-lived suppressors of autoimmune arthritis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 14134-14139 (2012).</li>
<li>Wright, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+therapy+with+redirected+primary+regulatory+T+cells+results+in+antigen-specific+suppression+of+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Adoptive therapy with redirected primary regulatory T cells results in antigen-specific suppression of arthritis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19078-19083 (2009).</li>
<li>Schmitt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+development+and+establishment+of+T+cell+competence+from+embryonic+stem+cells+differentiated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro.</a> Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).</li>
<li>La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T-cell+development+from+human+cord+blood+hematopoietic+stem+cells+by+Delta-like+1+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro.</a> Blood. 105, 1431-1439 (2005).</li>
<li>Lei, F., Haque, R., Weiler, L., Vrana, K. E., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lineage+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">T lineage differentiation from induced pluripotent stem cells.</a> Cell Immunol. 260, 1-5 (2009).</li>
<li>Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+towards+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes.</a> J Vis Exp. , e3986(2012).</li>
<li>Lei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+programming+of+tumor+antigen-specific+T+lymphocytes+from+pluripotent+stem+cells+to+promote+cancer+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance.</a> Cancer Res. 71, 4742-4747 (2011).</li>
<li>Haque, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+of+regulatory+T+cells+from+pluripotent+stem+cells+and+prevention+of+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity.</a> J Immunol. 189, 1228-1236 (2012).</li>
<li>Chi, V., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry%3A+paraffin+sections+using+the+Vectastain+ABC+kit+from+vector+labs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Lu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+all-trans+retinoic+acid+in+stabilizing+human+natural+regulatory+T+cells+under+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Critical role of all-trans retinoic acid in stabilizing human natural regulatory T cells under inflammatory conditions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E3432-E3440 (2014).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-9-CD44+interaction+enhances+stability+and+function+of+adaptive+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Galectin-9-CD44 interaction enhances stability and function of adaptive regulatory T cells.</a> Immunity. 41, 270-282 (2014).</li>
<li>Di Stasi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+apoptosis+as+a+safety+switch+for+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.</a> N Engl J Med. 365, 1673-1683 (2011).</li>
<li>Ramos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+caspase+9+suicide+gene+to+improve+the+safety+of+mesenchymal+stromal+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An inducible caspase 9 suicide gene to improve the safety of mesenchymal stromal cell therapies.</a> Stem Cells. 28, 1107-1115 (2010).</li>
<li>Haque, R., Lei, F., Xiong, X., Wu, Y., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3+and+Bcl-xL+cooperatively+promote+regulatory+T+cell+persistence+and+prevention+of+arthritis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">FoxP3 and Bcl-xL cooperatively promote regulatory T cell persistence and prevention of arthritis development.</a> Arthritis Res Ther. 12, R66(2010).</li>
<li>van Loenen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+T+cell+receptor+dimers+harbor+potentially+harmful+neoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).</li>
<li>Kim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antigen-specific+human+regulatory+T+cells%3A+immunosuppression+of+FVIII-specific+T-+and+B-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses.</a> Blood. 125, 1107-1115 (2015).</li>
<li>Himburg, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotrophin+regulates+the+expansion+and+regeneration+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.</a> Nat Med. 16, 475-482 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Neste protocolo, um passo crítico é a diferenciação in vitro de iPSCs transduzidas com genes / FoxP3 TCR. In vitro sinalização Notch induz o desenvolvimento para a linhagem de células T. Para diferenciar iPSCs em células CD4 + Foxp3 + Tregs, foram utilizadas as células B OP9-DL1 / DL4 / IA, que moléculas altamente expressa MHC II (IA b). A maioria dos iPSCs diferenciar-se em células T CD4 +. No entanto, após a expressão de TCR da superfície, muitas...

A artrite autoimune é uma doença sistêmica caracterizada por hiperplasia do tecido sinovial e destruição progressiva da cartilagem articular, osso e ligamentos1. A geração ou função defeituosa de Tregs na artrite autoimune contribui para a inflamação crônica e lesão tecidual porque as Tregs desempenham um papel crucial na prevenção do desenvolvimento de células imunes auto-reativas. 
A manipulação de Tregs é uma estratégia ideal para o desenvolvimento de terapias para suprimir a inflamação de maneira dependente de Ag. Para a imunoterapia baseada em Treg, a especificidade das Tregs transferidas é importante para o tratamento da autoimunidade contínua2. Para exibir a atividade supressora, as Tregs precisam migrar e ser retidas na região afetada, o que pode ser direcionado pela especificidade do TCR para o Ag naquele local3. Embora as Tregs policlonais possam conter uma pequena população contendo essa especificidade de Ag de seus TCRs, o número dessas Tregs específicas para Ag é geralmente baixo. Consequentemente, as terapias baseadas em células usando Tregs policlonais contra doenças autoimunes requerem transferências adotivas de um grande número de Tregs4,5. Como as células-tronco pluripotentes (PSCs) têm a capacidade de se desenvolver em qualquer tipo de célula, as PSC-Tregs específicas para Ag podem ser boas candidatas para a imunoterapia baseada em Treg. Estudos anteriores mostraram o desenvolvimento bem-sucedido de células T derivadas de PSC, incluindo Tregs6-8. 
Aqui, descrevemos um protocolo para desenvolver iPSC-Tregs específicos para Ag. Descrevemos ainda uma terapia baseada em células de artrite autoimune em um modelo murino usando tais Tregs. Este método é baseado na modificação genética de iPSCs murinas com TCRs específicos para Ag e o fator transcricional FoxP3. As iPSCs projetadas então se diferenciam em Tregs específicas de Ag nas células estromais OP9 que expressam as moléculas de ligantes Notch DL1, DL4 e MHC-II (I-Ab) na presença das citocinas mFlt3L e mIL-7. Essas iPSC-Tregs específicas para Ag podem produzir citocinas supressoras, como TGF-β e IL-10, quando estimuladas com o Ag, e a transferência adotiva de tais Tregs tem a capacidade de suprimir o desenvolvimento de AIA em um modelo murino. O protocolo descrito pode ser usado para desenvolver Tregs específicas para Ag derivadas de células-tronco para possíveis intervenções terapêuticas.

<table><tbody><tr><td>Camundongos C57BL/6j</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>B6.129S7 Rag1tm1Mom/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2216</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD3 (2C11)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD28 (37.51) anticorpo</td><td>BD Pharmingen</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4 (GK1.5)</td><td>Biolegend</td><td>100417</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8 ( 53&ndash; 6.7) anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-CD25 (3C7)</td><td>Biolegend</td><td>101912</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCR-&beta; (H57597) anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>109220</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IL10</td><td>Biolegend</td><td>505010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TGF&beta;</td><td>Biolegend</td><td>141402</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Genejammer</td><td>Ciência integrada</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise ACK</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>peprotech</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Cuidado: Alergênico, carcenogênico,</td></tr><tr><td>tóxico Tampão de permeabilização</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>421002</tr><tr><td>mBSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Ova albumina</td><td>Avantor</td><td>0440-01</td><td></td></tr><tr><td>CFA</td><td>Difco</td><td>2017014</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner limitador</td><td>Braintree científico</td><td>RTV 150-STD</td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento de células-tronco de derivados de células t regulatórias antígeno específico da contra auto-imunidade

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

As doenças autoimunes surgem devido à perda da auto-tolerância imunológica. As células T reguladoras (Tregs) são importantes mediadores da auto-tolerância imunológica. Tregs representam cerca de 5 - 10% da subpopulação maduro de células T CD4 + em ratinhos e humanos, com cerca de 1 - 2% dos Tregs que circulam no sangue periférico. Induzidas células estaminais pluripotentes (IPSCs) podem ser diferenciados em Tregs funcional, que tem um potencial para ser utilizados para terapias baseadas em células de doenças auto-imunes. Aqui, apresentamos um método para desenvolver antigénio (Ag) Tregs especï¿½icos de iPSCs (ou seja, IPSC-Tregs). O método baseia-se na incorporação do factor de transcrição Foxp3 e um receptor de células T específico de Ag-(TCR) em iPSCs e, em seguida, a diferenciação em células do estroma expressando Notch OP9 ligandos semelhante a delta (DL) e uma DL4. Seguindo diferenciação in vitro, o CPSP-Tregs expressam CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, e Ag-TCR específico e são capazes de responder à estimulação Ag.Este método tem sido aplicado com sucesso para a terapia à base de células de artrite auto-imune num modelo murino. A transferência adoptiva destes específica iPSC-Ag-Tregs em artrite induzida por Ag (AIA) -bearing ratinhos tem a capacidade para reduzir a inflamação das articulações e inchaço e para prevenir a perda óssea.

Como mostrado aqui, no dia 28, específico do Ag Tregs expressa substancialmente CD3 e TCR específico do Ag, dois marcadores de células T. A população de células CD3 + + TCRVβ5 expressa CD4. A maioria das células CD3 +, CD4 + TCRVβ5 + também expressa CD25, CD127, e CTLA-4, que são normalmente expressas em níveis elevados em que ocorre naturalmente (regs T nTregs) e em células T que expressam ectopicamente FoxP3. FoxP3 expre...

Apresentamos aqui um método para desenvolver células T reguladoras (Tregs) específicas de antígeno funcional (Ag) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) para imunoterapia de artrite autoimune em um modelo murino.

Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

O objetivo geral deste experimento é desenvolver um novo método para gerar células T reguladoras associadas à articulação inflamada derivadas de células-tronco, para imunoterapia contra a artrite autoimune. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no campo da autoimunidade sobre potenciais imunoterápicos para artrite autoimune. A principal vantagem desta técnica é que as células T reguladoras derivadas de células-tronco são tipadas e de um único tipo.Inicie diluindo as células alimentadoras de interesse até uma densidade mínima de um vezes 10 à quarta células por centímetro quadrado em meio OP9, e semeando um vezes 10 à sexta células alimentadoras por placa de 10 centímetros. Quando as células atingirem 80 a 90% de confluência, remova o meio dos cultivos e semeie 0,5 a um vezes 10 à quinta células-tronco pluripotentes induzidas transduzidas por retrovírus, ou IPSCs, em meio OP9 em cada placa. Cinco dias depois, aspire o meio e lave as células com 10 mililitros de PBS.Em seguida, desprenda as células com quatro mililitros de tripsina por placa, a 37 graus Celsius. Após 10 minutos, interrompa as reações com oito mililitros de meio IPSC e recolha as células para centr

development-stem-cell-derived-antigen-specific-regulatory-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Células T reguladoras: potencial terapêutico para tratar a rejeição de transplantes e Diabetes Tipo I

Nós descrevemos um método para a geração de células T de memória, regulamentar e ingénuos a partir de um único dador de sangue humano. Tregs polarizada pode ser então comparada com outros subconjuntos de uma variedade de aplicações genéticas e funcionais com homogeneidade genética, incluindo um ensaio de supressão também detalhados aqui.

Geração de Células T reguladoras induzidas a partir de células T humanas primárias Naïve e Memória

Geração de linfócitos T de tronco pluripotentes induzidas (iPS) células dá uma abordagem alternativa de utilização de células-tronco embrionárias para T imunoterapia baseada em células. O método mostra que, utilizando...

Diferenciação de células Dirigido tronco pluripotentes induzidas no sentido de Linfócitos T

Este vídeo mostra uma terapia baseada em células para artrite autoimune em camundongos. As células T reguladoras derivadas de iPSC que expressam receptores específicos de ovalbumina são injetadas com albumina de soro bovino metilado (mBSA) emulsionada em um adjuvante. As células apresentadoras de antígenos murinos (APCs) processam e apresentam o mBSA às células T, estimulando a ativação e migração das células T para a membrana sinovial da articulação do joelho. As injeções subsequentes envolvem...

Uma terapia baseada em células para artrite autoimune em um modelo murino

Adenoviral de transferência do gene em células T CD4 naive com a expressão transgénica do receptor de adenovirus Coxsackie possibilita a análise molecular da diferenciação de células T...

Transdução de adenovírus Naive CD4 células T para estudar a diferenciação Treg

Este artigo descreve um método novo para gerar emigrantes Thymic de pilha-derivado induzido antígeno-específico do tumor (iTE) por um sistema Thymic tridimensional da cultura (3D). iTE é um subconjunto homogêneo de células T intimamente relacionadas com células T ingênuas com a capacidade de proliferação, formação de memória e supressão tumoral.

Um sistema tridimensional da cultura Thymic para gerar os Emigrants Thymic antígeno-específicos induzidos pilha-derivados do tumor derivado murine

Este artigo descreve um protocolo para a geração de pilhas CD8 T antígeno-específicas, e sua expansão in vitro, com o objetivo de render números elevados de pilhas de T funcionais para o uso in vitro e in vivo.

Geração de alta eficiência de células T Cytotoxic do rato preliminar antígeno-específico para o teste funcional em um modelo auto-imune do diabetes

Este artigo descreve um método para gerar células-tronco pluripotentes induzidas por antígeno funcional do tumor derivadas de CD8αβ+ únicas células T positivas usando o sistema de cocultura OP9/DLL1.

Usando células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para a geração de células T específicas de antígeno tumoral

Aqui apresentamos um protocolo para a supressão efetiva da replicação do vírus da hepatite B (HBV) em camundongos utilizando a transferência de células adotivas (ACT) de linfócitos T específicos de antígenos virais derivados de células-tronco (AG). Este procedimento pode ser adaptado para a imunoterapia baseada em ACT potencial da infecção por HBV.

Células-tronco derivadas virais AG-specific T da haste suprimir a replicação de HBV em ratos

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho simplificado para gerar e testar células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Geração de células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano

Aprenda a gerar células T regulatórias antígeno específicas a partir de células iPSC para imunoterapia contra artrite autoimune. Este método produz células uniformes e funcionais para aplicações clínicas.

Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade

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