Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade

O objetivo geral deste experimento é desenvolver um novo método para gerar células-tronco derivadas de células T reguladoras associadas à articulação inflamada derivada de células-tronco para imunoterapia contra artrite autoimune. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da autoimunidade sobre potenciais imunoterpeutics para artrite autoimune. A principal vantagem dessa técnica é que as células-tronco

Comece diluindo as células alimentadoras de interesse a uma densidade mínima de uma vez 10 a quarta célula por centímetro quadrado no meio OP9 e plaqueando uma vez 10 à sexta célula alimentadora por prato de 10 centímetros. Quando as células se tornarem 80 a 90% confluentes, remova o meio das culturas e semeie 0,5 a uma vezes 10 elevado ao quinto, células-tronco pluripotentes induzíveis transduzidas retroviralmente ou IPSCs em meio OP9 em cada placa. Cinco dias depois, aspirar o meio e lavar as células com 10 mililitros de PBS.

Em seguida, separe as células com quatro mililitros de tripsina por prato, a 37 graus Celsius. Após 10 minutos, pare as reações com oito mililitros de meio IPSC e puxe as células para centrifugação. Ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio IPSC fresco e recoloque as células em novos pratos de 10 centímetros.

Deixe as células alimentadoras aderirem à placa por 30 minutos na incubadora de cultura de células. Em seguida, colete as IPSCs flutuantes e filtre as células transduzidas através de um filtro de 70 mícrons para contagem. Semeie cinco vezes 10 a quinta IPSCs em uma placa fresca de 80 a 90% confluente de células alimentadoras em meio OP9 suplementado com Murine-Flt3-Ligand e devolva as culturas à incubadora.

Após três dias, use uma pipeta de 10 mililitros para lavar o prato com o meio de cultura. Em seguida, adicione cinco mililitros de meio OP9 fresco ao prato e lave suavemente quaisquer IPSCs semi-aderentes com pipetagem cuidadosa e vigorosa que não rompa a camada de células alimentadoras. Repita a lavagem com 10 mililitros de PBS para colher a última das células semi-aderentes, puxando as lavagens de cada prato em um tubo cônico por cultura.

Depois de girar as células, ressuspenda os pellets em 10 mililitros de meio OP9 suplementado com Murine-Flt3-Ligand e IL-7 e filtre as células através de um filtro de 70 mícrons. Semeie uma cultura de IPSC por poço em uma placa de cultura de seis poços contendo 80 a 90% de monocamadas de células alimentadoras confluentes e devolva as coculturas à incubadora. A cada dois dias, substitua metade do meio por meio OP9 fresco suplementado com ligante Murine-Flt3 e IL-7 e, a cada quatro a seis dias, semeie novamente os IPSCs diferenciados em novas placas com uma nova camada de células alimentadoras, conforme necessário.

Comece destacando as culturas de células de interesse com tripsina e ressuspendendo cada tipo de célula em 10 mililitros de meio fresco. Coloque cada cultura de células em um novo prato de 10 centímetros e permita que as células alimentadoras adiram na incubadora de cultura de células. Após 30 minutos, colete as IPSCs flutuantes e passe as culturas por filtros de células individuais de 70 mícrons para remover os aglomerados de células para contagem.

Ressuspenda cada cultura em uma concentração de 1,5 vezes 10 elevado à sétima células por mililitro em PBS frio, filtrando novamente conforme necessário. Em seguida, coloque camundongos C57BL / 6 fêmeas de quatro a seis semanas de idade, um de cada vez, em um pequeno animal de contenção e transfira adotivamente 200 microlitros de um tipo de célula por camundongo para a veia da cauda de cada animal. Use um paquímetro de discagem para medir o inchaço de ambos os joelhos para estabelecer a medição da linha de base.

10 dias após a transferência celular, use uma seringa de um mililitro para injetar nos camundongos 100 microgramas de BSA metilado emulsionado em adjuvante de Freund completo na base da cauda de cada animal experimental. 17 dias após a transferência celular, induzir artrite por injeção intra-articular de 20 microgramas de BSA metilado em 10 microlitros de PBS na articulação do joelho esquerdo e 20 microgramas de BSA metilado e 100 microgramas de ovalbumina inteira em 10 microlitros de PBS na articulação direita do joelho de cada animal anestesiado transferido adotivamente. Sete dias após a indução da artrite, meça os joelhos novamente para o cálculo do aumento percentual no diâmetro do joelho e excise cirurgicamente as patelas.

Fixe as juntas em formalina. Em seguida, após a descalcificação em EDTA, embutir os joelhos em parafina e obter cortes de quatro mícrons para coloração e análise histoquímica. No dia 28, as células T reguladoras específicas do antígeno expressam níveis substanciais de CD3 e receptores de células T específicas do antígeno.

A maioria dessas células também expressa CD25, CD127 e CTLA-4, todos os quais são tipicamente expressos em níveis elevados em células T reguladoras de ocorrência natural. De fato, FoxP3 persiste em células T reguladoras derivadas de IPSC, mesmo após estimulação in vitro de longo prazo com o ligante Notch, conforme detectado por coloração intracelular. Além disso, essas células reguladoras de IPSC T específicas do antígeno produzem citocinas supressoras quando estimuladas com esplenócitos pulsados por antígeno in vitro, indicando um potencial fenótipo supressor para essas células.

Células positivas para FoxP3 são observadas em joelhos tratados com OVA, sem células positivas para FoxP3 aparentes em joelhos que recebem IPSCs transduzidas por vetor de controle. Além disso, muito mais células CD4 positivas, FoxP3 positivas, TCR3 Beta 5 positivas são visualizadas nos joelhos de camundongos que recebem IPSCs transduzidas com o vetor TCR-FoxP3 do que apenas com o vetor FoxP3, sugerindo que as células IPSC-Treg específicas do antígeno migram para o joelho de artrite induzida por antígeno após sua transferência adotiva para animais receptores. A transferência adotiva de células derivadas de IPSC também afeta uma diminuição substancial no inchaço inflamatório do joelho quando o OVA está presente, mas não tem efeito no controle metilado de joelhos injetados com BSA.

Os efeitos positivos da redução do inchaço são ainda confirmados pela imagem Micro-CT de alta resolução da perda óssea reduzida observada em joelhos tratados com transferência de células em comparação com animais injetados apenas com MBSA controle. Uma vez reunidos, esses procedimentos aprofundados podem ser concluídos em seis semanas se forem executados corretamente. Ao tentar esta técnica, é importante lembrar de induzir a diferenciação imbuída das IPSCs transduzidas pelo antígeno TCR-FoxP3.

Após este procedimento, diferentes compostos de citocinas supressoras também podem ser deliberados para responder a perguntas adicionais sobre a sobrevivência e a qualidade das células T reg IPSCs específicas do antígeno. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da terapia baseada em células explorarem o papel das células T reguladoras específicas do antígeno na doença autoimune. Não se esqueça de que trabalhar com bactors diretos de carroceria pode ser extremamente perigoso e que a precaução, como trabalhar em uma instalação básica de duas, deve sempre ser tomada durante a execução de um procedimento.

Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.