Name: Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprenda a gerar células T regulatórias antígeno específicas a partir de células iPSC para imunoterapia contra artrite autoimune. Este método produz células uniformes e funcionais para aplicações clínicas.

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Este projecto foi financiado, em parte, sob bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (R01AI121180, R21AI109239 e K18CA151798), a American Diabetes Association (1-16-IBS-281), e do Departamento de Pensilvânia da Saúde (tabaco fundos de liquidação) para JS

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<li>Lu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+all-trans+retinoic+acid+in+stabilizing+human+natural+regulatory+T+cells+under+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Critical role of all-trans retinoic acid in stabilizing human natural regulatory T cells under inflammatory conditions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E3432-E3440 (2014).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-9-CD44+interaction+enhances+stability+and+function+of+adaptive+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Galectin-9-CD44 interaction enhances stability and function of adaptive regulatory T cells.</a> Immunity. 41, 270-282 (2014).</li>
<li>Di Stasi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+apoptosis+as+a+safety+switch+for+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.</a> N Engl J Med. 365, 1673-1683 (2011).</li>
<li>Ramos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+caspase+9+suicide+gene+to+improve+the+safety+of+mesenchymal+stromal+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An inducible caspase 9 suicide gene to improve the safety of mesenchymal stromal cell therapies.</a> Stem Cells. 28, 1107-1115 (2010).</li>
<li>Haque, R., Lei, F., Xiong, X., Wu, Y., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3+and+Bcl-xL+cooperatively+promote+regulatory+T+cell+persistence+and+prevention+of+arthritis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">FoxP3 and Bcl-xL cooperatively promote regulatory T cell persistence and prevention of arthritis development.</a> Arthritis Res Ther. 12, R66(2010).</li>
<li>van Loenen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+T+cell+receptor+dimers+harbor+potentially+harmful+neoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).</li>
<li>Kim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antigen-specific+human+regulatory+T+cells%3A+immunosuppression+of+FVIII-specific+T-+and+B-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses.</a> Blood. 125, 1107-1115 (2015).</li>
<li>Himburg, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotrophin+regulates+the+expansion+and+regeneration+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.</a> Nat Med. 16, 475-482 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Neste protocolo, um passo crítico é a diferenciação in vitro de iPSCs transduzidas com genes / FoxP3 TCR. In vitro sinalização Notch induz o desenvolvimento para a linhagem de células T. Para diferenciar iPSCs em células CD4 + Foxp3 + Tregs, foram utilizadas as células B OP9-DL1 / DL4 / IA, que moléculas altamente expressa MHC II (IA b). A maioria dos iPSCs diferenciar-se em células T CD4 +. No entanto, após a expressão de TCR da superfície, muitas...

A artrite autoimune é uma doença sistêmica caracterizada por hiperplasia do tecido sinovial e destruição progressiva da cartilagem articular, osso e ligamentos1. A geração ou função defeituosa de Tregs na artrite autoimune contribui para a inflamação crônica e lesão tecidual porque as Tregs desempenham um papel crucial na prevenção do desenvolvimento de células imunes auto-reativas. 
A manipulação de Tregs é uma estratégia ideal para o desenvolvimento de terapias para suprimir a inflamação de maneira dependente de Ag. Para a imunoterapia baseada em Treg, a especificidade das Tregs transferidas é importante para o tratamento da autoimunidade contínua2. Para exibir a atividade supressora, as Tregs precisam migrar e ser retidas na região afetada, o que pode ser direcionado pela especificidade do TCR para o Ag naquele local3. Embora as Tregs policlonais possam conter uma pequena população contendo essa especificidade de Ag de seus TCRs, o número dessas Tregs específicas para Ag é geralmente baixo. Consequentemente, as terapias baseadas em células usando Tregs policlonais contra doenças autoimunes requerem transferências adotivas de um grande número de Tregs4,5. Como as células-tronco pluripotentes (PSCs) têm a capacidade de se desenvolver em qualquer tipo de célula, as PSC-Tregs específicas para Ag podem ser boas candidatas para a imunoterapia baseada em Treg. Estudos anteriores mostraram o desenvolvimento bem-sucedido de células T derivadas de PSC, incluindo Tregs6-8. 
Aqui, descrevemos um protocolo para desenvolver iPSC-Tregs específicos para Ag. Descrevemos ainda uma terapia baseada em células de artrite autoimune em um modelo murino usando tais Tregs. Este método é baseado na modificação genética de iPSCs murinas com TCRs específicos para Ag e o fator transcricional FoxP3. As iPSCs projetadas então se diferenciam em Tregs específicas de Ag nas células estromais OP9 que expressam as moléculas de ligantes Notch DL1, DL4 e MHC-II (I-Ab) na presença das citocinas mFlt3L e mIL-7. Essas iPSC-Tregs específicas para Ag podem produzir citocinas supressoras, como TGF-β e IL-10, quando estimuladas com o Ag, e a transferência adotiva de tais Tregs tem a capacidade de suprimir o desenvolvimento de AIA em um modelo murino. O protocolo descrito pode ser usado para desenvolver Tregs específicas para Ag derivadas de células-tronco para possíveis intervenções terapêuticas.

<table><tbody><tr><td>Camundongos C57BL/6j</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>B6.129S7 Rag1tm1Mom/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2216</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD3 (2C11)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD28 (37.51) anticorpo</td><td>BD Pharmingen</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4 (GK1.5)</td><td>Biolegend</td><td>100417</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8 ( 53&ndash; 6.7) anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-CD25 (3C7)</td><td>Biolegend</td><td>101912</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCR-&beta; (H57597) anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>109220</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IL10</td><td>Biolegend</td><td>505010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TGF&beta;</td><td>Biolegend</td><td>141402</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Genejammer</td><td>Ciência integrada</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise ACK</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>peprotech</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Cuidado: Alergênico, carcenogênico,</td></tr><tr><td>tóxico Tampão de permeabilização</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>421002</tr><tr><td>mBSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Ova albumina</td><td>Avantor</td><td>0440-01</td><td></td></tr><tr><td>CFA</td><td>Difco</td><td>2017014</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner limitador</td><td>Braintree científico</td><td>RTV 150-STD</td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento de células-tronco de derivados de células t regulatórias antígeno específico da contra auto-imunidade

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

As doenças autoimunes surgem devido à perda da auto-tolerância imunológica. As células T reguladoras (Tregs) são importantes mediadores da auto-tolerância imunológica. Tregs representam cerca de 5 - 10% da subpopulação maduro de células T CD4 + em ratinhos e humanos, com cerca de 1 - 2% dos Tregs que circulam no sangue periférico. Induzidas células estaminais pluripotentes (IPSCs) podem ser diferenciados em Tregs funcional, que tem um potencial para ser utilizados para terapias baseadas em células de doenças auto-imunes. Aqui, apresentamos um método para desenvolver antigénio (Ag) Tregs especï¿½icos de iPSCs (ou seja, IPSC-Tregs). O método baseia-se na incorporação do factor de transcrição Foxp3 e um receptor de células T específico de Ag-(TCR) em iPSCs e, em seguida, a diferenciação em células do estroma expressando Notch OP9 ligandos semelhante a delta (DL) e uma DL4. Seguindo diferenciação in vitro, o CPSP-Tregs expressam CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, e Ag-TCR específico e são capazes de responder à estimulação Ag.Este método tem sido aplicado com sucesso para a terapia à base de células de artrite auto-imune num modelo murino. A transferência adoptiva destes específica iPSC-Ag-Tregs em artrite induzida por Ag (AIA) -bearing ratinhos tem a capacidade para reduzir a inflamação das articulações e inchaço e para prevenir a perda óssea.

Como mostrado aqui, no dia 28, específico do Ag Tregs expressa substancialmente CD3 e TCR específico do Ag, dois marcadores de células T. A população de células CD3 + + TCRVβ5 expressa CD4. A maioria das células CD3 +, CD4 + TCRVβ5 + também expressa CD25, CD127, e CTLA-4, que são normalmente expressas em níveis elevados em que ocorre naturalmente (regs T nTregs) e em células T que expressam ectopicamente FoxP3. FoxP3 expre...

Apresentamos aqui um método para desenvolver células T reguladoras (Tregs) específicas de antígeno funcional (Ag) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) para imunoterapia de artrite autoimune em um modelo murino.

Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

O objetivo geral deste experimento é desenvolver um novo método para gerar células T reguladoras associadas à articulação inflamada derivadas de células-tronco, para imunoterapia contra a artrite autoimune. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no campo da autoimunidade sobre potenciais imunoterápicos para artrite autoimune. A principal vantagem desta técnica é que as células T reguladoras derivadas de células-tronco são tipadas e de um único tipo.Inicie diluindo as células alimentadoras de interesse até uma densidade mínima de um vezes 10 à quarta células por centímetro quadrado em meio OP9, e semeando um vezes 10 à sexta células alimentadoras por placa de 10 centímetros. Quando as células atingirem 80 a 90% de confluência, remova o meio dos cultivos e semeie 0,5 a um vezes 10 à quinta células-tronco pluripotentes induzidas transduzidas por retrovírus, ou IPSCs, em meio OP9 em cada placa. Cinco dias depois, aspire o meio e lave as células com 10 mililitros de PBS.Em seguida, desprenda as células com quatro mililitros de tripsina por placa, a 37 graus Celsius. Após 10 minutos, interrompa as reações com oito mililitros de meio IPSC e recolha as células para centrifugação. Resuspenda o pellet em 10 mililitros de meio IPSC fresco e replante as células em novas placas de 10 centímetros.Deixe as células de apoio aderirem à placa por 30 minutos no incubador de cultura celular. Em seguida, colete os iPSCs em suspensão e filtre as células transduzidas através de uma peneira de 70 micrômetros para contagem. Semee cinco vezes 10 à quinta potência de iPSCs em uma placa fresca de células de apoio com 80 a 90% de confluência, em meio OP9 suplementado com Murine-Flt3-Ligand, e retorne as culturas ao incubador.Após três dias, utilize uma pipeta de 10 mililitros para lavar a placa com o meio de cultura. Em seguida, adicione cinco mililitros de meio OP9 fresco à placa e lave suavemente quaisquer iPSCs semiaderentes com pipetagem cuidadosa e firme, sem perturbar a camada de células de suporte. Repita a lavagem com 10 mililitros de PBS para colher os últimos restos de células semiaderentes, coletando as lavagens de cada placa em um tubo cônico separado por cultura.Após centrifugar as células, ressuspenda os pellets em 10 mililitros de meio OP9 suplementado com Murine-Flt3-Ligand e IL-7 e filtre as células através de uma peneira de 70 mícrons. Semee uma cultura de IPSC por poço em uma placa de cultura de seis poços contendo monocamadas de células alimentadoras com 80 a 90% de confluência e retorne os co-cultivos ao incubador. A cada dois dias, substitua metade do meio por meio OP9 fresco suplementado com Murine-Flt3-Ligand e IL-7, e a cada quatro a seis dias, resemee as IPSCs em diferenciação em novas placas com uma nova camada de células alimentadoras, conforme necessário.Inicie destacando os cultivos celulares de interesse com tripsina e re-suspendendo cada tipo celular em 10 mililitros de meio fresco. Plaque cada cultura celular em uma nova placa de 10 centímetros e permita que as células de apoio adiram no incubador de cultura celular. Após 30 minutos, colete as iPSCs em suspensão e passe os cultivos individualmente por peneiras celulares de 70 micrômetros para remover os agregados celulares antes da contagem.Re-suspenda cada cultura numa concentração de 1,5 vezes 10 à sétima células por mililitro em PBS frio, filtrando novamente conforme necessário. Em seguida, coloque camundongos fêmeas C57BL/6 com quatro a seis semanas de idade, um por vez, em um dispositivo restritor para pequenos animais e transfira adotivamente 200 microlitros de um tipo de célula por camundongo na veia da cauda de cada animal. Utilize um paquímetro com mostrador analógico para medir o inchaço de ambos os joelhos e estabelecer a medida basal.Dez dias após a transferência celular, utilize uma seringa de um mililitro para injetar os camundongos com 100 microgramas de BSA metilada emulsionada em adjuvante completo de Freund na base da cauda de cada animal experimental. Dezessete dias após a transferência celular, induza artrite por injeção intra-articular de 20 microgramas de BSA metilada em 10 microlitros de PBS na articulação do joelho esquerdo e 20 microgramas de BSA metilada e 100 microgramas de ovoalbumina total em 10 microlitros de PBS na articulação do joelho direito de cada animal anestesiado submetido à transferência adotiva. Sete dias após a indução da artrite, meça novamente os joelhos para o cálculo do percentual de aumento no diâmetro articular e excise cirurgicamente as patelas.Fixe as articulações em formalina. Em seguida, após a descalcificação em EDTA, inclua os joelhos em parafina e obtenha cortes de quatro mícrons para coloração histoquímica e análise. No dia 28, as células T reguladoras antígeno-específicas expressam níveis consideráveis de CD3 e receptores de células T antígeno-específicos.A maioria dessas células também expressa CD25, CD127 e CTLA-4, moléculas que normalmente são expressas em níveis elevados em células T reguladoras naturais. De fato, a FoxP3 persiste em células T reguladoras derivadas de IPSC, mesmo após estimulação prolongada in vitro com o ligante Notch, conforme detectado por coloração intracelular. Além disso, essas células T reguladoras derivadas de IPSC, específicas para antígeno, produzem citocinas supressoras quando estimuladas com esplenócitos pulsados com antígeno in vitro, indicando um fenótipo supressor potencial para essas células.Células positivas para FoxP3 são observadas nos joelhos tratados com OVA, sem células positivas para FoxP3 aparentes nos joelhos que recebem IPSCs transduzidas com vetor controle. Além disso, são visualizadas muito mais células positivas para CD4, positivas para FoxP3 e positivas para TCR3 Beta 5 nos joelhos de camundongos que recebem IPSCs transduzidas com o vetor TCR-FoxP3 do que com o vetor FoxP3 isolado, sugerindo que células IPSC-Treg específicas para antígeno migram para o joelho com artrite induzida por antígeno após sua transferência adotiva para animais receptores. A transferência adotiva de células derivadas de IPSC também provoca uma diminuição substancial no inchaço inflamatório do joelho quando a OVA está presente, mas não tem efeito nos joelhos injetados com BSA metilado controle.Os efeitos positivos da redução do inchaço são ainda mais evidenciados por imagens de Micro-TC de alta resolução da perda óssea reduzida observada nos joelhos tratados com transferência celular em comparação com animais injetados apenas com MBSA controle. Uma vez reunidos, esses procedimentos detalhados podem ser concluídos em seis semanas se forem realizados corretamente. Ao tentar esta técnica, é importante lembrar de induzir a diferenciação incorporada dos iPSCs transduzidos com o antígeno TCR-FoxP3.Após este procedimento, diferentes compostos de citocinas supressoras também podem ser considerados para responder questões adicionais sobre a sobrevivência e qualidade das células T reguladoras iPSCs específicas para antígeno. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de terapia baseada em células explorarem o papel das células T reguladoras específicas para antígeno em doenças autoimunes. Não se esqueça de que trabalhar com fatores autólogos diretos pode ser extremamente perigoso e que precauções, como trabalhar em uma instalação básica de nível dois, devem sempre ser tomadas ao realizar um procedimento.Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Células T reguladoras: potencial terapêutico para tratar a rejeição de transplantes e Diabetes Tipo I

Nós descrevemos um método para a geração de células T de memória, regulamentar e ingénuos a partir de um único dador de sangue humano. Tregs polarizada pode ser então comparada com outros subconjuntos de uma variedade de aplicações genéticas e funcionais com homogeneidade genética, incluindo um ensaio de supressão também detalhados aqui.

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Este artigo descreve um método novo para gerar emigrantes Thymic de pilha-derivado induzido antígeno-específico do tumor (iTE) por um sistema Thymic tridimensional da cultura (3D). iTE é um subconjunto homogêneo de células T intimamente relacionadas com células T ingênuas com a capacidade de proliferação, formação de memória e supressão tumoral.

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Este artigo descreve um protocolo para a geração de pilhas CD8 T antígeno-específicas, e sua expansão in vitro, com o objetivo de render números elevados de pilhas de T funcionais para o uso in vitro e in vivo.

Geração de alta eficiência de células T Cytotoxic do rato preliminar antígeno-específico para o teste funcional em um modelo auto-imune do diabetes

Este artigo descreve um método para gerar células-tronco pluripotentes induzidas por antígeno funcional do tumor derivadas de CD8αβ+ únicas células T positivas usando o sistema de cocultura OP9/DLL1.

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Aqui apresentamos um protocolo para a supressão efetiva da replicação do vírus da hepatite B (HBV) em camundongos utilizando a transferência de células adotivas (ACT) de linfócitos T específicos de antígenos virais derivados de células-tronco (AG). Este procedimento pode ser adaptado para a imunoterapia baseada em ACT potencial da infecção por HBV.

Células-tronco derivadas virais AG-specific T da haste suprimir a replicação de HBV em ratos

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Geração de células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano

Aprenda a gerar células T regulatórias antígeno específicas a partir de células iPSC para imunoterapia contra artrite autoimune. Este método produz células uniformes e funcionais para aplicações clínicas.

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