Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade

O objetivo geral deste experimento é desenvolver um novo método para gerar células T reguladoras associadas à articulação inflamada derivadas de células-tronco, para imunoterapia contra a artrite autoimune. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no campo da autoimunidade sobre potenciais imunoterápicos para artrite autoimune. A principal vantagem desta técnica é que as células T reguladoras derivadas de células-tronco são tipadas e de um único tipo.

Inicie diluindo as células alimentadoras de interesse até uma densidade mínima de um vezes 10 à quarta células por centímetro quadrado em meio OP9, e semeando um vezes 10 à sexta células alimentadoras por placa de 10 centímetros. Quando as células atingirem 80 a 90% de confluência, remova o meio dos cultivos e semeie 0,5 a um vezes 10 à quinta células-tronco pluripotentes induzidas transduzidas por retrovírus, ou IPSCs, em meio OP9 em cada placa. Cinco dias depois, aspire o meio e lave as células com 10 mililitros de PBS.

Em seguida, desprenda as células com quatro mililitros de tripsina por placa, a 37 graus Celsius. Após 10 minutos, interrompa as reações com oito mililitros de meio IPSC e recolha as células para centrifugação. Resuspenda o pellet em 10 mililitros de meio IPSC fresco e replante as células em novas placas de 10 centímetros.

Deixe as células de apoio aderirem à placa por 30 minutos no incubador de cultura celular. Em seguida, colete os iPSCs em suspensão e filtre as células transduzidas através de uma peneira de 70 micrômetros para contagem. Semee cinco vezes 10 à quinta potência de iPSCs em uma placa fresca de células de apoio com 80 a 90% de confluência, em meio OP9 suplementado com Murine-Flt3-Ligand, e retorne as culturas ao incubador.

Após três dias, utilize uma pipeta de 10 mililitros para lavar a placa com o meio de cultura. Em seguida, adicione cinco mililitros de meio OP9 fresco à placa e lave suavemente quaisquer iPSCs semiaderentes com pipetagem cuidadosa e firme, sem perturbar a camada de células de suporte. Repita a lavagem com 10 mililitros de PBS para colher os últimos restos de células semiaderentes, coletando as lavagens de cada placa em um tubo cônico separado por cultura.

Após centrifugar as células, ressuspenda os pellets em 10 mililitros de meio OP9 suplementado com Murine-Flt3-Ligand e IL-7 e filtre as células através de uma peneira de 70 mícrons. Semee uma cultura de IPSC por poço em uma placa de cultura de seis poços contendo monocamadas de células alimentadoras com 80 a 90% de confluência e retorne os co-cultivos ao incubador. A cada dois dias, substitua metade do meio por meio OP9 fresco suplementado com Murine-Flt3-Ligand e IL-7, e a cada quatro a seis dias, resemee as IPSCs em diferenciação em novas placas com uma nova camada de células alimentadoras, conforme necessário.

Inicie destacando os cultivos celulares de interesse com tripsina e re-suspendendo cada tipo celular em 10 mililitros de meio fresco. Plaque cada cultura celular em uma nova placa de 10 centímetros e permita que as células de apoio adiram no incubador de cultura celular. Após 30 minutos, colete as iPSCs em suspensão e passe os cultivos individualmente por peneiras celulares de 70 micrômetros para remover os agregados celulares antes da contagem.

Re-suspenda cada cultura numa concentração de 1,5 vezes 10 à sétima células por mililitro em PBS frio, filtrando novamente conforme necessário. Em seguida, coloque camundongos fêmeas C57BL/6 com quatro a seis semanas de idade, um por vez, em um dispositivo restritor para pequenos animais e transfira adotivamente 200 microlitros de um tipo de célula por camundongo na veia da cauda de cada animal. Utilize um paquímetro com mostrador analógico para medir o inchaço de ambos os joelhos e estabelecer a medida basal.

Dez dias após a transferência celular, utilize uma seringa de um mililitro para injetar os camundongos com 100 microgramas de BSA metilada emulsionada em adjuvante completo de Freund na base da cauda de cada animal experimental. Dezessete dias após a transferência celular, induza artrite por injeção intra-articular de 20 microgramas de BSA metilada em 10 microlitros de PBS na articulação do joelho esquerdo e 20 microgramas de BSA metilada e 100 microgramas de ovoalbumina total em 10 microlitros de PBS na articulação do joelho direito de cada animal anestesiado submetido à transferência adotiva. Sete dias após a indução da artrite, meça novamente os joelhos para o cálculo do percentual de aumento no diâmetro articular e excise cirurgicamente as patelas.

Fixe as articulações em formalina. Em seguida, após a descalcificação em EDTA, inclua os joelhos em parafina e obtenha cortes de quatro mícrons para coloração histoquímica e análise. No dia 28, as células T reguladoras antígeno-específicas expressam níveis consideráveis de CD3 e receptores de células T antígeno-específicos.

A maioria dessas células também expressa CD25, CD127 e CTLA-4, moléculas que normalmente são expressas em níveis elevados em células T reguladoras naturais. De fato, a FoxP3 persiste em células T reguladoras derivadas de IPSC, mesmo após estimulação prolongada in vitro com o ligante Notch, conforme detectado por coloração intracelular. Além disso, essas células T reguladoras derivadas de IPSC, específicas para antígeno, produzem citocinas supressoras quando estimuladas com esplenócitos pulsados com antígeno in vitro, indicando um fenótipo supressor potencial para essas células.

Células positivas para FoxP3 são observadas nos joelhos tratados com OVA, sem células positivas para FoxP3 aparentes nos joelhos que recebem IPSCs transduzidas com vetor controle. Além disso, são visualizadas muito mais células positivas para CD4, positivas para FoxP3 e positivas para TCR3 Beta 5 nos joelhos de camundongos que recebem IPSCs transduzidas com o vetor TCR-FoxP3 do que com o vetor FoxP3 isolado, sugerindo que células IPSC-Treg específicas para antígeno migram para o joelho com artrite induzida por antígeno após sua transferência adotiva para animais receptores. A transferência adotiva de células derivadas de IPSC também provoca uma diminuição substancial no inchaço inflamatório do joelho quando a OVA está presente, mas não tem efeito nos joelhos injetados com BSA metilado controle.

Os efeitos positivos da redução do inchaço são ainda mais evidenciados por imagens de Micro-TC de alta resolução da perda óssea reduzida observada nos joelhos tratados com transferência celular em comparação com animais injetados apenas com MBSA controle. Uma vez reunidos, esses procedimentos detalhados podem ser concluídos em seis semanas se forem realizados corretamente. Ao tentar esta técnica, é importante lembrar de induzir a diferenciação incorporada dos iPSCs transduzidos com o antígeno TCR-FoxP3.

Após este procedimento, diferentes compostos de citocinas supressoras também podem ser considerados para responder questões adicionais sobre a sobrevivência e qualidade das células T reguladoras iPSCs específicas para antígeno. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de terapia baseada em células explorarem o papel das células T reguladoras específicas para antígeno em doenças autoimunes. Não se esqueça de que trabalhar com fatores autólogos diretos pode ser extremamente perigoso e que precauções, como trabalhar em uma instalação básica de nível dois, devem sempre ser tomadas ao realizar um procedimento.

Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.