Name: Uma abordagem fácil e eficiente para a produção de micelas reversível Disulfide Cross-linked (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprenda a sintetizar micelas reticuladas por dissulfeto para liberação direcionada de fármacos em terapia oncológica. Este método utiliza oxidação mediada por peróxido de hidrogênio para produção em larga escala.

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Os autores agradecem à Sra. Alisha Knudson pela ajuda editorial. Eles também gostariam de agradecer o apoio financeiro do NIH / NCI (3R01CA115483, para KSL), o Prêmio PRMRP do DoD (W81XWH-13-1-0490, para KSL), o NIH / NCI (1R01CA199668, para YL) e o NIH / NICHD (1R01HD086195, para YL).

declaração de ética: ratinhos nus atímicos fêmea (estirpe nu / nu), 6-8 semanas de idade, foram adquiridos e, em seguida, mantidos sob condições isentas de patogénios de acordo com as orientações da AAALAC e foram deixados a aclimatar durante pelo menos 4 dias antes de qualquer experimentos. Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais e de acordo com o protocolo nº 07-13119 e nº 09-15584, aprovado pelo Uso de Animais e Comité Consultivo Cuidados Administrativo na Universidade da Califórnia, Davis. 1. Síntese de TD PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 <ol><li> Em um balão de fundo redondo, dissolvem MeO-PEG 5 K-NH2 (2 g, 0,4 mmol) em 10-20 ml de dimetilformamida anidra (DMF) e arrefecer em gelo. </li><li> Em um copo de vidro, dissolver-se 3 equiv. de 1-hidroxi-6-cloro-benzotriazol (HOBt), 3 equiv. de N, N &#39;-diisopropilcarbodiimida (DIC), e 3 equiv. de (Fmoc) 2 Lys-OH em D anidroMF (10-15 ml). Agita-se durante 15-20 minutos numa placa de agitação magnética. </li><li> Adicionar a mistura ao balão de reacção que contém o MeO-PEG 5K -NH 2. Remover o banho de gelo e agita-se a mistura reaccional durante a noite à temperatura ambiente. </li><li> Confirmar a conclusão da reacção por cromatografia em camada fina (TLC), 16 e 17 de teste de Kaiser (uma cor amarela indica a ausência de livre NH2). Precipitar o produto polimérico 1 (MeO-PEG 5K-Lys (Fmoc-NH 2)), adicionando cerca de 200 ml de éter arrefecido com gelo para o frasco de reacção. Separa-se o polímero precipitado por centrifugação (6 min a 6000 xg e 4 ° C). <ol><li> Para executar TLC, manchar as amostras em placas de TLC de gel de sílica revestidas. Use diclorometano / metanol (9: 1) como a fase móvel. Observar pontos sob uma lâmpada UV depois de desenvolver as placas de TLC. Pode-se também utilizar reagente de coloração de ninidrina para visualizar locais de amina em uma placa quente. </li><li> para Kaiteste de Sor, coloque um pouco da amostra no tubo de vidro contendo o reagente de Kaiser. Aquecê-la a 100 ° C durante 5 min e olhar para a mudança de cor (se a cor da solução permanecer amarela, em seguida, a reacção está completa). </li></ol></li><li> Re-dissolve-se o produto no seio de DMF anidro (10-20 ml) e repetir a precipitação e centrifugação (ver passo 1.4). </li><li> Repetir o passo 1.5, e, em seguida lavar o precipitado de polímero três vezes com éter arrefecido com gelo. </li><li> Transferir o precipitado de polímero 1 a um balão de reacção limpo e ligar o balão a uma fonte de vácuo elevado para remover o éter residual. </li><li> Preparar e adicionar cerca de 20-30 mL de 20% (v / v) de 4-metilpiperidina no seio de DMF para um polímero intermediário. Agita-se até à dissolução completa. Executar a reacção durante 3 h. </li><li> Execute TLC 16 e teste de Kaiser (a cor azul confirma a presença de livre NH 2) 17 (veja o passo 1.4) para confirmar a completioN da reacção. Se a reacção está completa, proceder à precipitação éter, como mencionado para o produto de 1 (passos 1,4-1,6). </li><li> Seca-se o produto polimérico 2 (MeO-PEG 5K-Lys (NH2) 2) sob um vácuo. </li><li> Levar a cabo mais uma ronda de (Fmoc) 2-OH Lys-acoplamento no intermediário 2 (passos 1,1-1,7) para gerar o produto 3 (MeO-PEG 5K-Lys (Lys (NH-Fmoc) 2) 2). De proteger-(passos 1,8-1,10) os grupos Fmoc (4, MeO-PEG 5K-Lys (Lys (NH2) 2) 2) e pares (passos 1,1-1,7) o (Fmoc) Lis (Boc) -OH A gerar uma polilisina dendrítica da terceira geração (5, MeO-PEG 5k-Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (Boc)) 4) terminado com quatro grupos Boc e Fmoc sobre uma extremidade da cadeia PEG. </li><li> Transferir o polímero resultante intermediário 5 num frasco de reacção. em quantobalão de reacção eparate, preparar a 1: 1 (v / v) de ácido trifluoroacético (TFA) em diclorometano (DCM). Adicionar 15-20 mL de uma mistura 1: 1 de TFA / DCM (v / v) para o polímero intermediário 5. Agita-se a mistura até o polímero estar completamente dissolvido. Agita-se durante mais 3 horas. </li><li> Realizar TLC 16 e o teste de Kaiser (uma cor azul confirma a presença de NH livre 2) 17 (ver passo 1.4) para confirmar a conclusão da reacção. Se a reacção está completa, evapora-se a mistura de polímero-em-TFA / DCM com ar, até ser obtida uma solução viscosa. Proceder à precipitação éter, como mencionado para o produto 1 (passos 1,4-1,6). Seca-se o produto polimérico 6 (MeO-PEG 5k-Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (NH2)) 4) sob um vácuo. </li><li> Polímero de transferência intermédia 6 para um balão de reacção. Usar cerca de 40 ml de DMF anidro contendo 8 equiv. de N, N -diisopropylethylamine (DIEA) para dissolver o polímero intermediário 6. Em um copo de vidro, dissolver 12 equiv. de HOBt, 12 equiv. de DIC, e 12 equiv. de (Fmoc) Cys (Trt) -OH, em 20-25 ml de DMF anidro. Agitar durante 10-15 min, e, em seguida, adicionar a mistura de reacção para o balão de reacção contendo 6. Executar a reacção durante a noite. </li><li> Confirmar a conclusão da reacção com o TLC 16 e teste de Kaiser (veja o passo 1.4, uma cor amarela indica a ausência de livre NH 2) 17. Se a reacção está completa, proceder à precipitação éter, como mencionado para o produto de 1 (passo 1,4-1,6), para isolar o produto 7 (MeO-PEG-Lys-Lys 5K 2 - ((Fmoc) Lys - ((Fmoc) Cys (Trt))) 4. </li><li> Realizar-Fmoc de protecção no dia 7, como descrito na etapa 1.8, para se obter o produto 8 (PEG 5K-Lys-Lys 2 - (Lys (NH2) - (Cys (NH2) (Trt))) 4). Casal (Fmoc) PEG 2 -Suc-OH ( &quot;Ebes&quot; ligante, 24 equiv.) Num intermediário de acoplamento utilizando o procedimento descrito acima para o polímero HOBt / DIC-mediada para se obter o intermediário 9 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys-Lys 2 4 - (Cys (Trt) ) 4 (Ebes (NH-Fmoc)) 8). </li><li> Realizar mais uma ronda de Fmoc desprotecção (passos 1,6-1,8) para obter intermediário 10 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys-Lys 2 4 - (Cys (Trt)) 4 (Ebes (NH2)) 8). </li><li> Transferir o polímero intermediário 10 em um frasco de reacção e adicionar DMF anidro (cerca de 30-40 mL) para o dissolver. Num outro balão de reacção, dissolve-se 24 equiv. de CAOSu (preparado de acordo com o procedimento publicado anteriormente) em DMF anidro (20-30 ml) 18. Adicionar 48 equiv. de N, N-diisopropiletilamina e deixou-agita-se durante 10-15 min. Transferir o conteúdo para o balão de reacção que contém 10 e deixe correr a reacção overnight. </li><li> Confirmar a conclusão da reacção por TLC com 16 e o teste de Kaiser (ver passo 1.4; uma cor amarela indica a ausência de livre NH2) 17. Se a reacção está completa, proceder à precipitação éter, como mencionado para o produto de 1 (passos 1,4-1,6) para isolar o produto 11 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys-Lys 2 4 - (Cys (Trt)) 4 -Ebes 8 -CA 8). Dialisar-o em água desionizada e liofilizar a amostra para se obter um pó branco. </li><li> Colocar o polímero intermediário 11 em um frasco de reacção. Preparar e adiciona-se 20 ml de TFA / 1,2-etanoditiol (EDT) / trietilsilano (TIS) / H 2 O (94 / 2,5 / 1 / 2,5, v / v) de mistura na solução de polímero. Agita-se a mistura até à dissolução completa. Executar a mistura reaccional durante 4 h. Confirmar a conclusão da reacção por TLC 16. </li><li> Sob o capô fume, soprando ar para dentro do polímero TFA / EDT / TIS / H 2O mistura até a solução se tornar viscosa. Proceda à precipitação éter, como mencionado para o produto de 1 (passos 1,4-1,6), para isolar o produto final, de 12 (PEG 4 5K Cys -Ebes 8 -CA 8). Dissolve-o em acetonitrilo e liofilizar-lo para se obter um pó branco. </li></ol> 2. Preparação de micelas de PTX-carregados <ol><li> Prepara-se uma PTX-carregado PEG 5K Cys -Ebes 4 8 8 -CA micela utilizando o método de evaporação do padrão. <ol><li> Dissolve-se 20 mg de TD com uma quantidade diferente de PTX (1-9 mg) em 1 ml de clorofórmio (CHCl 3). Remover o solvente utilizando um evaporador rotativo para se obter um filme de polímero homogéneo, seco. Reconstituir o filme com 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) por vórtice, seguido de sonicação durante 30 min a 40 kHz, se necessário, para permitir a formação de micelas carregadas com fármaco. </li><li> Adicionar 6 ul de 3% (w / w) de H 2 O 2 (1 equiv. A Peee os grupos tiol) para oxidar os grupos tiol na TD. Usar a solução micelar para caracterização adicional uma vez que o nível de grupos tiol livres permanece a baixos valores de constantes, como indicado pelo teste 19 de Ellman. </li><li> Filtra-se a solução com um filtro de 0,22 uM para esterilizar a amostra. Analisar a quantidade de fármaco carregada nas micelas em um 20 sistema de HPLC depois de libertar a droga a partir das micelas através da adição de 9 vezes de acetonitrilo e realizando 10 minutos de sonicação. Usar uma coluna C18 para HPLC com acetonitrilo / água como fase móvel. </li><li> Calcula-se a carga de fármaco de acordo com a curva de calibração entre os valores de área de HPLC e as concentrações da droga de referência 11. NOTA: A eficiência de carga é definido como a proporção de fármaco carregados nas micelas para o conteúdo de medicamento inicial. </li></ol></li></ol> 3. Caracterizações de micelas <ol><li> Medir a distribuição do tamanho e dimensão da micelles com um instrumento de espalhamento dinâmico de luz (DLS) 29. Efectuar as medições à temperatura ambiente e manter a concentração de micelas a 1 mg / ml. NOTA: Para realizar a análise de tamanho de partícula, use PBS como em branco, e depois gravar o tamanho de partícula para amostras reais. Tome as leituras em triplicado para amostras, e depois calcular a média das leituras. </li><li> Use espectros de fluorescência para medir a concentração micelar crítica (CMC) de PEG-Cys 5K 4 -Ebes 8 -CA 8, antes e depois de reticulação com pireno como sonda fluorescente hidrofóbica, tal como descrito anteriormente 13,21. NOTA: Tipicamente, a concentração de micelas varia de 5 x 10 -7 a 5 x 10 -4 M. </li></ol> 4. Estabilidade de micelas de SDS com ou sem agentes redutores <ol><li> Preparar soluções stock de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) a solução (7,5 mg / ml) e dissulfureto de micelas reticuladas (1,5 mg / ml) em PBS. Em seguida, ucantar as soluções de reserva, fazer uma mistura de solução em que a concentração final de SDS é de 2,5 mg / ml e a concentração de micela é de 1,0 mg / ml. </li><li> Medir a distribuição do tamanho e tamanho (tal como mencionado no passo 3.1) das soluções micelares, a intervalos de tempo predeterminados, com ou sem a presença de 10 mM de glutationa (GSH). </li></ol> Ensaio 5. A hemólise <ol><li> Avaliar o potencial hemolítico de micelas PTX-carregado, não-reticulada (PTX-NCMS) preparado de acordo com o procedimento previamente publicado em 11 e micelas reticuladas PTX-carregados (PTX-DCMs) utilizando sangue citratado fresco de ratinhos nus recolhido a partir da véu cauda. <ol><li> Recolher as células vermelhas do sangue por centrifugação da amostra de sangue (1,0 ml) a 1000 xg durante 10 min, lavagem três vezes com PBS, e em seguida, re-suspender as pelotas celulares com PBS a uma concentração final de 2%. </li></ol></li><li> Misturar 200 ul de suspensão de eritrócitos com concentrações diferentes (0,2 e 1,0mg / ml) de PTX-NCMs e PTX-DCMs, respectivamente, e incubar durante 4 horas a 37 ° C num agitador de incubador. </li><li> Centrifugar as misturas de micelas-eritrócitos a 3000 xg durante 5 min. Transferir 100 ul do sobrenadante de todas as amostras para uma placa de 96 poços. Medir a absorvância da hemoglobina livre no sobrenadante a 540 nm usando um leitor de microplacas. NOTA: As hemácias incubadas com Triton-100 (2%) e PBS são para ser utilizados como os controlos positivos e negativos, respectivamente. A hemólise por cento das hemácias é calculada com a seguinte fórmula: = hemólise de RBC (amostra OD - OD de controlo negativo) / (OD controlo positivo - controlo negativo OD) x 100%. </li></ol>

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<li>Gabizon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+nanomedicines%3A+closing+the+translational+gap%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cancer nanomedicines: closing the translational gap.</a> Lancet. 384, 2175-2176 (2014).</li>
<li>Nanotrac Nanotechnology Particle Size Measurement Solutions. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.vahitech.com/Assets/Nano(US)Web.pdf">http://www.vahitech.com/Assets/Nano(US)Web.pdf</a> (2006).</li>
</ol>

Y. Li e K.S.L. são os inventores de uma patente pendente sobre sistemas de micelas reticuladas reversivelmente (pedido de patente dos EUA 61/485.774). K.S.L. é o cientista fundador da LamnoTherapeutics Inc., que planeja desenvolver os nanoterapêuticos descritos no manuscrito. Os demais autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Vários nanopartículas têm sido investigados por seu uso potencial na entrega da droga. doxorrubicina lipossomal e paclitaxel (PTX) -loaded de albumina de soro de nano-agregados humanos estão entre os Nanotherapeutics aprovados pela FDA para o tratamento do cancro. No entanto, embora clinicamente eficaz, ambos estes Nanotherapeutics são relativamente &quot;grande&quot; em tamanho, e que tendem a acumular-se no fígado e pulmões. As micelas poliméricas com tamanhos de partículas relativamente menores e capacidades de carga...

A nanotecnologia é um campo de fast-emergente que tem beneficiado um número de áreas biomédicas 1. Nanopartículas fornecer oportunidades para desenhar e ajustar as propriedades que não são viáveis ​​com outros tipos de agentes terapêuticos convencionais. Nano-transportadores aumentar a estabilidade dos medicamentos contra a biodegradação, prolongar o tempo de circulação da droga, superar problemas de solubilidade de drogas, e podem ser afinadas para a entrega de drogas específicas e para os agentes de imagem co-entrega de 1,2. sistemas de entrega baseados em nanopartículas promissoras em imagiologia e tratamento do câncer. Vasculaturas tumorais são permeável a macromoléculas e podem levar a uma acumulação preferencial de nanopartículas que circula nos locais de tumores por meio da permeabilidade aumentada e retenção (EPR) 3 efeito. Entre os vários nano-transportadores (por exemplo, lipos somas, hidrogeles, e micelas poliméricas) que estão a ser activamente prosseguidas como transportadores para drogas anti-cancro, micelas poliméricas têm ganho grande popularidade sobre o the última década 4,5. As micelas poliméricas são um sistema termodinâmico que, por administração intravenosa, potencialmente, pode ser diluído abaixo da concentração crítica de micelas (CMC), levando a sua dissociação em unimers. estratégias de cross-linking têm sido empregadas para minimizar a dissociação micelar em unimers. No entanto, as micelas excessivamente estabilizadas podem impedir o fármaco de libertação de nos locais alvo, reduzindo assim a eficácia terapêutica global. Várias abordagens químicas foram exploradas para fazer a ligação cruzada degradável em resposta ao redox ou a estímulos externos, tais como ligações dissulfureto redutível 6,7 e pH 8 clivável ou éster hidrolisável ligações 9,10. Descrevemos previamente a concepção e síntese de nanopartículas micelares que consiste em ácido eólico dendrítica (CA) e polietileno linear de blocos de glicol (PEG), copolímeros de referido como telodendrimers (TD) 15/11 </sup&gt;. Estes TDS são representados como PEG nK -CAy (onde n = peso molecular em quilodaltons (k), y = número de ácido eólico (CA) unidades). Eles são caracterizados pela sua pequena dimensão, longa vida de prateleira, e alta eficiência na drogas encapsulando tal como paclitaxel (PTX) e doxorrubicina (DOX) no núcleo hidrofóbico. Os blocos de construção da TD, tais como PEG, lisina, e CA, são biocompatíveis, e a presença de uma coroa de PEG pode conferir um carácter nanopartícula &quot;stealth&quot;, evitando a absorção não específica de nanopartículas micelares pelos sistemas reticuloendoteliais. polímeros lineares-dendrítica tiolada pode ser facilmente gerado através da introdução de cisteínas para a coluna vertebral de oligo-lisina dendrítica da nossa DT padrão. Este artigo apresenta um protocolo fácil para a produção de um sistema de entrega de droga micelar reversivelmente reticulado através da introdução de ligações cruzadas dissulfureto dentro do núcleo hidrofóbico de DT (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>MeO-PEG5K-NH2</td><td>Rapp Polymere</td><td>125000-2</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Fmoc)-OH</td><td>Aaptec</td><td>AFK107</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Anaspec</td><td>AS-20132</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Aapptec</td><td>AAC105</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilformamida</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td><td></td></tr><tr><td>Éter etílico</td><td>Fisher Scientific</td><td>E134-20</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diisopropiletilamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td>Corrosivo, manuseie com cuidado</td></tr><tr><td>4-metil piperidina</td><td>Alfa-Aesar</td><td>L-02709</td><td></td></tr><tr><td>Ligante Ebes</td><td>Anaspec</td><td>AS-61924</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cólico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1129</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>02390</td><td>Punho interior da hotte. Luvas de alvejante após o uso.</td></tr><tr><td>Triisopropilsilano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>233781</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio (anidro)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>Solução de peróxido de hidrogênio 30%</td> <td>Aaron Industries</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>HoBt-Cl</td><td>Aaptec</td><td>CXZ096</td><td></td></tr><tr><td>DIC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125407</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos fêmeas atímicos nus (cepa Nu/Nu), 6&ndash; 8 semanas de idade</td><td>Harlan (Livermore, CA)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uma abordagem fácil e eficiente para a produção de micelas reversível disulfide cross-linked

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicina é uma forma emergente da terapia que utiliza as propriedades únicas de partículas que são nanómetros em escala para aplicação biomédica. Melhorar a entrega da droga para maximizar os resultados terapêuticos e para reduzir os efeitos colaterais associados ao fármaco são alguns dos pilares da atual nanomedicina. As nanopartículas, em particular, têm encontrado uma ampla aplicação no tratamento do câncer. Nanopartículas que oferecem um alto grau de flexibilidade no desenho, aplicação e produção com base no microambiente do tumor são projetados para ser mais eficaz com tradução rápida para a prática clínica. O micelar nano-veículo polimérico é uma escolha popular para aplicações de entrega de drogas. Neste artigo, descreve-se um protocolo simples e eficaz para sintetizar, micelas reticuladas de dissulfureto carregadas com fármaco com base na auto-montagem de um copolímero anfifílico bem definida linear-dendrítica (telodendrimer, TD). TD é composta de polietileno glycol (PEG) como o segmento hidrofílico e um agrupamento de ácido eólico tiolado como a porção hidrofóbica por passos em anexo para formação de núcleo a um PEG terminado por amina usando química de péptidos à base de solução. drogas de quimioterapia, tais como paclitaxel (PTX), pode ser carregada utilizando um processo de evaporação de solvente padrão. O 2 a oxidação mediada foi previamente utilizado para formar dissulfeto ligações cruzadas intra-micelares de grupos tiol livres no TDs. No entanto, a reacção foi lento e não é viável para produção em larga escala. Recentemente, um método de oxidação de H 2 O 2 foi explorada como mediada por uma abordagem mais viável e eficiente, e que era 96 vezes mais rápido do que o método previamente relatado. Utilizando esta abordagem, 50 g de PTX-carregadas, nanopartículas reticuladas de dissulfureto ter sido produzido com sucesso, com distribuição de tamanho de partículas estreita e alta eficiência de carregamento de drogas. A estabilidade da solução de micelas resultante é analisada utilizando condições perturbadoras tais como co-incubação wom um dodecil sulfato de detergente, de sódio, com ou sem um agente redutor. As micelas, reticuladas de dissulfureto carregadas com fármaco demonstrou uma actividade menos hemolítica quando comparada com os seus homólogos não-reticulados.

Preparação e caracterização de, micelas Disulfide Cross-linked carregado com a droga Anfifílicos de polímero de PEG-Cys 5K 4 -Ebes -CA 8 8 é um polímero dendrítico, capaz de formar um sistema micelar dissulfureto reticulado para a entrega de drogas do cancro. Estruturalmente, que é definido como um oligómero dendrítica de ácidos eólicos (domínio hidrofóbico) ligadas a uma extremidade da molécula de ...

Para fornecer medicamentos contra o câncer a locais de tumor com alta especificidade e efeitos colaterais reduzidos, são necessários novos métodos baseados em nanopartículas. Aqui, descrevemos micelas reticuladas de dissulfeto que podem ser facilmente preparadas por oxidação mediada por peróxido de hidrogênio e são capazes de se dissociar eficientemente sob um ambiente tumoral redutor para liberar cargas úteis.

Uma abordagem fácil e eficiente para a produção de micelas reversível Disulfide Cross-linked

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um protocolo simples e eficaz para sintetizar micelas reticuladas de dissulfeto carregadas de drogas para administração direcionada de drogas. Este método pode ajudar a responder a perguntas no campo da nanomedicina. Por exemplo, como produzir efetivamente nanoformulações estáveis.A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite sintetizar facilmente micelas reticuladas de dissulfeto em larga escala, o que é extremamente desejável para estudos clínicos em pacientes. Para iniciar este procedimento, adicione dois gramas de monometil terminado polietilenoglicol monoamina a um balão de fundo redondo. Adicione dez mililitros de DMF anidro para dissolvê-lo.Frio no gelo. Adicionar três equivalentes de hidroxibenzotriazol, três equivalentes de CID e três equivalentes de lisina protegida com di-eth-moc a um balão de fundo redondo. Em seguida, adicione dez mililitros de DMF anidro.Mexa a mistura por 20 minutos em uma placa magnética. Em seguida, adicione a mistura ao balão de fundo redondo contendo polietilenoglicol com terminação monometila. Retirar o balão de fundo redondo do banho de gelo e agitar durante a noite à temperatura ambient

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um método para analisar a acessibilidade do solvente do grupo tiol de resíduos de cisteína...

Análise da acessibilidade de solvente de resíduos de cisteína em<em&gt; Milho rayado fino vírus</em&gt; Partículas semelhantes a vírus produzidas em<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Plantas e cross-linking de peptídeos para VLP

Estudos biofísicos e bioquímicos das interações entre os domínios membrana-proteína embutidos enfrentar muitos desafios técnicos, a primeira das quais é a obtenção de material de estudo adequado. Este artigo descreve um protocolo para a produção e purificação de complexos estabilizados por dissulfureto transmembranares peptídicas que são adequadas para análise estrutural por ressonância solução magnética nuclear (RMN) e de outras aplicações analíticas.

Complexos de produção de transmembrana Disulfide-estabilizados Peptídicos para estudos estruturais

Uma técnica simples, robusta e escalável para funcionalizar e auto-montar macroscópicas filmes monocamada de nanopartículas-ligante em substratos sem modelo descrito neste protocolo.

Uma técnica para funcionalizar e auto-montar macroscópicas Nanopartículas-ligante monocamada Films em substratos sem Modelo

Este artigo descreve um processo de produção de nanopartículas poliméricas automontadas usando polimerização por dispersão mediada por luz visível. O uso de luz visível de baixa energia para controlar a polimerização permite a formação reprodutível de micelas semelhantes a vermes automontadas com alto teor de sólidos.

Síntese Facile de micelas Worm-like por luz visível Mediated Dispersão Polimerização Usando Photoredox Catalisador

O presente trabalho descreve um método para fabricar micélica nanocristais, uma classe emergente grande de nanobiomaterials. Este método combina electrospray de cima para baixo, de baixo para cima, auto-montagem e controle de estrutura de base solvente. O método de fabricação é em grande parte contínuo, podemos produzir produtos de alta qualidade e possui um meio barato de controle de estrutura.

Fabricação de nanocristais micélica esférico e em forma de verme, combinando Electrospray, auto-montagem e controle de estrutura de base solvente

Aqui nós apresentamos dois protocolos ultra rápidos para reconstituição das proteínas de membrana em fusogenic proteoliposomes e fusão de tais proteoliposomes com bilayers do lipid alvo para detergente livre entrega destas proteínas de membrana para a BICAMADA postfusion. A combinação dessas abordagens permite montagem rápida e facilmente controlada de sistemas complexos de membrana multi-componentes.

Livre de detergente ultra reconstituição das proteínas de membrana em lípidos Bilayers usando Fusogenic Proteoliposomes complementares carregada.

Apresentamos um protocolo para a construção de vinil/Tioéter peptídeos helicoidais sulfeto-amarrados usando foto-induzido thiol-ene/thiol-ino hydrothiolation.

Construindo Tioéter/sulfeto de vinil-amarrados induzida por peptídeos helicoidais Via foto Thiol-ene/ino Hydrothiolation

Aqui, apresentamos uma síntese de um pote, transição-metal-free de tióis e tioésteres de halogenetos aromáticos e thiomethoxide de sódio, seguido de preparação de monocristais de uma rede de metal-dithiolene usando espécies tiol gerados in situ desde o mais estável e tractable Tioéster.

Síntese de um Bloco de Construção Tiol para a Cristalização de uma Estrutura Semicondutora de Metal-Enxofre com Geometria Giroidal

As ligações de dissulfeto têm sido conhecidas por muito tempo para estabilizar a estrutura de muitas proteínas. Um método simples para analisar complexos multimérica estabilizados por estas ligações é através da análise de SDS-PAGE não-reduzindo. Aqui, este método é ilustrado analisando-se a isoforma nuclear de dUTPase da linha de células de osteossarcoma óssea humana U-2 OS.

Combinando análise de SDS-PAGE não redutora e reticulação química para detectar complexos multiméricos estabilizados por ligações de dissulfeto em células de mamíferos na cultura

O protocolo apresenta os parâmetros otimizados para a preparação de liposomos termosensíveis usando o dispositivo microfluido de microfluidos de micromixer herringbone escalonado. Isso também permite o coencapsulamento de doxorubicina e verde indocianina nos liposomos e a liberação fototérmica de doxorubicina para liberação controlada/desencadeada de drogas.

Produção microfluida de liposomos sensíveis à temperatura contendo lisolipóides

Aprenda a sintetizar micelas reticuladas por dissulfeto para liberação direcionada de fármacos em terapia oncológica. Este método utiliza oxidação mediada por peróxido de hidrogênio para produção em larga escala.

Uma abordagem fácil e eficiente para a produção de micelas reversível Disulfide Cross-linked

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