Uma abordagem fácil e eficiente para a produção de micelas reversível Disulfide Cross-linked

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um protocolo simples e eficaz para sintetizar micelas reticuladas de dissulfeto carregadas de drogas para administração direcionada de drogas. Este método pode ajudar a responder a perguntas no campo da nanomedicina. Por exemplo, como produzir efetivamente nanoformulações estáveis.

A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite sintetizar facilmente micelas reticuladas de dissulfeto em larga escala, o que é extremamente desejável para estudos clínicos em pacientes. Para iniciar este procedimento, adicione dois gramas de monometil terminado polietilenoglicol monoamina a um balão de fundo redondo. Adicione dez mililitros de DMF anidro para dissolvê-lo.

Frio no gelo. Adicionar três equivalentes de hidroxibenzotriazol, três equivalentes de CID e três equivalentes de lisina protegida com di-eth-moc a um balão de fundo redondo. Em seguida, adicione dez mililitros de DMF anidro.

Mexa a mistura por 20 minutos em uma placa magnética. Em seguida, adicione a mistura ao balão de fundo redondo contendo polietilenoglicol com terminação monometila. Retirar o balão de fundo redondo do banho de gelo e agitar durante a noite à temperatura ambiente.

Quando a agitação estiver concluída, confirme a conclusão da reação conforme detalhado no protocolo de texto. Adicione 200 mililitros de éter gelado ao balão de reação. Centrifugar a 6 000 x g durante seis minutos a quatro graus Celsius Para separar o polímero precipitado.

Repita o processo de precipitação e centrifugação duas vezes, dissolvendo novamente o produto em 10 mililitros de DMF cada vez antes da precipitação. Em seguida, lave o polímero três vezes com éter gelado. Conecte o tubo a uma fonte de alto vácuo para remover o éter residual.

Depois disso, adicione 20 mililitros de 20%4-metilpiperidina em DMF ao polímero. Mexa até que a dissolução esteja completa. Permita que a reação se divirta por três horas.

Depois de confirmar a conclusão da reação, secar o produto polimérico. Agora, o polímero intermediário número dois sob vácuo e, em seguida, execute etapas adicionais de síntese de polímero, conforme descrito no protocolo de texto. Uma vez produzido o polímero intermediário número 10, transfira-o para um balão de reação.

Adicione 30 mililitros de DMF anidro. Em um novo frasco, dissolver 24 equivalentes de ácido cólico ativado em 20 mililitros de DMF. Em seguida, adicione 48 equivalentes de N, N-Diisopropiletilamina.

Mexa por 10 minutos. Depois de completa a agitação, transferir a mistura para o balão de reacção contendo o polímero intermédio número 10. Permita que a reação seja executada durante a noite.

No dia seguinte, confirme a conclusão da reação e precipite o polímero intermediário número 11, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, disque o polímero intermediário em água deionizada. Liofilize a amostra produzindo um pó branco.

Após a preparação da micela, dissolva 20 miligramas de telodendrímero e cinco miligramas de PTX em um mililitro de clorofórmio. Remover o solvente com um evaporador rotativo para obter uma película homogénea de polímero seco. Reconstitua o filme com um mililitro de PBS por vórtice.

Em seguida, sonicar por 30 minutos a 40 kilohertz. Adicione 3% de peróxido de hidrogênio para oxidar os grupos tióis no telodendrimmer. Execute etapas adicionais de preparação e verificação, conforme descrito no protocolo de texto.

Após a conclusão da preparação da micela, meça o tamanho e a distribuição de tamanho das micelas com um instrumento dinâmico de dispersão de luz. Efectuar as medições à temperatura ambiente e manter a concentração micelar a um miligrama por mililitro. Em seguida, prepare uma solução estoque de 7,5 miligramas por mililitro de dodecil sulfato de sódio em PBS.

Em seguida, prepare uma solução estoque de 1,5 miligrama por mililitro de micelas reticuladas de dissulfeto em PBS. Usando essas soluções de estoque, crie uma mistura na qual a concentração final de SDS seja de 2,5 miligramas por mililitro. E a concentração de micelas é de 1,0 miligramas por mililitro.

Carregar a amostra e medir a dimensão e a distribuição da dimensão da solução micelar em intervalos de dois minutos. Depois de coletar sangue citrato fresco de camundongos nus, centrifugue uma amostra de sangue de um mililitro a 1.000 x g por 10 minutos para coletar glóbulos vermelhos. Lave-os três vezes com PBS e, em seguida, ressuspenda o pellet celular com PBS até uma concentração final de 2% Misture 200 microlitros de suspensão de eritrócitos com uma solução de 1,0 miligrama por mililitro de PTX NCMs.

Em seguida, misture 200 microlitros de suspensão de eritrócitos com uma solução de 1,0 miligrama por mililitro de DCMs PTX. Incube essas misturas em um agitador de incubadora por quatro horas a 37 graus Celsius. Após a incubação completa, centrifugar as misturas a 3 000 x g durante cinco minutos.

Transfira 100 microlitros do sobrenadante de cada amostra para uma placa de 96 poços. Depois disso, use um leitor de microplacas para medir a absorbância da hemoglobina livre a 540 nanômetros. Conforme medido pelo Teste de Ellman, a taxa de conversão de grupos tióis livres para ligações dissulfeto atingiu 85% após 48 horas de oxidação mediada por oxigênio.

Aqui, um método de oxidação mediada por peróxido de hidrogênio é empregado como um método alternativo. A taxa de conversão chega a 88% em 30 minutos. O que é 96 vezes mais rápido do que a abordagem mediada por oxigênio.

Usando essa abordagem mais eficiente, mais de 50 gramas de nanopartículas foram produzidas com um tamanho de partícula medido de 27 nanômetros com uma distribuição de tamanho estreita. A estabilidade de micelas reticuladas com PTX também é investigada em condições severas de ruptura de micelas. O tamanho das partículas das micelas permaneceu estável ao longo do tempo, indicando que elas permaneceram intactas.

Após a introdução de GSH em uma concentração intracelular, o tamanho das micelas reticuladas de dissulfeto carregadas com drogas permanece intacto por 30 minutos e depois diminui abruptamente para um nanômetro. Isso significa a redução de um número crítico de ligações dissulfeto, um pré-requisito para a rápida dissociação das micelas. Os resultados representativos da atividade hemolítica das micelas carregadas com PTX são mostrados aqui.

Os PTX NCMs têm uma contagem de lise de glóbulos vermelhos dependente da dose. No entanto, os DCMs PTX que possuem reticulação dissulfeto não mostram atividades hemolíticas observáveis. Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em outra se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de adicionar uma quantidade igual de peróxido de hidrogênio a 3% para a formação de dissulfeto. Após este procedimento, o ensaio de hemólise pode ser realizado para avaliar a compatibilidade sanguínea das micelas reticuladas com dissulfeto. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como sintetizar efetivamente micelas reticuladas de dissulfeto carregadas de drogas.

Não se esqueça de que alguns desses produtos químicos podem ser extremamente perigosos e precauções como o uso de equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.