A fluorescência ensaio simples para a quantificação de Canine neutrófilos Extracelular Armadilha lançamento
21 de novembro de 2016
armadilhas extracelulares dos neutrófilos (NETS) são redes de ADN, histonas e proteínas de neutrófilos. Embora um componente da resposta imunitária inata, redes estão implicados na autoimunidade e trombose. Este protocolo descreve um método simples para o isolamento dos neutrófilos canino e quantificação de redes que utilizam um ensaio de microplaca de fluorescência.
O objetivo geral deste experimento é isolar neutrófilos quiescentes e medir a liberação de seu DNA em resposta a agonistas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na imunologia e na medicina veterinária, como, por exemplo, qual é a resposta dos neutrófilos a diversos agonistas da indução de armadilhas extracelulares ou da morte celular? A principal vantagem desta técnica é que ela permite o rastreamento rápido de diversos agonistas e inibidores da formação de armadilhas extracelulares neutrófilas.
Inicie inserindo uma agulha tipo borboleta de 21 calibres na veia cefálica de um cão doador saudável, em seguida acople uma seringa de três mililitros e obtenha três amostras de sangue de três mililitros, transferindo imediatamente as amostras para tubos de sangue contendo EDTA sem tampa. Tenha cuidado para que a venopunção seja indolor e para que o fluxo sanguíneo seja adequado, pois uma coleta inadequada resultará em baixo rendimento de neutrófilos. Após encher cada tubo, inverta-os para garantir uma mistura adequada entre o sangue e o anticoagulante.
Reúna o sangue em um tubo cônico de 50 mililitros. Misture as amostras com um volume igual de Dextran 500 a 3%, estéril e à temperatura ambiente, por inversão suave e deixe o tubo na posição vertical por 18 a 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, transfira a camada superior de cor amarelada para um tubo novo até que não possa mais ser coletada sem contaminação pela camada vermelha inferior.
Centrifugue a camada superior. Descarte o sobrenadante, ressuspendendo manualmente o pellet em 10 mililitros de PBS estéril à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 10 mililitros de uma solução de separação celular de polissucrose em diatrizoato de sódio à temperatura ambiente a um tubo cônico de 50 mililitros.
Coloque cuidadosamente as células sobre a solução de separação. Separe as células por centrifugação. Descarte as três camadas superiores de plasma, plaquetas, células mononucleares e gradiente de densidade.
Lise quaisquer eritrócitos remanescentes com 10 mililitros de água à temperatura ambiente. Após 30 segundos, adicione 10 mililitros de cloreto de sódio estéril a 1,8% à temperatura ambiente para restabelecer a tonicidade. Misture as células por inversão suave.
Agora, colete as células por centrifugação. Resuspenda suavemente o pellet branco em 10 mililitros de PBS estéril. Após a contagem, centrifugue as células novamente e resuspenda o pellet em uma concentração de cinco vezes 10 à sexta células por mililitro em PBS estéril à temperatura ambiente.
Quando apropriado, seque ao ar um pequeno volume de células sobre uma lâmina de vidro, seguido por coloração com um kit de fixação e coloração rápida, conforme instruções do fabricante. Se o isolamento de neutrófilos tiver sido bem-sucedido, pelo menos 95% das células nucleadas devem ser granulócitos, com mínima contaminação por eritrócitos, conforme observado por microscopia de luz. Imediatamente após o isolamento dos neutrófilos, passe a suspensão celular através de um filtro estéril de 70 micrômetros e adicione cinco vezes 10 à quarta células aos poços de teste de uma placa de 96 poços contendo meio de cultura, para uma incubação de 30 minutos a 39 graus Celsius e 4% de dióxido de carbono.
Quando as células tiverem aderido, adicione até um volume final de 100-200 microlitros do agonista de interesse em RPMI sem vermelho de fenol e suplementado com FCS inativado pelo calor às poças de teste, bem como a duas poças em branco contendo apenas PBS. Em seguida, adicione um corante de ácido nucleico impermeável às células adequado e retorne a placa ao incubador. Após o período de incubação apropriado, meça a fluorescência em um leitor de microplacas.
Uma estimulação de uma hora de neutrófilos caninos com fator ativador de plaquetas resulta em um aumento médio de quatro vezes na fluorescência em comparação com células controle não estimuladas. No entanto, PMA é um agonista mais lento que não demonstra aumento da fluorescência de neutrófilos antes de duas horas de ativação, mas que eventualmente produz um aumento semelhante ao longo do tempo. A fluorescência do corante de ácidos nucleicos não é específica para a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos, pois também ocorrerá se houver morte celular por outros mecanismos ou se os reagentes estiverem contaminados com DNA.
Por exemplo, neste experimento representativo, uma preparação comercial de LPS produziu fluorescência muito alta na ausência de neutrófilos, presumivelmente devido à contaminação com DNA bacteriano. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em aproximadamente seis horas, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manipular os neutrófilos com cuidado.
Não vortexar as células e remover os sobrenatantes com pipeta, em vez de derramá-los. Após este procedimento, outros métodos, como microscopia de imunofluorescência, podem ser realizados para confirmar que o DNA liberado está correlacionado à NETose. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de hematologia explorarem a interação do DNA liberado com a coagulação e o efeito de novos agonistas de NET, incluindo plasma de pacientes.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar neutrófilos caninos e medir sua resposta a agonistas.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este protocolo descreve um método para isolar neutrófilos quiescentes do sangue canino e quantificar a formação de suas armadilhas extracelulares. As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) desempenham um papel significativo na resposta imune inata e estão associadas a várias patologias.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Medicina Veterinária
Antecedentes
- Os neutrófilos são protagonistas importantes na resposta imune.
- As NETs consistem em DNA, histonas e proteínas liberadas pelos neutrófilos.
- As NETs estão implicadas em doenças autoimunes e trombose.
- Compreender a formação das NETs pode fornecer insights sobre as respostas imunes.
Objetivo do Estudo
- Isolar neutrófilos e medir a liberação de seu DNA em resposta a vários agonistas.
- Investigar a resposta dos neutrófilos a agentes indutores de NET.
- Facilitar a triagem rápida de agonistas e inibidores que afetam a formação de NET.
Métodos Utilizados
- As amostras de sangue são coletadas de um cão doador saudável utilizando uma agulha tipo borboleta de 21 gauge.
- As amostras são transferidas para tubos contendo EDTA para o isolamento de neutrófilos.
- Deve-se ter cuidado para garantir uma venopunção indolor, visando um rendimento ideal de neutrófilos.
- A inversão dos tubos assegura a mistura adequada entre o sangue e o anticoagulante.
Resultados Principais
- O método permite o isolamento eficaz de neutrófilos.
- A quantificação de NETs pode ser realizada utilizando um ensaio de fluorescência em microplaca.
- O protocolo possibilita a investigação das respostas de neutrófilos a diversos estímulos.
- É possível a triagem rápida da formação de NETs em resposta a diferentes agonistas.
Conclusões
- Este protocolo fornece um método confiável para estudar o comportamento dos neutrófilos.
- Os conhecimentos obtidos podem contribuir para a compreensão das respostas imunológicas na saúde e na doença.
- A técnica é benéfica tanto para aplicações de pesquisa quanto clínicas na medicina veterinária.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este ensaio de quantificação de NETs baseado em fluorescência permite a triagem rápida de agonistas e inibidores que afetam a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos em modelos caninos. O método auxilia na validação de alvos na pesquisa imunológica e de doenças inflamatórias, fornecendo leituras quantitativas e reprodutíveis da liberação de DNA. Ele facilita a desmistificação mecanicista em programas pré-clínicos que investigam vias mediadas por NETs em modelos de autoimunidade, trombose e doenças infecciosas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a resposta de neutrófilos a agonistas como PMA e PAF para esclarecimento da via-alvo.
- Valor Operacional: Apoia a triagem rápida de bibliotecas de compostos para identificar moduladores da NETose.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Utiliza um corante de ácidos nucleicos impermeável às células para quantificar a liberação de DNA extracelular como indicador da formação de NETs.
- Valor Operacional: Compatível com leitores de microplacas de 96 poços para perfilagem de agonistas/inibidores de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Fornece um sistema relevante para a doença para estudar o envolvimento das NETs na trombose e na autoimunidade.
- Valor Operacional: Permite análise de resposta à dose e de curso temporal para apoiar a confiança preditiva na otimização de compostos líderes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes, apoiando a redução de riscos imunológicos do alvo antes do investimento pré-clínico.
- Biologia da Descoberta: Mede a cinética de liberação de DNA para esclarecer as vias de ativação de neutrófilos e a especificidade de agonistas.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos de fluorescência que permitem comparar a potência de agonistas e a eficácia de inibidores.
- Análises: Gera dados de variação (por exemplo, aumento de 4 vezes com PAF) para classificar a atividade de compostos e avaliar a relevância biológica.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a quantificação de NETs com processos fisiopatológicos como coagulação e inflamação quando combinada com validação ortogonal.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma padronizada e reutilizável para validação de alvos em imunologia e doenças inflamatórias em diversos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao isolar sinais específicos de NETs da citotoxicidade geral, quando confirmado com microscopia.
- Valor Operacional: Utiliza reagentes baratos e acessíveis, bem como equipamentos laboratoriais padrão, para implementação escalável.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou interromper projetos ao permitir avaliação precoce dos efeitos do composto em patologias mediadas por NETs.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos nas áreas de doenças inflamatórias e autoimunes.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em isolamento de células primárias e técnicas estéreis de cultura de tecidos.
- Depende do acesso a leitores de microplacas com capacidade de detecção de fluorescência.
- Necessita padronização da densidade de semeadura celular e das condições de incubação entre os ensaios.
- Deve ser associado a métodos ortogonais (por exemplo, imunofluorescência) para distinguir NETose de outros mecanismos de morte celular.
- Limitado pela especificidade do corante, pois a fluorescência pode ocorrer devido ao DNA extracelular proveniente de necrose ou contaminação do reagente.
