Name: A fluorescência ensaio simples para a quantificação de Canine neutrófilos Extracelular Armadilha lançamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Aprenda a isolar neutrófilos caninos e quantificar a liberação de armadilhas extracelulares usando ensaio de fluorescência. Este método permite triagem rápida de agonistas e inibidores em medicina veterinária.

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Os autores agradecem aos Drs. James Roth, William Nauseef e Kayoko Kimura e ao Sr. Tom Skadow pela assistência no desenvolvimento dos protocolos de neutrófilos caninos. O RDG é apoiado por uma referência da Wellcome Trust Fellowship: WT093767MA.

Todos os experimentos foram realizados com permissão ética do Comitê Animal Care Universidade Institucional e Use o Estado de Iowa. Coleção 1. Sangue <ol><li> Desenhar 9 ml de sangue de uma veia safena, cefálica ou jugular directamente em anticoagulante (por exemplo, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 1,8 mg de K 2 EDTA / ml sangue) VACUTAINERS, ou para uma seringa com a transferência imediata para tubos de sangue contendo EDTA. Delicadamente rolar ou inverter os tubos de sangue para assegurar a mistura adequada de sangue e anti-coagulante. </li></ol> 2. neutrófilos Isolamento <ol><li> Em um tubo cónico de 50 mL, misturar o sangue com um volume igual de temperatura ambiente estéril de 3% de dextrano-500 (preparado em 0,9% de solução salina estéril) por inversão suave. Deixar de pé por 18-20 minutos à temperatura ambiente. Transferir a camada superior cor de palha para um tubo fresco, até que já não pode ser recolhido sem contaminação pela camada inferior vermelho. Os eritrócitos no the tubo original pode ser descartada. </li><li> Centrifuga-se o sobrenadante a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. Tirar e descartar o sobrenadante. Manualmente re-suspender o sedimento celular em 10 ml temperatura ambiente fosfato estéril tamponado salino (PBS). Note-se que vórtice não deve ser utilizado para re-suspender neutrófilos em qualquer fase deste protocolo. desenho manualmente fora, em vez de decantar os sobrenadantes também é recomendado durante todo o protocolo para maximizar o rendimento celular. </li><li> Adicionar 10 ml de uma solução de separação de células polissacarose temperatura ambiente e diatrizoato de sódio (por exemplo, de Histopaque 1077) para um tubo de 50 ml. Cuidadosamente camada a solução contendo as células através da solução de separação de células. Note-se que usando uma solução de separação de células que não atingir a temperatura ambiente podem reduzir a colheita de células. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 30 min à temperatura ambiente com o freio. </li><li> Como os neutrófilos estão na camada mais baixa do gradiente, desenhar e descartar a uppeR 3 camadas, composto por uma camada superior de plaquetas e de plasma, uma banda branca estreita de células mononucleares e uma camada transparente de meio de gradiente de densidade. </li><li> Para lisar quaisquer eritrócitos restantes, re-suspender o sedimento de neutrófilos em 10 ml de água à temperatura ambiente. </li><li> Após 30 segundos, restaurar a tonicidade pela adição de 10 ml de temperatura ambiente cloreto de sódio esterilizada 1,8% e misturar por inversão suave. </li><li> Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Empate fora o sobrenadante e descartar. </li><li> Se o pellet é ainda vermelho, repita a etapa de lise. Se o sedimento é branco (ou se a lise já foi realizado duas vezes), as células suavemente re-suspensão em 10 ml de PBS estéril. </li><li> Contagem de células utilizando um contador automático ou um hemocitômetro. Os rendimentos típicos são de pelo menos 10 6 culas por ml de sangue. </li><li> Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Empate fora o sobrenadante e descartar. </li><li> células na concentração desejada em PBS estéril temperatura ambiente re-suspender. for o ensaio de liberação de DNA descrita na secção 2, ressuspender em 5 x 10 6 células por ml. </li><li> Se desejado, transferir um pequeno volume das células directamente ou usando um citocentrífuga a uma lâmina de vidro. Permitir que as células para secar e mancha usando um kit de fixação e coloração rápida de acordo com a fabrica &#39;instruções. Se o isolamento de neutrófilos tenha sido bem sucedida, quando examinado sob o microscópio, pelo menos, 95% de células nucleadas deve ser granulócitos (neutrófilos, basófilos, eosinófilos) com contaminação por eritrócitos mínima. </li></ol> 3. DNA Ensaio de Libertação <ol><li> Configure o ensaio de liberação de DNA imediatamente após o isolamento dos neutrófilos. </li><li> Se aglutinação celular está presente na análise da solução de reserva por microscopia de luz, passar a suspensão de células através de um filtro estéril de 70? M estéril imediatamente antes de montar o ensaio. </li><li> Para cada poço de teste de uma placa de 96 poços estéreis, adicionam-se 5 x 10 4 células / poço; agonista e Memo Roswell Parkrial Instituto-1640 (RPMI) meio sem vermelho de fenol e suplementado com soro fetal de vitelo inactivado por calor a 0,5% para um volume final de 100-200 mL. Incluem, pelo menos, dois poços em branco por agonista em que a solução de estoque de neutrófilos é substituído por um volume igual de PBS. Note-se que a criação de poços em branco para cada agonista é importante para descartar a contaminação do DNA do agonista ou interferência pelo agonista com o ensaio de fluorescência. </li><li> Incubar a 39 ° C durante 30 min, num incubador de dióxido de carbono (4%). </li><li> Adicionar agonistas em concentrações desejadas e um corante ácido nucleico celular impermeável. Note-se a concentração óptima de corante impermeável células irá variar entre diferentes corantes ácidos nucleicos. Controlos não-estimulada em que agonistas são substituídos por um volume igual de meio devem ser incluídos em cada experiência. NOTA: É desejável diluir agonistas em volumes semelhantes de meio de cultura para manter as condições consistentes entre poços. volumes bem final de 200 &amp;# 181; G têm sido usados ​​com sucesso e, se esta for alterada, bem volumes devem permanecer idêntica para todas as condições. Forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) (concentração final ≥0.1 uM) ou factor activador de plaquetas (PAF) (concentração final ≥31 uM) podem ser utilizadas como controlos positivos. Agonistas devem ser medidos pelo menos em duplicado. </li><li> Incubar a 39 ° C. Medir a fluorescência utilizando um leitor de microplacas, após 2 horas ou em intervalos desejados. Note-se que os intervalos de tempo óptimos vão variar com agonistas utilizados. NOTA: Comprimento de onda dependerá do corante empregado. </li><li> Subtrair fluorescência em branco antes de calcular fluorescência média. </li><li> Para permitir a comparação entre indivíduos e entre as placas, calcular uma mudança na fluorescência vezes dividindo a fluorescência média de poços estimulados por a fluorescência média de poços não estimuladas. </li></ol>

<ol><li>Schiffman, J. D., Breen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+oncology%3A+what+dogs+and+other+species+can+teach+us+about+humans+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+Rl+Soc+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer.</a> Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673(2015).</li>
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<li>Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+by+neutrophil+extracellular+traps%3A+fact+or+folklore%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore?</a> Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).</li>
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<li>Pratesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+from+patients+with+rheumatoid+arthritis+target+citrullinated+histone+4+contained+in+neutrophils+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps.</a> Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).</li>
<li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).</li>
<li>Gray, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+conventional+protein+kinase+C+%28PKC%29+is+critical+in+the+generation+of+human+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inflamm+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps.</a> J Inflamm (Lond). 10 (1), 12(2013).</li>
<li>Jeffery, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dogs+cast+NETs+too%3A+Canine+neutrophil+extracellular+traps+in+health+and+immune-mediated+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia.</a> Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).</li>
<li>McCracken, J. M., Allen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neutrophil+apoptosis+and+lifespan+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease.</a> J Cell Death. 7, 15-23 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

O ensaio de libertação de ADN apresentadas é um ensaio prontamente quantificável para ADN extracelular. O método foi adaptado de técnicas semelhantes utilizadas para avaliar a formação de NET em outras espécies, mas as velocidades de centrifugação, as concentrações de agonista e os tempos de incubação foram alteradas para optimizar o processo para uso com neutrófilos canino 8,17,18. ajustes similares poderiam ser feitas para adaptar o método para outras espécies. O ensaio é simples e barato quando comparado c...

Há mais de 70 milhões de cães de estimação nos EUA sozinho 1. Como membros da família valorizados, estes animais muitas vezes recebem corte cuidados médicos borda. Igualmente porque partilham o nosso ambiente, os cães podem fornecer insights sobre a patogênese e tratamento da doença humana 1. No entanto, se a tradução descobertas na medicina humana em tratamentos veterinários, ou vice-versa, é importante caracterizar completamente as variações das espécies, mesmo em sistemas altamente conservadas, tal como a resposta imune inata. Exemplos de diferenças entre o canino e sistema imune inato humano incluem a alta expressão de CD4 no cão neutrófilos 2; a ausência de um homólogo funcional do sensor de flagelina citoplasmática IPAF em cães e 3 a expressão de um híbrido da caspase 1/4 em carnívoros 4. Armadilhas extracelulares dos neutrófilos (NETS) são um componente relativamente recentemente descoberta da imunidade inata 5. As redes são de redes de ADN proteínas, nuclear e granular liberados em resposta a uma ampla gama de estímulos inflamatórios ou infecciosos 6. Estruturas de tipo rede foram demonstradas em muitas espécies, incluindo galinhas 7, peixes, moluscos 8 9 e acoelomates 10, mas há variações de espécies. Por exemplo, os neutrófilos murino respondem mais lentamente a estímulos NETosis do que os neutrófilos humanos, e formam NET menos difusa 11. Há um grande corpo de evidências a partir de várias espécies que as redes aprisionam micróbios, e mais controversa pode ser diretamente envolvidos na eliminação de agentes patogénicos 12,13. No entanto, os componentes NET também melhorar danos nos tecidos, promover a trombose e agir como auto-antígenos 14,15. O equilíbrio entre os efeitos benéficos e deletérios da NET podem variar entre diferentes doenças e espécies diferentes, o que sugere que é importante investigar NET, tanto em espécie e condição de interesse. Aqui nósdescrevem um protocolo simples para induzir e medir a libertação de redes por neutrófilos canino. Este método é semelhante às utilizadas para isolar os neutrófilos 16 e induzir NETosis em outras espécies, mas as condições, tais como a concentração de agonista e tempo de incubação foram optimizados para os neutrófilos canino. Um ensaio de libertação de uma rede similar quantificação do ADN foi também descrita em outras espécies, mas o método aqui apresentado é também optimizado para cães 8,17,18.

<table><tbody><tr><td>Tubo de sangue total de plástico com K2EDTA revestido com spray</td><td>BD</td><td>367835</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Dextran-500</td><td>Corporação química e científica precisa.</td><td></td><td></td>AN228410</tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>20012043</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro bovino, inativado pelo calor</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>10100139</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Media 1640, sem vermelho de fenol ou L-glutamina</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>32404-014</td><td>Deve estar livre de vermelho de fenol</td></tr><tr><td>96 bem placa de poliestireno estéril de fundo plano</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>353072</tr><tr><td>Phorbol 12-miristato 13-acetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Fator de ativação plaquetária</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4904</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green Nucleic Acid Stain</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

a fluorescência ensaio simples para a quantificação de canine neutrófilos extracelular armadilha lançamento

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

As armadilhas extracelulares de neutrófilos são redes de DNA, histonas e proteínas neutrófilas liberadas em resposta a estímulos infecciosos e inflamatórios. Embora sejam um componente da resposta imune inata, os TNEs estão implicados em uma série de processos patológicos, incluindo autoimunidade e trombose. Este protocolo descreve um método simples para isolamento de neutrófilos caninos e quantificação de TNEs usando um ensaio de fluorescência em microplacas. O sangue é coletado usando técnicas convencionais de punção venosa. Os neutrófilos são isolados usando sedimentação de dextrano e um gradiente de densidade usando condições otimizadas para sangue de cão. Depois de permitir tempo para fixação aos poços de uma placa de 96 poços, os neutrófilos são tratados com agonistas indutores de TNE, como forbol-12-miristato-13-acetato ou fator de ativação plaquetária. A liberação de DNA é medida pela fluorescência de um corante de ácido nucleico impermeável a células. Este ensaio é um método simples e barato para quantificar a liberação de NET, mas a formação de NET, em vez de outras causas de morte celular, deve ser confirmada com métodos alternativos.

Usando este protocolo, não deve haver uma mudança forte dobra na fluorescência após estimulação de neutrófilos com os controlos positivos, PMA e PAF. Como ilustrado na Figura 1B, a estimulação de neutrófilos caninos com 31 uM de PAF 1 para resultados de RH num aumento significativo 4,0 vezes na fluorescência em comparação com células não estimuladas (intervalo 2,0-5,8, n = 5) 18 cães. PMA a 0,1 uM (Figura 1A) é um agonista mais lento, que não ...

armadilhas extracelulares dos neutrófilos (NETS) são redes de ADN, histonas e proteínas de neutrófilos. Embora um componente da resposta imunitária inata, redes estão implicados na autoimunidade e trombose. Este protocolo descreve um método simples para o isolamento dos neutrófilos canino e quantificação de redes que utilizam um ensaio de microplaca de fluorescência.

A fluorescência ensaio simples para a quantificação de Canine neutrófilos Extracelular Armadilha lançamento

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

O objetivo geral deste experimento é isolar neutrófilos quiescentes e medir a liberação de seu DNA em resposta a agonistas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na imunologia e na medicina veterinária, como, por exemplo, qual é a resposta dos neutrófilos a diversos agonistas da indução de armadilhas extracelulares ou da morte celular? A principal vantagem desta técnica é que ela permite o rastreamento rápido de diversos agonistas e inibidores da formação de armadilhas extracelulares neutrófilas.Inicie inserindo uma agulha tipo borboleta de 21 calibres na veia cefálica de um cão doador saudável, em seguida acople uma seringa de três mililitros e obtenha três amostras de sangue de três mililitros, transferindo imediatamente as amostras para tubos de sangue contendo EDTA sem tampa. Tenha cuidado para que a venopunção seja indolor e para que o fluxo sanguíneo seja adequado, pois uma coleta inadequada resultará em baixo rendimento de neutrófilos. Após encher cada tubo, inverta-os para garantir uma mistura adequada entre o sangue e o anticoagulante.Reúna o sangue em um tubo cônico de 50 mililitros. Misture as amostras com um volume igual de Dextran 500 a 3%, estéril

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra a indução e visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos ou TNEs em neutrófilos pré-marcados usando soro de paciente contendo anticorpos anticitoplasma de neutrófilos. Além disso, o uso de um corante de DNA impermeável e microscopia de fluorescência permite a visualização de NETs.

Indução e visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em neutrófilos pré-marcados

Podemos descrever métodos para isolar caninos neutrófilos do sangue inteiro e visualizar a formação líquida em neutrófilos ao vivo usando microscopia de fluorescência. Também descritos são protocolos para quantificar a formação líquida e citrulinado histona H3 (citH3) expressão usando microscopia de imunofluorescência.

In Vitro Formação canina neutrófilos extracelular armadilha: Análise dinâmica e quantitativa por microscopia de fluorescência

Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) e a operação NETQUANT, uma opção de software totalmente automática para quantificação de NETs em imagens de imunofluorescência.

Quantificação automatizada baseada em imagem de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando NETQUANT

Este protocolo descreve um ensaio de neutrófilos armadilha extracelular (NET) altamente sensível e alta taxa de transferência para a quantificação semi-automático de ex vivo NET formação pela microscopia confocal tridimensional de imunofluorescência. Este protocolo pode ser usado para avaliar a formação de líquido e degradação após estímulos diferentes e pode ser usado para estudar terapias NET-alvo potenciais.

Um ensaio de alta produtividade para avaliar e quantificar a formação de neutrófilos extracelular armadilha

Apresentamos um protocolo para uma técnica modificada de ensaio imunoenzimático em sanduíche para medir quantitativamente dois componentes de remanescentes de armadilhas extracelulares de neutrófilos, complexos de DNA conjugado à mieloperoxidase e DNA conjugado à elastase neutrofílica, derivados de neutrófilos ativados.

Quantificação de complexos mieloperoxidase-DNA e elastase-DNA neutrofílico a partir de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando um ELISA sanduíche modificado

Este protocolo apresenta um conjunto de ensaios funcionais de neutrófilos para ser usado como um método de triagem para cobrir funções de diferentes vias de sinalização. O protocolo inclui uma avaliação inicial e simples da viabilidade celular, pureza, produção de espécies reativas de oxigênio, migração em tempo real, fagocitose e uma sugestão preliminar de armadilhas extracelulares para neutrófilos.

Um conjunto de técnicas de triagem para uma rápida visão geral da função dos neutrófilos

Apresentamos um método automatizado de alto rendimento para quantificar armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) utilizando o sistema de análise de células vivas, juntamente com uma abordagem dual-dye dependente de permeabilidade de membrana.

Técnica de Alto Rendimento em Tempo Real para Quantificar a Formação de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Neutrófilos Humanos

Este protocolo definido descreve uma abordagem de microscopia de alto rendimento em tempo real para visualizar e quantificar a liberação de armadilha extracelular de neutrófilos humanos (NET) in vitro. O método reprodutível permite a investigação das características e cinética da liberação de NET após estimulação com indutores distintos de NETosis e permite a avaliação da farmacologia dos antagonistas da NETosis.

Quantificação microscópica em tempo real e de alto rendimento da liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e avaliação da farmacologia dos antagonistas

Neutrófilos Traps Extracelular (NET) são um mecanismo inato importante imunológico para combater as bactérias patogênicas, fungos e parasitas. Aqui nós descrevemos métodos para isolar granulócitos neutrófilos do sangue humano e para ativá-las para formar redes. Nós apresentamos técnicas de preparação para visualizar NETs em microscopia óptica e eletrônica.

Neutrófilos Traps Extracelular: Como Gerar e visualizá-los

Um protocolo para a quantificação e comparação simultânea de três componentes celulares e extracelulares dentro de biofilmes é apresentado. A metodologia envolve o uso de microscopia confocal de varredura a laser, software de análise e visualização estrutural de biofilme e software de análise estatística.

Quantificação simultânea de celulares e extracelulares Componentes de biofilmes

Aprenda a isolar neutrófilos caninos e quantificar a liberação de armadilhas extracelulares usando ensaio de fluorescência. Este método permite triagem rápida de agonistas e inibidores em medicina veterinária.

A fluorescência ensaio simples para a quantificação de Canine neutrófilos Extracelular Armadilha lançamento

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