Produção simples e eficiente e Purificação de rato Mielina Oligodendrocyte glicoproteína de encefalomielite autoimune experimental Estudos
27 de outubro de 2016
Descrevemos um protocolo simples usando apenas equipamentos básicos de laboratório para gerar e purificar grandes quantidades de uma proteína de fusão que contém glicoproteína de oligodendrócitos de mielina de camundongo. Esta proteína pode ser usada para induzir encefalomielite autoimune experimental impulsionada por células T e B.
O objetivo geral deste protocolo é gerar proteína com base no domínio extracelular da glicoproteína de oligodendrócitos de mielina ou MOG, que pode ser usada para induzir encefalomielite autoimune experimental ou EAE. Este protocolo possibilita que qualquer laboratório produza a proteína MOG para usar como antígeno para induzir EAE. A principal vantagem deste protocolo é que ele não depende de equipamentos especializados de manuseio de proteínas, mas você pode usar equipamentos padrão encontrados em quase todos os laboratórios de imunologia.
Bem, este protocolo foi otimizado para a proteína MOG tag com base na versão do camundongo, ele deve funcionar para outros sistemas de expressão de proteínas MOG que incorporam um hestate para purificação. Inocule cinco mililitros de caldo esterilizado com o estoque de glicerol BL 21 MOG e incube-o durante a noite a 37 graus Celsius e 200 RPM. Adicionar 500 microlitros de 100 miligramas por mililitro de ampicilina a cada um dos balões de 500 mililitros contendo 500 mililitros de LB estéreis. Transfira um mililitro da cultura noturna para cada um dos dois frascos de caldo LB.
Incube a 37 graus Celsius e 200 RPM por cinco horas ou até uma densidade óptica de 0,6. Quando a densidade celular desejada for atingida, adicione 0,5 mililitros de um IPTG molar a cada frasco de cultura. Incubar o balão, regular a 37 graus Celsius e 200 RPM durante quatro horas e depois à temperatura ambiente e 75 RPM durante a noite.
Distribuir as culturas uniformemente por frascos de 250 mililitros compatíveis com centrifugação de alta velocidade e manter os frascos no gelo a partir deste ponto. Pulverize as células bacterianas a 22.000 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Ressuspenda e combine todos os pellets bacterianos em um total de 30 mililitros de tampão lisado.
Transfira esse volume para cerca de um tubo inferior de 50 mililitros capaz de centralização em alta velocidade. Coloque este tubo em banho-maria a 30 graus Celsius por 30 minutos. Durante o tempo de incubação, agite o tubo duas vezes para ressuspender as células.
Após a incubação, transporte o tubo para o gelo e sonice a solução a 20 kilohertz e amplitude de 70% pulsando por três segundos e desligado por três segundos por cinco pulsos, sonice a solução por seis rodadas totais de cinco pulsos, permitindo que a solução esfrie no gelo entre as rodadas. Em seguida, centrifugue a solução a 24.000 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius, depois ressuspenda o pellet em 30 mililitros de tampão A e incube a solução a quatro graus Celsius por três horas. Após a incubação, sonicar a solução em gelo como antes e, em seguida, adicionar 17,2 gramas de guanidina HCl à solução.
Incubar a amostra no gelo durante uma hora para solubilizar a proteína MOG tag. Para carregar e equilibrar a resina de níquel, primeiro lave a resina adicionando 40 mililitros de água a cada tubo que contém resina. Coloque os tubos horizontalmente em um balancim e deixe-os agitar por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Uma vez terminado, centrifugue os tubos a 4500 vezes g por oito minutos a quatro graus Celsius. Rejeitar o sobrenadante pipetando para evitar perturbar o pellet. Em seguida, adicione 40 mililitros de buffer de carga a cada tubo.
Transfira os tubos para um balancim e deixe-os agitar por 15 minutos a quatro graus Celsius antes de centralizar novamente como antes. Descarte o sobrenadante e adicione 40 mililitros de tampão B aos tubos. Transfira os tubos para um balancim e deixe-os agitar por cinco minutos a quatro graus Celsius antes de centralizar os tubos com resina mais uma vez.
Para purificar a proteína MOG tag, transfira todo o volume de proteína solublizada para o primeiro tubo contendo resina de níquel. Após a mistura, coloque o tubo horizontalmente em um balancim a quatro graus Celsius por uma hora. Após fundir centralmente o tubo a 4500 vezes g por oito minutos a quatro graus Celsius, transfira este sobrenadante para o segundo tubo de resina de níquel e incube como antes.
Enquanto isso, ressuspenda a resina de níquel no primeiro tubo em tampão de evolução de 40 mililitros e coloque o tubo horizontalmente em um balancim a quatro graus Celsius por cinco minutos antes de centralizar como antes. Transfira o sobrenadante contendo a proteína MOG tag aludida para um frasco de 250 mililitros rotulado com proteína MOG purificada. Mantenha esta garrafa a quatro graus Celsius.
A cada etapa de eluição, agrupe o sobrenadante resultante neste frasco. Adicione 40 mililitros de tampão de tira ao níquel presente no primeiro tubo e coloque horizontalmente em um balancim por cinco minutos a quatro graus Celsius. Centrifugar o tubo, rejeitar o sobrenadante e recarregar o níquel obtido como anteriormente.
Quando terminar, avance com o segundo tubo como foi feito para o primeiro tubo. Um total de quatro rodadas de absorção da proteína solubilizada na resina de níquel carregada e eluição recuperará a maior parte da proteína. Corte aproximadamente 30 centímetros de tubo de diálise de pele de cobra.
Prenda uma extremidade com um hemostático de travamento dobrando a extremidade da pele da cobra três vezes e prendendo a extremidade dobrada com o hemostático. Encha a pele da cobra com proteína MOG tag diluída. Em seguida, remova todas as bolhas de ar da pele de cobra, forçando-as para fora da extremidade aberta.
Finalmente, sele a outra extremidade do tubo usando um segundo hemostático de bloqueio. Em seguida, encha um balde grande com um litro de um tampão de acetato com quatro guanidina molar. Coloque até duas seções de tubo de diálise contendo a proteína MOG tag no balde.
Usando fita adesiva, prenda os hemostáticos na lateral do balde para deixar espaço para uma barra de agitação magnética girar sem obstáculos no fundo. Coloque o balde em uma sala de quatro graus Celsius em uma placa de saia magnética e ligue-o a uma taxa de rotação lenta. A diálise leva no mínimo três dias para reduzir gradualmente a quantidade de guanidina no tampão.
Verifique regularmente se o tubo começa intacto e se as extremidades estão bem fechadas. Após quatro a cinco horas, adicione um litro de um tampão de acetato ao balde de diálise. Repita esse processo a cada quatro a cinco horas por um total de três vezes para resultar no total de quatro litros no balde.
Depois de descartar metade do tampão no balde, reabasteça com um litro de um tampão de acetato e monte o tubo e a barra de agitação. Por fim, substitua todo o volume de quatro litros no balde por quatro litros de tampão de acetato fresco e deixe mexer por quatro a cinco horas. Para obter melhores resultados, faça esta etapa no dia da concentração da proteína.
Para concentrar a proteína da etiqueta MOG, forre uma caneta com papel alumínio e cubra o papel alumínio com PEG 3350 e PEG 1000 na proporção de um para um. O PEG 3350 pode ajudar a prevenir a agregação de proteínas durante a concentração e é um criopreservativo eficaz. Coloque a proteína MOG tag contendo tubo de pele de cobra em cima da folha de alumínio e cubra com PEG 8000.
Deixe descansar em temperatura ambiente e verifique o volume regularmente até que o volume seja igual ou inferior ao volume final estimado. Se a caneta ficar saturada demais com água durante o processo de concentração, coloque uma panela nova com papel alumínio e PEG. Amostras de proteína coletadas durante todo o protocolo de purificação ou executadas em um gel de página SDS para confirmar a pureza.
Um gel representativo é exibido mostrando a etiqueta MOG altamente purificada em 31,86 kilodaltons. Para verificar se a proteína MOG tag se dobrou corretamente, a ligação da proteína MOG tag a CD19 positivo, CD4 negativo, nove células B de linfonodos de camundongos selvagens tipo C57 preto seis ou camundongos IgH MOG que expressam uma cadeia pesada de imunoglobulina específica para a proteína MOG foi avaliada usando citometria de fluxo. Este protocolo requer um mínimo de 10 dias do início ao fim.
Durante todo o procedimento de isolamento é importante acompanhar a proteína e lembrar o que precisa ser mantido e o que precisa ser descartado. Não se esqueça de usar sulfato de níquel hexahidratado usado no carregamento da resina de níquel, é extremamente perigoso e deve-se tomar precauções para evitar a inalação ou contato com a pele ou os olhos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir e purificar sua própria proteína MOG.
Uma vez purificada, a proteína MOG tag pode ser emulsionada em adjuvante completo de Freund e usada como imunização para induzir EAE. O EAE induzido pela etiqueta MOG pode ser usado para estudar o envolvimento de vários tipos de células, como células CD4 ou CDAT ou células B na autoimunidade do sistema nervoso central. Ao contrário do peptídeo curto, que é restrito ao MHC, o antígeno proteico pode ser usado em qualquer linhagem de camundongos.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método simples para gerar e purificar uma proteína de fusão contendo a glicoproteína oligodendrocítica da mielina de camundongo (MOG). A proteína produzida pode ser utilizada para induzir encefalomielite autoimune experimental (EAE) mediada por células T e B.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Imunologia
- Purificação de Proteínas
Contexto
- A Glicoproteína Mielina Oligodendrócito (MOG) é crucial para o estudo de doenças autoimunes.
- A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo para esclerose múltipla.
- Equipamentos de laboratório padrão podem ser utilizados para a produção de proteínas, tornando o processo acessível.
- O protocolo é otimizado para MOG de camundongo, mas pode ser adaptado para outros sistemas.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para a produção da proteína MOG.
- Facilitar a pesquisa sobre EAE e condições autoimunes relacionadas.
- Permitir que laboratórios sem equipamentos especializados realizem esta pesquisa.
Métodos Utilizados
- Inoculação de caldo esterilizado com estoque glicerinado BL 21 MOG tag.
- Incubação a 37 graus Celsius com agitação.
- Preparação de caldo LB com ampicilina para seleção.
- Transferência da cultura de crescimento noturno para caldo LB para expressão proteica.
Resultados Principais
- Geração bem-sucedida da proteína MOG utilizando técnicas laboratoriais padrão.
- A proteína pode ser usada como antígeno para induzir EAE.
- O protocolo permite a produção em larga escala da proteína de fusão.
- Método acessível para diversos laboratórios de pesquisa.
Conclusões
- O protocolo simplifica a produção da proteína MOG.
- Ele auxilia a pesquisa em doenças autoimunes como a esclerose múltipla.
- Equipamentos padrão podem ser utilizados, aumentando a acessibilidade para pesquisadores.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite que equipes de P&D de biofármacos produzam a proteína nativa de mielina oligodendrócito glicoproteína (MOG) para modelos pré-clínicos que envolvem as vias de linfócitos T e B na encefalomielite autoimune. Ao gerar a proteína MOG extracelular de comprimento completo utilizando equipamentos laboratoriais convencionais, o método auxilia na desmistificação mecanicista de hipóteses terapêuticas direcionadas às células B na pesquisa da esclerose múltipla. O design escalonável e passível de remoção de etiquetas facilita a produção reprodutível de antígenos para indução consistente de modelos de doença ao longo de fluxos de trabalho de descoberta e translacionais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas envolvendo o reconhecimento nativo da MOG por linfócitos B patogênicos em modelos de doenças autoimunes do SNC.
- Valor Operacional: Fornece uma fonte padronizada de antígeno para validar a MOG como alvo na neuroinflamação mediada por linfócitos B, sem necessidade de infraestrutura especializada de purificação proteica.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Produz MOGtag ou MOG1-125 purificada adequada para uso em ensaios imunológicos para detectar respostas de anticorpos anti-MOG em amostras pré-clínicas.
- Valor Operacional: Fornece rendimentos consistentes (>200 mg por corrida) de proteína compatível com endotoxinas, permitindo o desenvolvimento escalonável de ensaios e a qualificação de reagentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a modelagem de sistemas relevantes para doenças ao induzir EAE com MOG nativa, capturando assim mecanismos patogênicos dependentes de linfócitos B relevantes para a patologia da EM humana.
- Valor Operacional: Garante continuidade translacional da descoberta até a validação pré-clínica por meio de um processo de produção reprodutível, independente de equipamentos e adaptável entre diferentes linhagens de camundongos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na transição entre a fase de descoberta inicial e a pré-clínica ao fornecer uma fonte confiável de antígeno para a geração de modelos baseados em hipóteses, padronização de leituras de ensaios e decisões de avanço ajustadas ao risco em programas de doenças autoimunes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a validação de alvos ao permitir a avaliação funcional das respostas de linfócitos B e T específicos para MOG in vivo.
- Triagem: Gera lotes padronizados de antígeno para triagem reprodutível de compostos imunomoduladores em modelos de EAE.
- Análises: Fornece proteína pura e quantificável, adequada para ELISA, citometria de fluxo e outros ensaios imunoanalíticos para medir respostas imunes específicas ao antígeno.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se à continuidade pré-clínica produzindo antígeno que espelha o alvo nativo reconhecido nas terapias clínicas de esgotamento de linfócitos B para a EM.
- Reutilização Institucional: Estabelece uma plataforma reutilizável para produção de antígeno MOG que pode ser compartilhada entre equipes de imunologia e neurociência sem dependência de instalações especializadas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao permitir o estudo de mecanismos autoimunes envolvendo o reconhecimento de antígenos nativos, reduzindo a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Promove padronização e reprodutibilidade por meio de um fluxo de trabalho de purificação bem definido e escalonável, utilizando reagentes e equipamentos acessíveis.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento ao reduzir os riscos associados a mecanismos envolvendo linfócitos B no início do processo, potencialmente diminuindo a desistência em fases tardias dos programas de neuroimunologia.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de terapêuticas direcionadas ao MOG com base em modelos que refletem a apresentação de antígenos e o envolvimento de linfócitos B relevantes para humanos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em biologia molecular, expressão bacteriana de proteínas e cromatografia de afinidade por níquel.
- Depende de equipamentos laboratoriais padrão, incluindo incubadoras, centrífugas, sonicadores e sistema de diálise; não são necessários sistemas especializados de purificação de proteínas.
- Necessita padronização entre equipes na quantificação de proteínas, teste de endotoxinas e condições de armazenamento para garantir reprodutibilidade entre os locais.
- Envolve o manuseio de cloreto de guanidina e sulfato de níquel hexaidratado, exigindo protocolos apropriados de segurança química e procedimentos de descarte de resíduos.
- A adaptação a sistemas de expressão alternativos pode exigir otimização das condições de indução e compatibilidade de tampão, mantendo o design da marcação clivável por TEV.
