Name: Produção simples e eficiente e Purificação de rato Mielina Oligodendrocyte glicoproteína de encefalomielite autoimune experimental Estudos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Aprenda a produzir e purificar a proteína MOG de camundongo para induzir encefalomielite autoimune experimental. Este método acessível utiliza equipamentos padrão de laboratório de imunologia.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá. RWJ recebeu o Prêmio de Bolsa de Doutorado da Waugh Family MS Society of Canada.

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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a produção de proteína com cauda MOG e como gerar puro MOG 1-125 da proteína com cauda MOG. Este protocolo baseia-se tanto em métodos padrão His-tag com base de purificação de proteínas, bem como um protocolo anteriormente descrito para a geração de uma proteína com base MOG-15 mais velhos. Embora não seja descrito aqui, a utilização principal da proteína com cauda é a MOG para induzir EAE por imunização com o antigénio de pro...

A esclerose múltipla é uma doença humana caracterizada pela inflamação crónica e neurodegeneração do SNC, que é pensado para ser impulsionado por uma resposta auto-imune dirigida à mielina. A perda de mielina e axônios ao longo do tempo como resultado a redução gradual da função cognitiva e motora 1. &quot;Encefalomielite autoimune experimental&quot; é um termo genérico para modelos animais de doença auto-imune dirigida para a mielina do SNC. Como MS humanos, a EAE é tipicamente caracterizada pela infiltração de células imunes do sistema nervoso central e, em alguns casos, 2 desmielinização. No entanto, o grau a que um determinado modelo de EAE se assemelha a MS humana, em parte, depende da espécie ou estirpe utilizada e da complexidade da resposta auto-imune anti-mielina subjacente. auto-imunidade anti-mielina pode ser experimentalmente induzida de várias maneiras, mas o método mais comum utilizado hoje em dia é para imunizar ratinhos com um péptido curto de aminoácidos imitando o CD4 imunodominante <saté&gt; + epítopo de célula T de uma proteína de mielina. Isto representa o requisito mínimo para induzir uma resposta patogénica. Talvez o mais comum destes é um péptido de 21 aminoácidos derivado de glicoproteína de mielina de oligodendrócitos (MOG 35-55), que é utilizado para induzir a EAE em ratinhos C57BL / 6 3. No entanto, para alguns fins experimentais é desejável ou mesmo necessário para imunizar com antígenos proteicos maiores e, de fato, existem várias vantagens para este mais de imunização com péptido curto. Em primeiro lugar, devido à restrição de MHC, os péptidos curtos são geralmente eficazes apenas num intervalo muito limitado de estirpes, enquanto antigénios proteicos maiores que representa tanto toda a proteína ou um domínio específico pode ser processada normalmente para a apresentação em múltiplas estirpes de ratinhos consanguíneos ou mesmo em diferentes espécies 4. Em segundo lugar, um antigénio de proteína maior é capaz de induzir uma resposta imune mais complexo que incorpora mais tipos de linfócitos no reconhecimento do antigénio, em vez de limiting reconhecimento do antigénio às células T CD4 +. Por exemplo, as células B através do seu receptor de célula B (BCR) interagir directamente com todo e não processadas proteína. Nós e outros autores mostraram que as células B activadas por MOG 35-55 imunização não reconhecem proteínas MOG 5. Uma vez que as células B foram recentemente demonstrado desempenhar um papel patogénico no MS humano 6, modelos de EAE que incorporam as células B na patologia auto-imune são cada vez mais importante. Apesar das vantagens da utilização de antigenes de proteínas maiores para induzir a EAE, continuam a existir algumas fontes comercialmente disponíveis para essas proteínas. Com efeito, enquanto que os péptidos curtos como MOG 35-55 pode ser sintetizada muito rapidamente e com um custo relativamente baixo, as opções para a proteína comerciais MOG são limitados e custo substancialmente mais para comprar. No entanto, existem vários vectores de expressão disponíveis para grupos de pesquisa para gerar MOG domínio extracelular (MOG 1-125) próprios. however, todos os sistemas de expressão que identificamos na literatura são baseados em tecnologias mais antigas que já foram substituídos por sistemas de expressão mais eficientes 7. Além disso, a maioria são baseados em rato ou humana MOG 8. Para algumas investigações de auto-imunidade em ratinhos, um antigénio com base no auto-antigénio de rato MOG é preferível. Finalmente, todas as proteínas baseados no MOG que identificámos, quer comerciais ou como vectores de expressão, são proteínas de fusão contendo aminoácidos adicionais para a base de MOG 1-125. Estes incluem um tag para a purificação e, geralmente, outras sequências, bem como, muitos dos quais com uma função não fomos capazes de identificar. Para resolver estas limitações, geramos uma proteína de fusão romance baseado no mouse MOG domínio extracelular fundido a um tag contendo tioredoxina para combater a insolubilidade conhecida de proteína MOG 5. A sequência de marcador contém ainda uma sequência de 6xHis para a purificação e uma protease TEV CLEAvage local que permite a remoção completa de todas as sequências de marcador, se desejado. Este é o único método que estamos cientes de gerar pura proteína MOG 1-125. Para facilitar a produção de grandes quantidades de proteína, a sequência de MOG 1-125 foi codões optimizados para a expressão bacteriana e a proteína de fusão tag MOG foi inserida no sistema de expressão pET-32. Aqui, descrevemos detalhadamente o protocolo para produzir e purificar proteínas tag MOG, e MOG puro 1-125, usando equipamentos não-especializados disponíveis para a maioria dos laboratórios de imunologia.

<table><tbody><tr><td>BL21 E. coli- pet32-MOGtag</td><td>Kerfoot lab</td><td></td><td>Essas bactérias são necessárias para produzir a proteína MOGtag. Os estoques de glicerol dessas bactérias estão disponíveis mediante solicitação.</td></tr><tr><td>Moleiro de caldo LB</td><td>Bioshop</td><td>LBL407.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>bio basic</td><td>AB0028</td><td>Reconhecer o pó em 50% de etanol / 50% de H2O a 100 mg/ml. Armazenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bioshop</td><td>IPT002.5</td><td>Reconheça o pó em H2O a 1M e armazene a -20 °C.</td></tr><tr><td>Lisozima de ovo de galinha</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.10</td><td>Reconstituir em H2O a 50 mg/ml e armazenar a -80 &deg;C.</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered</td><td>salina life technologies</td><td>20012-027</td><td>A solução salina tamponada com fosfato comercial não é necessária, qualquer solução salina tamponada com fosfato padrão feita em laboratório é suficiente.</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Bioshop</td><td>SOD004.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Bioshop</td><td>TRS002.1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Bioshop</td><td>IMD508.100</td><td></td></tr><tr><td>Guanidina-HCl</td><td>Sigma</td><td>G3272</td><td>A qualidade deve ser superior a 98% de pureza.</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de níquel (II)</td><td>Bioshop</td><td>NIC700.500</td><td></td></tr><tr><td>Sua resina de ligação</td><td>EMD Millipore</td><td>69670-3</td><td>Armazenar em 20% de etanol 80% H2O a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Etanol anidro</td><td>Álcoois comerciais</td><td>P016EAAN</td><td>Dilua com água conforme necessário.</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.1</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio trihidratado</td><td>Bioshop</td><td>SAA305.500</td><td></td></tr><tr><td>albumina de soro bovino padrão</td><td>bio-rad</td><td>500-0206</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio de proteína Bio-rad concentrado de reagente de corante</td><td>bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiamina tetracético, sal dissódico di-hidratado</td><td>Fisher scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Bioshop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>7000 MW Tubo de diálise de pele de cobra</td><td>Thermoscientific</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ml</td><td>Este reagente não deve ser manuseado fora de um exaustor.</td></tr><tr><td>AcTEV protease</td><td>lifetechnologies</td><td>12575-015</td><td>A produção de sua própria protease TEV pode ser realizada usando (https://www.addgene.org/8827/) e purificada como na referência 17</td></tr><tr><td>Polietilenoglicol 3350</td><td>Bioshop</td><td>PEG335.1</td><td></td></tr><tr><td>polietilenoglicol 8000</td><td>Bioshop</td><td>PEG800.1</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp fundo plano 96 poços placa</td><td>ebioscience</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr> Espectrômetro de microplacas <tr><td>Sonicator</td><td>Fisher scientific</td><td>FB-120-110</td><td></td></tr><tr><td>Eon</td><td>Biotek</td><td>11-120-611</td><td>Este equipamento usa o software de análise de dados Gen5.</td></tr><tr><td>Software de análise de dados Gen5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dodecil sulfato de sódio</td><td>Bioshop</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>azul de bromofenol</td><td>Bioshop</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001</td><td></td></tr><tr><td>Colunas de dessalinização de proteínas</td><td>Thermoscientific</td><td>89849</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001</td><td></td></tr><tr><td>gel pré-moldado de poliacrilamida 12%</td><td>bio-rad</td><td>456-1045</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de coloração rápida</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td></td></tr><tr><td>Gel dock EZ imager</td><td>bio-rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de Amostra de Luz Branca</td><td>bio-rad 1708272</td><td>&nbsp;</td><td>Usado junto com o gerador de imagens EZ de gel para manchas azuis coomassie</td></tr><tr><td>Escada de proteína</td><td>bio-rad</td><td>1610375</td><td></td></tr></tbody></table>

produção simples e eficiente e purificação de rato mielina oligodendrocyte glicoproteína de encefalomielite autoimune experimental estudos

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica do sistema nervoso central (SNC), que se acredita ocorrer como resultado de respostas autoimunes direcionadas à mielina. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é o modelo animal mais comum de doença autoimune do SNC e é tipicamente induzida por imunização com peptídeos curtos que representam epítopos de células T CD4+ imunodominantes de proteínas de mielina. No entanto, as células B reconhecem a proteína não processada diretamente, e a imunização com peptídeo curto não ativa as células B que reconhecem a proteína nativa. Como ensaios clínicos recentes de terapias de depleção de células B na EM sugeriram um papel para as células B na condução de doenças em humanos, há uma necessidade urgente de modelos animais que incorporem o reconhecimento de células B do autoantígeno. Para este fim, geramos uma nova proteína de fusão contendo o domínio extracelular da versão de camundongo da glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG), bem como fusões N-terminais de uma marca His para fins de purificação e a proteína tiorredoxina para melhorar a solubilidade (etiqueta MOG). Um local de clivagem da protease do vírus da corrosão do tabaco (TEV) foi incorporado para permitir a remoção de todas as sequências de marcação, deixando apenas o domínio extracelular MOG1-125 puro. Aqui, descrevemos um protocolo simples usando apenas equipamento de laboratório padrão para produzir grandes quantidades deetiqueta MOG pura ou MOG1-125. Este protocolo gera consistentemente mais de 200 mg de proteínaMOG tag. A imunização coma etiqueta MOG ou MOG1-125 gera uma resposta autoimune que inclui células B patogênicas que reconhecem o MOG nativo do camundongo.

Uma vez que a purificação está completa, as amostras recolhidas nos passos 1.4, 2.1, 3.4, e o produto final da etapa 6.4 devem ser corridos num gel de proteína (Figura 3A). Tag MOG primeiro deve aparecer como uma banda de 31,86 kDa na amostra T O / N, mas não t 0, e deve ser a única banda no produto final puro. Para testar se a proteína com cauda tem MOG correctamente dobrada, a proteína com cauda MOG pode ser utiliz...

Descrevemos um protocolo simples usando apenas equipamentos básicos de laboratório para gerar e purificar grandes quantidades de uma proteína de fusão que contém glicoproteína de oligodendrócitos de mielina de camundongo. Esta proteína pode ser usada para induzir encefalomielite autoimune experimental impulsionada por células T e B.

Produção simples e eficiente e Purificação de rato Mielina Oligodendrocyte glicoproteína de encefalomielite autoimune experimental Estudos

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

O objetivo geral deste protocolo é gerar uma proteína baseada no domínio extracelular da glicoproteína da mielina de oligodendrócitos ou MOG, que pode ser utilizada para induzir encefalomielite autoimune experimental ou EAE. Este protocolo torna possível que qualquer laboratório produza a proteína MOG para utilizá-la como antígeno na indução de EAE. A principal vantagem deste protocolo é que ele não depende de equipamentos especializados para manipulação de proteínas, mas sim de equipamentos padrão encontrados em quase qualquer laboratório de imunologia.Bem, este protocolo foi otimizado para a proteína com marcação MOG com base na versão de camundongo; ele deve funcionar para outros sistemas de expressão de proteína MOG que incorporem uma alça de purificação. Inocule cinco mililitros de caldo esterilizado com o estoque glicerinado BL21 MOG tag e incube durante a noite a 37 graus Celsius e 200 rpm. Adicione 500 microlitros de ampicilina a 100 miligramas por mililitro a cada um dos dois frascos de 500 mililitros contendo 500 mililitros de LB estéril. Transfira um mililitro da cultura de crescimento noturno para cada um dos dois frascos de caldo LB.Incubar a 37 graus Celsius e 200 RPM

simple-efficient-production-purification-mouse-myelin-oligodendrocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra uma técnica de homogeneização eficiente para gerar uma emulsão antigénio-adjuvante para induzir encefalomielite autoimune experimental (EAE) num modelo murino. A emulsão contém um autoantígeno - glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG) - na fase aquosa, cercada por uma fase oleosa contínua composta por uma bactéria patogênica inativada. A emulsão garante uma liberação sustentada de antígenos para uma resposta imune prolongada.

Preparando uma emulsão adjuvante de antígeno para induzir encefalomielite autoimune

O vídeo demonstra a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo injetando uma combinação de glicoproteínas de oligodendrócitos de mielina e Mycobacterium tuberculosis inativado. O modelo permite que os pesquisadores estudem os mecanismos da doença e testem intervenções terapêuticas.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

Este vídeo demonstra o método de indução de encefalomielite autoimune experimental (EAE) injetando peptídeos derivados de mielina com um adjuvante para ativar células T autorreativas, que migram para o cérebro. A toxina da coqueluche é administrada para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que essas células T e outras células imunológicas entrem no cérebro. Essas células imunes causam desmielinização, levando ao comprometimento da transmissão nervosa e ao...

Geração de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

Neste vídeo, um modelo de camundongo com esclerose múltipla é estabelecido usando encefalomielite autoimune experimental (EAE). O camundongo é injetado com uma emulsão contendo um peptídeo neuronal e um adjuvante, desencadeando uma resposta imune que ativa as células T autorreativas. Isso é seguido por uma injeção de toxina coqueluche (PTX) para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que as células T autorreativas se infiltrem no cérebro. Essa infiltração inicia uma...

Fonte: Jain, R. W., et al. Produção e purificação simples e eficientes de glicoproteína de oligodendrócitos de mielina de camundongo para estudos experimentais de encefalomielite autoimune. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra o isolamento e purificação do MOGtag, uma glicoproteína recombinante de oligodendrócitos de mielina (MOG) usada em estudos de encefalomielite autoimune experimental (EAE). O protocolo envolve lise bacteriana, sonicação, centrifugação e cromatografia de afinidade de...

Isolamento e purificação de glicoproteínas de oligodendrócitos de mielina recombinante

O transplante de células-tronco / progenitoras neurais (NPCs) detém grandes promessas em neurologia regenerativa. A administração sistêmica de NPCs se transformou em baixo invasivo e muito eficaz terapeuticamente protocolo eficaz, para entregar as células-tronco no cérebro e na medula espinhal de roedores e primatas não-humanos que sofreram prejuízos inflamatória crônica experimental do sistema nervoso central.

Injeção sistêmica de células-tronco neurais / progenitoras em ratos com EAE crónica

Encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo animal estabelecido de esclerose múltipla. C57BL / 6 são imunizados com mielina de oligodendrócitos glicoproteína (MOG) peptídeo 35-55 (MOG 35-55), o que resulta em uma paralisia flácida ascendente causada por células imunes autorreactivas no sistema nervoso central. Protocolos para indução e monitoramento de doenças serão discutidos.

Mielina Oligodendrocyte glicoproteína (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induzida Encefalomielite Auto-imune Experimental (EAE) em murganhos C57BL / 6

Descrevemos o isolamento de Fima de oligodendrócitos mouse principal, que permite o isolamento das células para cultura em vitro rápido e específico.

Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

Para induzir encefalomielite autoimune experimental, um modelo animal de esclerose múltipla, os ratos são imunizados com uma emulsão de água em óleo contendo um autoantígeno e adjuvante completo de Freund. Embora existam vários protocolos para a preparação dessas emulsões, um protocolo de homogeneização rápido, simples e padronizado para a preparação de emulsões é apresentado aqui.

Um método de homogeneização rápido, simples e padronizado para preparar emulsões de antígenos/adjuvantes para induzir encefalomielite autoimune experimental

Até o momento, os protocolos para o isolamento simultâneo de todos os principais tipos celulares residentes no sistema nervoso central do mesmo camundongo são uma demanda não atendida. O protocolo mostra um procedimento aplicável em camundongos ingênuos e experimentais com encefalomielite autoimune para investigar redes celulares complexas durante a neuroinflamação e, simultaneamente, reduzir o número necessário de camundongos.

Isolamento Simultâneo dos Principais Tipos Celulares Residentes no Sistema Nervoso Central de Camundongos Adultos com Encefalomielite Autoimune

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo animal de esclerose múltipla (EM), que compartilha com a doença humana uma resposta autoimune humoral robusta. Aqui, relatamos um protocolo ELISA simples e flexível para quantificar autoanticorpos no soro de camundongos imunizados com EAE.

Quantificação de anticorpos autorreativos em camundongos após encefalomielite autoimune experimental

Aprenda a produzir e purificar a proteína MOG de camundongo para induzir encefalomielite autoimune experimental. Este método acessível utiliza equipamentos padrão de laboratório de imunologia.

Produção simples e eficiente e Purificação de rato Mielina Oligodendrocyte glicoproteína de encefalomielite autoimune experimental Estudos (Vídeo) | JoVE Journal

Produção simples e eficiente e Purificação de rato Mielina Oligodendrocyte glicoproteína de encefalomielite autoimune experimental Estudos

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