Name: Produção simples e eficiente e Purificação de rato Mielina Oligodendrocyte glicoproteína de encefalomielite autoimune experimental Estudos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Aprenda a produzir e purificar a proteína MOG de camundongo para induzir encefalomielite autoimune experimental. Este método acessível utiliza equipamentos padrão de laboratório de imunologia.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá. RWJ recebeu o Prêmio de Bolsa de Doutorado da Waugh Family MS Society of Canada.

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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a produção de proteína com cauda MOG e como gerar puro MOG 1-125 da proteína com cauda MOG. Este protocolo baseia-se tanto em métodos padrão His-tag com base de purificação de proteínas, bem como um protocolo anteriormente descrito para a geração de uma proteína com base MOG-15 mais velhos. Embora não seja descrito aqui, a utilização principal da proteína com cauda é a MOG para induzir EAE por imunização com o antigénio de pro...

A esclerose múltipla é uma doença humana caracterizada pela inflamação crónica e neurodegeneração do SNC, que é pensado para ser impulsionado por uma resposta auto-imune dirigida à mielina. A perda de mielina e axônios ao longo do tempo como resultado a redução gradual da função cognitiva e motora 1. &quot;Encefalomielite autoimune experimental&quot; é um termo genérico para modelos animais de doença auto-imune dirigida para a mielina do SNC. Como MS humanos, a EAE é tipicamente caracterizada pela infiltração de células imunes do sistema nervoso central e, em alguns casos, 2 desmielinização. No entanto, o grau a que um determinado modelo de EAE se assemelha a MS humana, em parte, depende da espécie ou estirpe utilizada e da complexidade da resposta auto-imune anti-mielina subjacente. auto-imunidade anti-mielina pode ser experimentalmente induzida de várias maneiras, mas o método mais comum utilizado hoje em dia é para imunizar ratinhos com um péptido curto de aminoácidos imitando o CD4 imunodominante <saté&gt; + epítopo de célula T de uma proteína de mielina. Isto representa o requisito mínimo para induzir uma resposta patogénica. Talvez o mais comum destes é um péptido de 21 aminoácidos derivado de glicoproteína de mielina de oligodendrócitos (MOG 35-55), que é utilizado para induzir a EAE em ratinhos C57BL / 6 3. No entanto, para alguns fins experimentais é desejável ou mesmo necessário para imunizar com antígenos proteicos maiores e, de fato, existem várias vantagens para este mais de imunização com péptido curto. Em primeiro lugar, devido à restrição de MHC, os péptidos curtos são geralmente eficazes apenas num intervalo muito limitado de estirpes, enquanto antigénios proteicos maiores que representa tanto toda a proteína ou um domínio específico pode ser processada normalmente para a apresentação em múltiplas estirpes de ratinhos consanguíneos ou mesmo em diferentes espécies 4. Em segundo lugar, um antigénio de proteína maior é capaz de induzir uma resposta imune mais complexo que incorpora mais tipos de linfócitos no reconhecimento do antigénio, em vez de limiting reconhecimento do antigénio às células T CD4 +. Por exemplo, as células B através do seu receptor de célula B (BCR) interagir directamente com todo e não processadas proteína. Nós e outros autores mostraram que as células B activadas por MOG 35-55 imunização não reconhecem proteínas MOG 5. Uma vez que as células B foram recentemente demonstrado desempenhar um papel patogénico no MS humano 6, modelos de EAE que incorporam as células B na patologia auto-imune são cada vez mais importante. Apesar das vantagens da utilização de antigenes de proteínas maiores para induzir a EAE, continuam a existir algumas fontes comercialmente disponíveis para essas proteínas. Com efeito, enquanto que os péptidos curtos como MOG 35-55 pode ser sintetizada muito rapidamente e com um custo relativamente baixo, as opções para a proteína comerciais MOG são limitados e custo substancialmente mais para comprar. No entanto, existem vários vectores de expressão disponíveis para grupos de pesquisa para gerar MOG domínio extracelular (MOG 1-125) próprios. however, todos os sistemas de expressão que identificamos na literatura são baseados em tecnologias mais antigas que já foram substituídos por sistemas de expressão mais eficientes 7. Além disso, a maioria são baseados em rato ou humana MOG 8. Para algumas investigações de auto-imunidade em ratinhos, um antigénio com base no auto-antigénio de rato MOG é preferível. Finalmente, todas as proteínas baseados no MOG que identificámos, quer comerciais ou como vectores de expressão, são proteínas de fusão contendo aminoácidos adicionais para a base de MOG 1-125. Estes incluem um tag para a purificação e, geralmente, outras sequências, bem como, muitos dos quais com uma função não fomos capazes de identificar. Para resolver estas limitações, geramos uma proteína de fusão romance baseado no mouse MOG domínio extracelular fundido a um tag contendo tioredoxina para combater a insolubilidade conhecida de proteína MOG 5. A sequência de marcador contém ainda uma sequência de 6xHis para a purificação e uma protease TEV CLEAvage local que permite a remoção completa de todas as sequências de marcador, se desejado. Este é o único método que estamos cientes de gerar pura proteína MOG 1-125. Para facilitar a produção de grandes quantidades de proteína, a sequência de MOG 1-125 foi codões optimizados para a expressão bacteriana e a proteína de fusão tag MOG foi inserida no sistema de expressão pET-32. Aqui, descrevemos detalhadamente o protocolo para produzir e purificar proteínas tag MOG, e MOG puro 1-125, usando equipamentos não-especializados disponíveis para a maioria dos laboratórios de imunologia.

<table><tbody><tr><td>BL21 E. coli- pet32-MOGtag</td><td>Kerfoot lab</td><td></td><td>Essas bactérias são necessárias para produzir a proteína MOGtag. Os estoques de glicerol dessas bactérias estão disponíveis mediante solicitação.</td></tr><tr><td>Moleiro de caldo LB</td><td>Bioshop</td><td>LBL407.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>bio basic</td><td>AB0028</td><td>Reconhecer o pó em 50% de etanol / 50% de H2O a 100 mg/ml. Armazenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bioshop</td><td>IPT002.5</td><td>Reconheça o pó em H2O a 1M e armazene a -20 °C.</td></tr><tr><td>Lisozima de ovo de galinha</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.10</td><td>Reconstituir em H2O a 50 mg/ml e armazenar a -80 &deg;C.</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered</td><td>salina life technologies</td><td>20012-027</td><td>A solução salina tamponada com fosfato comercial não é necessária, qualquer solução salina tamponada com fosfato padrão feita em laboratório é suficiente.</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Bioshop</td><td>SOD004.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Bioshop</td><td>TRS002.1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Bioshop</td><td>IMD508.100</td><td></td></tr><tr><td>Guanidina-HCl</td><td>Sigma</td><td>G3272</td><td>A qualidade deve ser superior a 98% de pureza.</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de níquel (II)</td><td>Bioshop</td><td>NIC700.500</td><td></td></tr><tr><td>Sua resina de ligação</td><td>EMD Millipore</td><td>69670-3</td><td>Armazenar em 20% de etanol 80% H2O a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Etanol anidro</td><td>Álcoois comerciais</td><td>P016EAAN</td><td>Dilua com água conforme necessário.</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.1</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio trihidratado</td><td>Bioshop</td><td>SAA305.500</td><td></td></tr><tr><td>albumina de soro bovino padrão</td><td>bio-rad</td><td>500-0206</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio de proteína Bio-rad concentrado de reagente de corante</td><td>bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiamina tetracético, sal dissódico di-hidratado</td><td>Fisher scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Bioshop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>7000 MW Tubo de diálise de pele de cobra</td><td>Thermoscientific</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ml</td><td>Este reagente não deve ser manuseado fora de um exaustor.</td></tr><tr><td>AcTEV protease</td><td>lifetechnologies</td><td>12575-015</td><td>A produção de sua própria protease TEV pode ser realizada usando (https://www.addgene.org/8827/) e purificada como na referência 17</td></tr><tr><td>Polietilenoglicol 3350</td><td>Bioshop</td><td>PEG335.1</td><td></td></tr><tr><td>polietilenoglicol 8000</td><td>Bioshop</td><td>PEG800.1</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp fundo plano 96 poços placa</td><td>ebioscience</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr> Espectrômetro de microplacas <tr><td>Sonicator</td><td>Fisher scientific</td><td>FB-120-110</td><td></td></tr><tr><td>Eon</td><td>Biotek</td><td>11-120-611</td><td>Este equipamento usa o software de análise de dados Gen5.</td></tr><tr><td>Software de análise de dados Gen5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dodecil sulfato de sódio</td><td>Bioshop</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>azul de bromofenol</td><td>Bioshop</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001</td><td></td></tr><tr><td>Colunas de dessalinização de proteínas</td><td>Thermoscientific</td><td>89849</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001</td><td></td></tr><tr><td>gel pré-moldado de poliacrilamida 12%</td><td>bio-rad</td><td>456-1045</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de coloração rápida</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td></td></tr><tr><td>Gel dock EZ imager</td><td>bio-rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de Amostra de Luz Branca</td><td>bio-rad 1708272</td><td>&nbsp;</td><td>Usado junto com o gerador de imagens EZ de gel para manchas azuis coomassie</td></tr><tr><td>Escada de proteína</td><td>bio-rad</td><td>1610375</td><td></td></tr></tbody></table>

produção simples e eficiente e purificação de rato mielina oligodendrocyte glicoproteína de encefalomielite autoimune experimental estudos

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica do sistema nervoso central (SNC), que se acredita ocorrer como resultado de respostas autoimunes direcionadas à mielina. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é o modelo animal mais comum de doença autoimune do SNC e é tipicamente induzida por imunização com peptídeos curtos que representam epítopos de células T CD4+ imunodominantes de proteínas de mielina. No entanto, as células B reconhecem a proteína não processada diretamente, e a imunização com peptídeo curto não ativa as células B que reconhecem a proteína nativa. Como ensaios clínicos recentes de terapias de depleção de células B na EM sugeriram um papel para as células B na condução de doenças em humanos, há uma necessidade urgente de modelos animais que incorporem o reconhecimento de células B do autoantígeno. Para este fim, geramos uma nova proteína de fusão contendo o domínio extracelular da versão de camundongo da glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG), bem como fusões N-terminais de uma marca His para fins de purificação e a proteína tiorredoxina para melhorar a solubilidade (etiqueta MOG). Um local de clivagem da protease do vírus da corrosão do tabaco (TEV) foi incorporado para permitir a remoção de todas as sequências de marcação, deixando apenas o domínio extracelular MOG1-125 puro. Aqui, descrevemos um protocolo simples usando apenas equipamento de laboratório padrão para produzir grandes quantidades deetiqueta MOG pura ou MOG1-125. Este protocolo gera consistentemente mais de 200 mg de proteínaMOG tag. A imunização coma etiqueta MOG ou MOG1-125 gera uma resposta autoimune que inclui células B patogênicas que reconhecem o MOG nativo do camundongo.

Uma vez que a purificação está completa, as amostras recolhidas nos passos 1.4, 2.1, 3.4, e o produto final da etapa 6.4 devem ser corridos num gel de proteína (Figura 3A). Tag MOG primeiro deve aparecer como uma banda de 31,86 kDa na amostra T O / N, mas não t 0, e deve ser a única banda no produto final puro. Para testar se a proteína com cauda tem MOG correctamente dobrada, a proteína com cauda MOG pode ser utiliz...

Descrevemos um protocolo simples usando apenas equipamentos básicos de laboratório para gerar e purificar grandes quantidades de uma proteína de fusão que contém glicoproteína de oligodendrócitos de mielina de camundongo. Esta proteína pode ser usada para induzir encefalomielite autoimune experimental impulsionada por células T e B.

Produção simples e eficiente e Purificação de rato Mielina Oligodendrocyte glicoproteína de encefalomielite autoimune experimental Estudos

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

O objetivo geral deste protocolo é gerar uma proteína baseada no domínio extracelular da glicoproteína da mielina de oligodendrócitos ou MOG, que pode ser utilizada para induzir encefalomielite autoimune experimental ou EAE. Este protocolo torna possível que qualquer laboratório produza a proteína MOG para utilizá-la como antígeno na indução de EAE. A principal vantagem deste protocolo é que ele não depende de equipamentos especializados para manipulação de proteínas, mas sim de equipamentos padrão encontrados em quase qualquer laboratório de imunologia.Bem, este protocolo foi otimizado para a proteína com marcação MOG com base na versão de camundongo; ele deve funcionar para outros sistemas de expressão de proteína MOG que incorporem uma alça de purificação. Inocule cinco mililitros de caldo esterilizado com o estoque glicerinado BL21 MOG tag e incube durante a noite a 37 graus Celsius e 200 rpm. Adicione 500 microlitros de ampicilina a 100 miligramas por mililitro a cada um dos dois frascos de 500 mililitros contendo 500 mililitros de LB estéril. Transfira um mililitro da cultura de crescimento noturno para cada um dos dois frascos de caldo LB.Incubar a 37 graus Celsius e 200 RPM por cinco horas ou até uma densidade óptica de 0,6. Uma vez atingida a densidade celular desejada, adicionar 0,5 mililitros de IPTG um molar a cada frasco de cultura. Incubar o frasco a 37 graus Celsius e 200 RPM por quatro horas e, em seguida, à temperatura ambiente e 75 RPM durante a noite.Distribua uniformemente as culturas entre frascos de 250 mililitros compatíveis com centrifugação de alta velocidade e mantenha os frascos sobre gelo a partir deste momento. Peline as células bacterianas a 22.000 ×g durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Re-suspenda e combine todos os pellets bacterianos em um volume total de 30 mililitros de tampão de lise.Transfira este volume para um tubo de 50 mililitros com fundo redondo, capaz de alta velocidade de centrifugação. Coloque este tubo em banho-maria a 30 graus Celsius por 30 minutos. Durante o tempo de incubação, agite o tubo duas vezes para ressuspender as células.Após a incubação, transporte o tubo para gelo e sonique a solução a 20 quilohertz e amplitude de 70%, pulsando por três segundos ligado e três segundos desligado, durante cinco pulsos; sonique a solução por seis séries completas de cinco pulsos, permitindo que a solução esfrie em gelo entre as séries. Em seguida, centrifugue a solução a 24.000 ×g por 15 minutos a quatro graus Celsius, depois ressuspenda o pellet em 30 mililitros do tampão A e incube a solução a quatro graus Celsius por três horas. Após a incubação, sonique novamente a solução em gelo como anteriormente, então adicione 17,2 gramas de cloreto de guanidina ao HCl na solução.Incube a amostra em gelo por uma hora para solubilizar a proteína com marcação MOG. Para carregar e equilibrar a resina de níquel, primeiro lave a resina adicionando 40 mililitros de água a cada tubo contendo a resina. Coloque os tubos horizontalmente sobre um agitador e deixe-os agitar por cinco minutos a quatro graus Celsius.Após a conclusão, centrifugue os tubos a 4500 vezes g durante oito minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante por pipetagem para evitar perturbar o pellet. Em seguida, adicione 40 mililitros de tampão de carga a cada tubo.Transfira os tubos para um agitador e deixe-os agitar por 15 minutos a quatro graus Celsius antes de centrifugar novamente como antes. Descarte o sobrenadante e adicione 40 mililitros do tampão B aos tubos. Transfira os tubos para um agitador e deixe-os agitar por cinco minutos a quatro graus Celsius antes de centrifugar os tubos com a resina mais uma vez.Para purificar a proteína com marcação MOG, transfira todo o volume da proteína solubilizada para o primeiro tubo contendo resina de níquel. Após a mistura, coloque o tubo na posição horizontal sobre um agitador a quatro graus Celsius por uma hora. Após centrifugar o tubo a 4500 ×g por oito minutos a quatro graus Celsius, transfira este sobrenadante para o segundo tubo de resina de níquel e incube como anteriormente.Enquanto isso, re-suspenda a resina de níquel no primeiro tubo em 40 mililitros de tampão de eluição e coloque o tubo na posição horizontal sobre um agitador a quatro graus Celsius por cinco minutos antes de centrifugar como anteriormente. Transfira o sobrenadante contendo a proteína com marcação MOG para um frasco de 250 mililitros rotulado como proteína purificada com marcação MOG. Mantenha este frasco a quatro graus Celsius.A cada etapa de eluição, reúna o sobrenatante resultante neste frasco. Adicione 40 mililitros de tampão de remoção ao níquel presente no primeiro tubo e coloque horizontalmente sobre um agitador durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Centrifugue o tubo, descarte o sobrenatante e recarregue o níquel recuperado como anteriormente.Uma vez concluído, prossiga com o segundo tubo da mesma forma que foi feito para o primeiro tubo. Um total de quatro ciclos de absorção da proteína solubilizada na resina de níquel carregada e eluição recuperará a maior parte da proteína. Corte aproximadamente 30 centímetros de tubo de diálise de pele de cobra.Fixe uma extremidade com uma pinça hemostática travável, dobrando a extremidade da pele de cobra três vezes e prendendo a extremidade dobrada com a pinça hemostática. Encha a pele de cobra com a proteína marcada MOG diluída. Em seguida, remova todas as bolhas de ar da pele de cobra forçando-as a sair pela extremidade aberta.Por fim, feche a outra extremidade do tubo usando um segundo hemostato com trava. Em seguida, encha um balde grande com um litro de tampão acetato 1x contendo guanidina 4 M. Coloque até duas seções de tubo de diálise contendo a proteína MOG tag no balde.Usando fita adesiva, prenda os hemostatos ao lado do balde para deixar espaço para que uma barra de agitação magnética gire livremente no fundo. Coloque o balde em uma sala a quatro graus Celsius sobre uma placa magnética com saia e ligue-a em uma velocidade de rotação lenta. A diálise leva no mínimo três dias para reduzir gradualmente a quantidade de guanidina no tampão.Verifique regularmente para garantir que o tubo permaneça intacto e que as extremidades estejam firmemente fechadas. Após quatro a cinco horas, adicione um litro de tampão acetato 1x ao balde de diálise. Repita este processo a cada quatro a cinco horas por um total de três vezes, resultando em um volume total de quatro litros no balde.Após descartar metade do tampão no balde, reabasteça com um litro de tampão acetato 1x e monte o tubo e a barra de agitação. Por fim, substitua todo o volume de quatro litros no balde por quatro litros de tampão acetato 1x fresco e deixe sob agitação por quatro a cinco horas. Para melhores resultados, realize este passo no dia da concentração da proteína.Para concentrar a proteína com marcação MOG, forre uma placa com papel alumínio e cubra o papel alumínio com PEG 3350 e PEG 1000 em uma proporção de um para um. O PEG 3350 pode ajudar a prevenir a agregação proteica durante a concentração e é um crioprotetor eficaz. Coloque o tubo de pele de cobra contendo a proteína com marcação MOG sobre o papel alumínio e cubra com PEG 8000.Deixe repousar à temperatura ambiente e verifique o volume regularmente até que o volume seja igual ou inferior ao volume final estimado. Se a cápsula ficar excessivamente saturada com água durante o processo de concentração, monte uma nova bandeja com folha de alumínio e PEG. Amostras de proteína coletadas ao longo do protocolo de purificação podem ser analisadas em gel de eletroforese SDS-PAGE para confirmar a pureza.Um gel representativo é exibido, mostrando a marcação de MOG altamente purificada em 31,86 kilodaltons. Para verificar se a proteína com marcação de MOG foi corretamente dobrada, avaliou-se, por citometria de fluxo, a ligação da proteína com marcação de MOG a células B CD19 positivas, CD4 negativas, provenientes de linfonodos de camundongos C57 black six selvagens ou de camundongos IgH MOG que expressam uma cadeia pesada de imunoglobulina específica para a proteína MOG. Este protocolo exige um mínimo de 10 dias do início ao fim.Durante todo o procedimento de isolamento, é importante acompanhar a proteína e lembrar-se do que deve ser mantido e do que deve ser descartado. Não se esqueça de que o sulfato de níquel hexaidratado, utilizado no carregamento da resina de níquel, é extremamente perigoso e devem ser tomadas precauções para evitar inalação ou contato com a pele ou os olhos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir e purificar sua própria proteína com marcação MOG.Uma vez purificada, a proteína com marcação MOG pode ser emulsionada em adjuvante completo de Freund e utilizada como imunizante para induzir EAE. A EAE induzida pela proteína com marcação MOG pode ser usada para estudar o envolvimento de múltiplos tipos celulares, como células CD4 ou CDAT ou células B, na autoimunidade do sistema nervoso central. Diferentemente do peptídeo curto, que é restrito ao MHC, o antígeno proteico pode ser utilizado em qualquer linhagem de camundongos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra uma técnica de homogeneização eficiente para gerar uma emulsão antigénio-adjuvante para induzir encefalomielite autoimune experimental (EAE) num modelo murino. A emulsão contém um autoantígeno - glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG) - na fase aquosa, cercada por uma fase oleosa contínua composta por uma bactéria patogênica inativada. A emulsão garante uma liberação sustentada de antígenos para uma resposta imune prolongada.

Preparando uma emulsão adjuvante de antígeno para induzir encefalomielite autoimune

O vídeo demonstra a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo injetando uma combinação de glicoproteínas de oligodendrócitos de mielina e Mycobacterium tuberculosis inativado. O modelo permite que os pesquisadores estudem os mecanismos da doença e testem intervenções terapêuticas.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

Este vídeo demonstra o método de indução de encefalomielite autoimune experimental (EAE) injetando peptídeos derivados de mielina com um adjuvante para ativar células T autorreativas, que migram para o cérebro. A toxina da coqueluche é administrada para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que essas células T e outras células imunológicas entrem no cérebro. Essas células imunes causam desmielinização, levando ao comprometimento da transmissão nervosa e ao...

Geração de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

Neste vídeo, um modelo de camundongo com esclerose múltipla é estabelecido usando encefalomielite autoimune experimental (EAE). O camundongo é injetado com uma emulsão contendo um peptídeo neuronal e um adjuvante, desencadeando uma resposta imune que ativa as células T autorreativas. Isso é seguido por uma injeção de toxina coqueluche (PTX) para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que as células T autorreativas se infiltrem no cérebro. Essa infiltração inicia uma...

Fonte: Jain, R. W., et al. Produção e purificação simples e eficientes de glicoproteína de oligodendrócitos de mielina de camundongo para estudos experimentais de encefalomielite autoimune. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra o isolamento e purificação do MOGtag, uma glicoproteína recombinante de oligodendrócitos de mielina (MOG) usada em estudos de encefalomielite autoimune experimental (EAE). O protocolo envolve lise bacteriana, sonicação, centrifugação e cromatografia de afinidade de...

Isolamento e purificação de glicoproteínas de oligodendrócitos de mielina recombinante

Encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo animal estabelecido de esclerose múltipla. C57BL / 6 são imunizados com mielina de oligodendrócitos glicoproteína (MOG) peptídeo 35-55 (MOG 35-55), o que resulta em uma paralisia flácida ascendente causada por células imunes autorreactivas no sistema nervoso central. Protocolos para indução e monitoramento de doenças serão discutidos.

Mielina Oligodendrocyte glicoproteína (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induzida Encefalomielite Auto-imune Experimental (EAE) em murganhos C57BL / 6

Descrevemos o isolamento de Fima de oligodendrócitos mouse principal, que permite o isolamento das células para cultura em vitro rápido e específico.

Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

O presente protocolo descreve a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo utilizando glicoproteína de oligodendrócitos de mielina e monitorando o processo da doença usando um sistema de pontuação clínica. Os sintomas experimentais relacionados à encefalomielite autoimune são analisados usando tomografia microcomputadorizada de fêmur de camundongo e teste de campo aberto para avaliar o processo da doença de forma abrangente.

Indução e Diversos Indicadores de Avaliação da Encefalomielite Autoimune Experimental

Para induzir encefalomielite autoimune experimental, um modelo animal de esclerose múltipla, os ratos são imunizados com uma emulsão de água em óleo contendo um autoantígeno e adjuvante completo de Freund. Embora existam vários protocolos para a preparação dessas emulsões, um protocolo de homogeneização rápido, simples e padronizado para a preparação de emulsões é apresentado aqui.

Um método de homogeneização rápido, simples e padronizado para preparar emulsões de antígenos/adjuvantes para induzir encefalomielite autoimune experimental

Até o momento, os protocolos para o isolamento simultâneo de todos os principais tipos celulares residentes no sistema nervoso central do mesmo camundongo são uma demanda não atendida. O protocolo mostra um procedimento aplicável em camundongos ingênuos e experimentais com encefalomielite autoimune para investigar redes celulares complexas durante a neuroinflamação e, simultaneamente, reduzir o número necessário de camundongos.

Isolamento Simultâneo dos Principais Tipos Celulares Residentes no Sistema Nervoso Central de Camundongos Adultos com Encefalomielite Autoimune

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo animal de esclerose múltipla (EM), que compartilha com a doença humana uma resposta autoimune humoral robusta. Aqui, relatamos um protocolo ELISA simples e flexível para quantificar autoanticorpos no soro de camundongos imunizados com EAE.

Quantificação de anticorpos autorreativos em camundongos após encefalomielite autoimune experimental

Aprenda a produzir e purificar a proteína MOG de camundongo para induzir encefalomielite autoimune experimental. Este método acessível utiliza equipamentos padrão de laboratório de imunologia.

Produção simples e eficiente e Purificação de rato Mielina Oligodendrocyte glicoproteína de encefalomielite autoimune experimental Estudos (Vídeo) | JoVE Journal

Produção simples e eficiente e Purificação de rato Mielina Oligodendrocyte glicoproteína de encefalomielite autoimune experimental Estudos

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