Determinação da superfície celular Relativa e Expressão total de canais recombinante de iões utilizando Citometria de Fluxo

O objetivo geral deste método é quantificar a expressão na superfície celular de proteínas de membrana utilizando um ensaio fluorescente espaçado. A principal vantagem desta técnica é que os ensaios de citometria de fluxo fornecem pontos finais quantificáveis em grandes volumes de células vivas em um único experimento. As implicações desta técnica estendem-se ao diagnóstico e à terapia de arritmias ventriculares cardíacas, pois essas patologias estão frequentemente associadas a mutações genéticas que causam defeitos no tráfego de canais iônicos cardíacos.

Em geral, indivíduos novos neste método têm dificuldade em identificar um sítio de inserção extrorsal adequado para o epítopo que não prejudique a função da proteína e gere um sinal fluorescente forte na presença do anticorpo conjugado. Demonstrará este procedimento Benoite Bourdin, assistente de pesquisa do meu laboratório. Para começar, marque duplamente as construções de DNA com mCherry na extremidade C intracelular.

Além disso, expresse um epítopo de hemaglutinina voltado para o exterior celular, que pode ser medido usando um anticorpo fluorescente para estimar a expressão na superfície celular de proteínas de membrana. Em seguida, cultive uma placa de células TSA201 utilizando técnicas padrão até atingirem 90% de confluência. Para cada amostra, prepare os reagentes de transfeção em dois tubos.

Prepare um tubo de 1,5 mililitro com quatro microgramas de DNA e 250 microlitros de meio com soro reduzido, e um segundo tubo com 10 microlitros do reagente de transfeção mediado por lipossomos e 250 microlitros de meio de cultura com soro reduzido. Misture suavemente os dois tubos e incube-os por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, combine suavemente o conteúdo do tubo um e do tubo dois e incube os complexos de DNA com lipossomos por 20 minutos à temperatura ambiente.

Adicione os complexos às células cultivadas e agite suavemente o recipiente de cultura. Devolva o recipiente a 37 graus Celsius e a uma atmosfera com 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Vinte e quatro horas após a adição do reagente de transfeção, remova o meio do recipiente de cultura e lave cuidadosamente as células com 400 microlitros de Tripsina-EDTA previamente aquecida.

Em seguida, adicione 400 microlitros de tripsina-EDTA e incube a placa por cinco minutos para permitir que as células se desprendam da placa. Após o desprendimento, interrompa a digestão enzimática adicionando um mililitro de meio de cultura frio sem penicilina nem estreptomicina às células. Pipete gentilmente o meio sobre a placa de quatro a cinco vezes para remover todas as células da superfície.

Em seguida, colete as células em tubos estéreis de 1,5 mililitro e coloque-as imediatamente no gelo. Para as próximas etapas, utilize soluções geladas e mantenha as células a quatro graus para evitar a internalização do epítopo de superfície. Além disso, reduza a exposição das células à luz para limitar o fotodesvanecimento do sinal fluorescente.

Em seguida, centrifugue os tubos para sedimentar as células. Então, aspire e descarte cuidadosamente o sobrenatante resultante. Re-suspenda o sedimento para preparar uma suspensão simples de células usando um mililitro de PBS.

Em seguida, centrifugue brevemente os tubos. Peline e ressuspenda as células mais uma vez para remover completamente o meio de cultura. A seguir, ressuspenda o pellet celular em 600 microlitros de PBS.

Meça a concentração celular e ajuste-a para pelo menos três milhões de células por mililitro. Em seguida, divida as células em novos tubos de 1,5 mililitro. Certifique-se de incluir os controles apropriados para discriminar a marcação específica da não específica, bem como para marcação extracelular e também para marcação intracelular.

O anticorpo controle isotópico ajudará a avaliar o nível de marcação de fundo e deve corresponder ao anticorpo primário, isótopo apropriado e fluoróforo. É importante usar o anticorpo controle isotópico e o anticorpo fluorescente na mesma concentração. Para estimar a expressão na superfície celular de proteínas de membrana, primeiramente marque apenas o epítopo HA voltado para o exterior celular utilizando um anticorpo conjugado a um fluoróforo.

Em seguida, adicione um anticorpo monoclonal anti-HA conjugado com FITC a cinco microgramas por mililitro ao tubo. Vortexe as células brevemente e, então, incube-as em uma plataforma agitadora no escuro. Retire as células do escuro e adicione 900 microlitros de PBS.

Em seguida, centrifugue o tubo para sedimentar as células e aspire o sobrenadante. Depois, lave as células ressuspendendo o sedimento em um mililitro de PBS e vortexando brevemente as células. Em seguida, repita a etapa de centrifugação para sedimentar novamente as células.

Repita esta etapa de lavagem um total de três vezes para remover qualquer anticorpo não ligado. Após a lavagem final, re-suspenda as células em 500 microlitros de PBS e transfira a suspensão simples de células para um tubo de citometria de fluxo de cinco mililitros. Mantenha as células no escuro a quatro graus Celsius até que a amostra seja analisada.

Para estimar a expressão intracelular de proteína total, marque em seguida as células permeabilizadas. Isso é realizado usando um protocolo semelhante ao do marcamento extracelular, mas com a adição de um tampão de permeabilização celular à base de saponina. Peliculize as células, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 100 microlitros de solução de fixação e permeabilização diretamente do estoque preparado.

Incube as células no escuro a quatro graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de permeabilização e lavagem recém-preparado e vortexie brevemente as células. A seguir, centrifugue as células e lave-as mais duas vezes utilizando o tampão de permeabilização e lavagem.

Em seguida, adicione o anticorpo monoclonal anti-HA conjugado com FITC a 5 microgramas por mililitro e 100 microlitros do tampão de lavagem com permeabilização. Vortexe brevemente as células e incube-as no escuro a quatro graus Celsius por 30 minutos. A seguir, adicione 100 microlitros do tampão de lavagem com permeabilização.

Pelotize as células e lave-as três vezes em 100 microlitros do mesmo tampão conforme mostrado anteriormente. Após a lavagem final, reconstitua as células em 500 microlitros de PBS e transfira a suspensão de células únicas para um tubo de citometria de fluxo de cinco mililitros. Analise as células não permeabilizadas e permeabilizadas no citômetro de fluxo no mesmo dia.

Para começar, inicie o software de análise de citometria de fluxo e importe os arquivos fcs criados durante a citometria de fluxo. Clique na primeira amostra e inicie o processo de seleção na plotagem de dispersão lateral versus dispersão frontal. Em seguida, desenhe o gate P1 utilizando o ícone de elipse ao redor das células viáveis para eliminar qualquer detrito, células mortas ou agregados.

Em seguida, gere o gráfico de contorno do parâmetro do tubo de fluorescência mCherry versus FITC. Defina a porta P2 ao redor das células positivas para FITC e mCherry e a porta P3 ao redor da população celular negativa para fluorescência. Em seguida, selecione as portas P2 e P3 e clique no ícone de adicionar estatísticas na janela original do ambiente de trabalho.

Clique em contagem e depois clique em média. Finalmente, aplique os parâmetros de gates e estatísticas a todas as amostras analisadas pelo citômetro. Este protocolo foi utilizado para caracterizar o papel da N-glicosilação na expressão total e na superfície celular de CaV Alpha 2 Delta 1 em células TSA201.

Para acessar a expressão da proteína na superfície celular, a proteína HA foi medida em células não permeabilizadas que tinham locais de N-glicosilação interrompidos em quatro locais, 16 locais ou em nenhum local. Os níveis de FITC foram fortes no tipo selvagem e nas células com N-glicosilação interrompida em quatro locais, mas apenas níveis de fundo foram detectados nas células com 16 locais interrompidos. Nas células permeabilizadas, a fluorescência de FITC aumentou em todas as condições, indicando que todas as proteínas transfectadas, marcadas com HA, CaV Alpha 2 Delta 1, foram coradas e detectadas pelo anticorpo anti-HA conjugado à FITC.

Além disso, os níveis de fluorescência da mCherry foram semelhantes em células permeabilizadas e não permeabilizadas, indicando que a permeabilização não altera o sinal relativo da mCherry. Ensaios realizados após a permeabilização celular mostraram que a expressão total de proteínas nas células com 16 locais interrompidos também foi significativamente reduzida, seja inferida pela fluorescência FITC em células permeabilizadas ou pela fluorescência constitutiva da mCherry medida em células não permeabilizadas e permeabilizadas. Além deste procedimento, podem ser realizados registros fisiológicos adicionais com o objetivo de correlacionar expressão e função de canais iônicos.

Essa técnica também abre caminho para pesquisadores da área médica estudarem o impacto de mutações genéticas, modificações pós-traducionais, microRNAs, pequenas GTPases e o papel das chaperonas no tráfego de proteínas de membrana expressas em células recombinantes ou nativas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a transfeção de DNA em células recombinantes, de como corar células NTAC e permeabilizadas, bem como de como realizar a análise de dados nas amostras. Não se esqueça de que trabalhar com células vivas exige precauções, como trabalhar na fluxo laminar para a transfeção e usar luvas ao manipular produtos químicos.