Name: Determinação da superfície celular Relativa e Expressão total de canais recombinante de iões utilizando Citometria de Fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Aprenda a quantificar a expressão de proteínas de membrana na superfície celular usando citometria de fluxo. Este método permite analisar grandes volumes de células vivas em uma única experiência, auxiliando no estudo de arritmias cardíacas.

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Agradecemos ao Sr. Serge Sénéchal e ao Dr. Jacques Thibodeau por compartilharem seus conhecimentos e nos concederem acesso à sua citometria de fluxo e plataforma de classificação de células. Este trabalho foi concluído com a concessão de 130256 de funcionamento dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde, uma bolsa de ajuda da Fundação Canadense de Coração e AVC e o apoio da "Fondation de l'Institut de Cardiologie de Montréal" para LP

1. construções Duplamente Tagged DNA <ol><li> Inserir o epitopo de HA (YPYDVPDYA) no ligante extracelular de Ca V α2δ1 entre D676 e R677 por mutagénese dirigida ao local (Figura 3B) 20. Use gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC Atacante primer e Reverso acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC primer. </li><li> Subclone da sequência de ADNc da HA etiquetado Ca V α2δ1 no vector de expressão de mamífero pmCherry-N1 concebido para expressar a proteína fundida com o terminal N de mCherry entre os locais SacI e SalI (Figura 3B) 20. NOTA: A função de canal apropriado precisa ser testado com a construção controle usando métodos eletrofisiológicos padrão 24. </li></ol> 2. mediada por lipossomas transfecção transiente (30 min, todas as etapas são realizadas sob Fluxo Laminar Hood) <ol><li> Dia 1: Placa de meio milhão de células TSA-201 (ou Hekt) emPlacas de cultura de 35 mm com meio essencial 2 mL de Dulbecco de alta glucose mínimo (DMEM-HG), suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e médio (PS) cultura de penicilina-estreptomicina a 1%. Contagem de células utilizando um hemacitómetro padrão. Avaliar a viabilidade celular de uma fracção da amostra de células utilizando azul de tripano. Placa células suficientes para alcançar 90% de confluência no momento da transfecção. </li><li> Dia 2: Mudança de meio de cultura com 2 ml de meio de cultura fresco pré-aquecido (37 ° C) sem PS. </li><li> Para cada amostra de transfeco, preparar dois tubos de 1,5 ml. No tubo 1, dilui-se 4 mg de DNA em 250 ul de meio de soro reduzido. No tubo 2, misturar 10 mL de reagente de transfecção mediada por lipossomas com 250 de meio de cultura em soro reduzido ul. Misture suavemente o reagente de transfecção antes do uso. </li><li> Incubar durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Combinar o conteúdo de um tubo e o tubo 2, misturar suavemente e incuba-se, pelo menos, 20 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicione os lipossomas / DNA complexos para as células cultivadas e agite levemente o prato de cultura para misturar. </li><li> Incubar a 37 ° C sob 5% de atmosfera de CO2 durante 24 h. </li></ol> 3. Coloração de células para citometria de fluxo (3 h) <ol><li> Preparando amostras de células <ol><li> Dia 3: Remover o meio a partir do prato de cultura com cuidado e lavar as células com 400 ul de pré-aquecido (37 ° C) de 0,05% de tripsina-EDTA 1x (ácido etilenodiaminotetracético). </li><li> Adicionar 400 ul de tripsina-EDTA e incubar o prato a 37 ° C sob 5% de CO2 durante 5 min para permitir que as células a separar a partir do prato. </li><li> Parar a digestão enzimática por adição de 1 ml de meio de cultura frio sem PS e lavar todas as células da superfície pipetando suavemente 4-5 vezes. Evitar o excesso de digestão e excesso de pipetagem para reduzir a morte celular. </li><li> Recolher as células em tubos de 1,5 ml e coloque imediatamente em gelo. Utilizar soluções gelada e manter as células a 4 ° C para evitar a internalizaçãode antígenos de superfície. Diminuir iluminação para limitar o fotobranqueamento do sinal fluorescente. </li><li> tubos de centrifugação a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar cuidadosamente e descartar o sobrenadante. </li><li> Re-suspender o sedimento em 1 ml de solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) para preparar uma suspensão de célula única. </li><li> Resumidamente vortex os tubos muito suavemente e repita os passos 3.1.5 e 3.1.6 para remover completamente o meio de cultura. </li><li> Re-suspender o sedimento em 600 ul de 1x PBS e ajustar a concentração de células a um mínimo de 3 X 10 6 células / ml. </li><li> Dividir as células em dois novos tubos de 1,5 ml para coloração intracelular e extracelular. Incluir controlos adequados para discriminar coloração específica de coloração não específica. NOTA: O anticorpo de controlo de isotipo ajuda a avaliar o nível de coloração de fundo e idealmente deve corresponder de cada anticorpo primário espécies hospedeiras, isótipo e fluoróforo. Use de controlo de isotipo e o anticorpo conjugado ao mesmoconcentração de proteína. </li></ol></li></ol><img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/54732/54732table1.jpg" /> Tabela 1: citometria de fluxo amostras de controlo experimento para não-permeabilizadas e permeabilizadas células Cada experiência deve incluir os seguintes controlos negativos:. (1) células não transfectadas (sem anticorpo, com o isotipo ou com o anticorpo conjugado). (2) As células transf ectadas com a proteína de interesse subclonado num plasmídeo sem constitutiva fluorocromo intracelular fluorescente (pCMV- Ca V α2δ1-HA) ou com a construção duplamente etiquetado (pmCherry-Ca V α2δ1 e incubados sem anticorpo, com o isotipo ou com o anticorpo conjugado). controles de cores individuais são usados ​​para a compensação de sobreposição de emissão de fluorocromo. Os mesmos controles são executados por não permeabilizadas e permeabilizadas condições em cada série de experimentos. <ol start="2"><li> A coloração da superfície celular da IntactAs células vivas <ol><li> Alíquota 1 X 10 6 células / 100 uL em tubos de 1,5 ml. </li><li> Adicionar o anticorpo monoclonal conjugado com FITC anti-HA a 5 ug / ml e, de vórtice antes da incubação das células sobre uma plataforma oscilante (200 rpm) no escuro a 4 ° C durante 45 min. NOTA: A concentração óptima de anticorpo foi determinada em experiências preliminares de titulação (Figura 4). </li><li> Remover as células a partir do escuro e adicionar 900 ul de 1x PBS / tubo. Centrifuga-se a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de PBS 1x, vortex e centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Repetir a lavagem (passo 3.2.4) duas vezes para remover qualquer anticorpo não ligado. Se for utilizado um anticorpo primário não conjugado, incubar com o anticorpo secundário adequado. </li><li> Após a última lavagem, ressuspender as células em 500 ul de 1x PBS e transferir a suspensão de célula única em 5 ml de tubos de citometria de fluxo. Mantenha o celulars no escuro a 4 ° C até à execução da amostra. </li><li> Execute as amostras em um citômetro de fluxo. Para melhores resultados, analisar as células no citômetro de fluxo, logo que possível eo mais tardar 24 horas depois. </li></ol></li><li> A coloração intracelular: Fixação, permeabilização, e coloração <ol><li> Alíquota 1 X 10 6 células / 100 uL em tubos de 1,5 ml e centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Descarte as células sobrenadante e ressuspender em 100 ul de solução de fixação-permeabilização diretamente do estoque. </li><li> Incubar no escuro a 4 ° C durante 20 min. </li><li> Adicionar 100 ul de tampão de permeabilização de lavagem 1x preparado de fresco (diluído 10x tampão de permeabilização de lavagem em H2O destilada). células de vórtice e de sedimentos, utilizando uma centrífuga de mesa a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar e desprezar o sobrenadante. </li><li> Repita os passos 3.3.4 e 3.3.5. </li><li> Adicionar anticorpos anti-HA monoclonal conjugado com FITC em 5ug / ml em 100 ul de 1x tampão de permeabilização de lavagem e, de vórtice antes de incubar as células no escuro a 4 ° C durante 30 min. NOTA: A coloração intracelular é realizado seguindo o mesmo procedimento que o utilizado para a coloração da superfície celular. permeabilização celular mediada por A saponina é, no entanto, um processo rapidamente reversíveis, por isso, é importante substituir 1x PBS com tampão 1x Perm / Wash para manter as células na presença constante de saponina durante a coloração intracelular. </li><li> Remover as células a partir do escuro e adiciona-se 100 ul de tampão de permeabilização de lavagem. Centrifuga-se a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 100 ul de tampão de permeabilização de lavagem, vortex e centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Repetir a lavagem (passo 3.3.9) mais uma vez para remover qualquer anticorpo não ligado. </li><li> Após a última lavagem, ressuspender as células em 500 ul de 1x PBS e transferir o pecadosuspensão de células para GLE 5 mL fluxo citometria de tubos. Manter as células no escuro a 4 ° C até à injecção de amostra num citómetro de fluxo. </li><li> Execute as amostras em um citômetro de fluxo. Execute as amostras fixadas no citômetro o mais rapidamente possível, mas o mais tardar uma semana após a coloração. Executar as células não-permeabilizadas e permeabilizadas no mesmo dia. </li></ol></li></ol> 4. Citometria de Fluxo <ol><li> Citômetro de fluxo celular Sorter diário Setup <ol><li> Ligue o software citometria de fluxo. Antes de experimentar, calibrar e configurar o citômetro de fluxo classificador de células para garantir o melhor desempenho do instrumento (ou seja, laser e óptica estão realizando a especificação, o laser e célula de fluxo estão bem alinhados) usando esferas de configuração do instrumento. </li><li> Utilizar o bocal 100 um com bainha pressão de 20 psi. NOTA: O bico não tem de ser alterada em um banco de citometria de fluxo. </li><li> Ajustar a taxa de fluxo do citômetro de acordo com o FABRICAÇÃOespecificação er. Excessivamente altas taxas de fluxo vai diminuir a sensibilidade na detecção de variações na fluorescência. </li><li> Escolha azul (488 nm para excitar Fluoresceína Isothiocayanate ou FITC) e amarelo-verde (561 nm para excitar mCherry) lasers. Recolhe níveis de fluorescência FITC e com uma mCherry 530/30 nm e 610/20 nm com um filtro de passagem de banda, respectivamente. </li><li> Adquirir a dispersão para a frente (FCS) versus dispersão lateral (SSC) gráfico de pontos para as células não coradas utilizando escala linear. Ajustar a amplificação de cada detector para visualizar as células no quadrante inferior esquerdo do gráfico de pontos. </li></ol></li><li> Reading amostra de células intactas não-permeabilizadas <ol><li> Definir a P1gate para células não-permeabilizadas vivo delineando uma forma livre em torno das células a serem analisados ​​excluindo os detritos celulares e agregados de células, limitando assim o sinal de fluorescência para células intactas. NOTA: Live / corantes de exclusão mortos pode ser usado para facilitar a colocação portão em células vivas. Definir 10.000 eventos para gravarna P1 portão de parada. Defina esta opção para um maior número de eventos se for necessário. </li><li> Adquirir mCherry contra o traçado de contorno de dois parâmetros FITC para detectar autofluorescência de linha de base de células não coradas. Use escala bi-logarítmica para mostrar valores negativos e melhorar a resolução entre as populações 25. Ajustar a tensão de cada detector para definir as células não coradas negativas dentro da porção inferior das primeiras dez unidades de log as parcelas de intensidade de fluorescência. </li><li> Adquirir todas as amostras não permeabilizadas intactas usando as configurações estabelecidas em 4.1.5 e 4.1.6 e recolher FSC, SSC e sinais nos detectores de fluorescência. </li><li> Exportação e salvar arquivos * .fcs a ser utilizado para análise de citometria de fluxo de software de análise. </li></ol></li><li> Reading amostra de células permeabilizadas <ol><li> Mova o portão P1 para selecionar células vivas nas amostras permeabilizadas e ajustar FSC e tensão SSC como mostrado na 4.1.5 e 4.1.6. </li><li> Adquirir todas as amostras permeabilizadas e recolher FSC, SSC and sinais em detectores de fluorescência. </li><li> Exportação e salvar arquivos * .fcs a ser utilizado para análise de citometria de fluxo de software de análise. </li></ol></li><li> Análise de dados <ol><li> Lançar a citometria de fluxo arquivos de software de análise e importação * .fcs salvos em 4.2.4 e 4.3.3. </li><li> Clique no primeiro exemplo listado na janela do espaço de trabalho. Uma nova janela com o nome do tubo número ID é aberto automaticamente. Inicie o processo gating na trama de SSC contra FSC. Desenhe um portão (P1), utilizando o ícone Elipse em torno de células vivas e eliminar quaisquer detritos, células mortas, ou agregados que têm dispersão para a frente diferente e dispersão lateral do que as células vivas </li><li> Para desenhar o gráfico de contorno de dois parâmetros do mCherry (eixo y) versus FITC (eixo-x) a intensidade de fluorescência das células vivas, clique primeiro no eixo-x e escolher o FITC-A do canal e, em seguida, clique no y -axis e escolher o PE-mCherry-a do canal. Clique no ícone &quot;Quad&quot; para posicionar o marcador quadrante na extremidade de umcélulas utofluorescent em cada canal de fluorescência. NOTA: A porta definido em torno das células FITC e mCherry positivos é a porta P2. A população de células negativa fluorescência é referido como o portão P3. Ver Figura 5 para o método de propagação representativa usada neste artigo. </li><li> Selecione P2 e P3 portões e clique no ícone &quot;Adicionar Estatísticas&quot; na janela área de trabalho original. Clique em &quot;Conde&quot; (número de células positivas) e clique em &quot;média&quot; (Média de Fluorescência intensidade de cada fluorocromo) ou &quot;Median&quot; (mediana da intensidade da fluorescência de cada fluorocromo) estatísticas entre a lista de opções. Clique no ícone &quot;Adicionar Statistics&quot; novamente. Todos estes valores são automaticamente transferidos para a janela área de trabalho original. NOTA: O &quot;significam&quot; só é usado se a intensidade de fluorescência segue uma distribuição normal. Em qualquer outro caso, clique na aba &quot;Median&quot;. MFI, portanto, poderia referir-se a média de fluorescência IntensitY ou mediana da intensidade de fluorescência. NOTA: O próximo passo é a aplicação de parâmetros e estatísticas dos portões para todas as amostras testados pelo citômetro. </li><li> Na janela do espaço de trabalho, use o mouse para arrastar e soltar os parâmetros portões e estatísticas sobre a linha marcada todas as amostras. </li><li> Gerar um relatório lote de lotes bidimensionais de contorno (mCherry vs FITC) e histogramas (contagem de células versus intensidade de fluorescência) para células não permeabilizadas e permeabilizadas (Figuras 6A - B). </li><li> A partir das estatísticas geradas no passo 4.4.4, calcular a intensidade de fluorescência média (IFM) de cada fluorocromo para as células coradas. A partir deste valor, subtrair o valor MFI obtido a partir de células não coradas para quantificar a expressão de superfície e total da proteína de interesse. </li><li> Informar os valores ΔMFI para cada fluoróforo (mCherry e ITCF) (Figura 6C - D). Normalizar o ΔMFI medido para o Ca <sub&gt; V α2δ1 construir mutantes para o valor obtido para ΔMFI mCherry FITC e com o construto WT. NOTA: O valor absoluto da intensidade de fluorescência pode variar acentuadamente dependendo do lote de anticorpos e as capacidades técnicas de cada técnico de laboratório, pelo que é necessário para normalizar a intensidade de fluorescência da construção mutante utilizando a construção WT. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este ensaio baseado em citometria de fluxo foi aplicado com sucesso à medição dos níveis relativos de superfície total e celular de formação de poros marcados com fluorescência e subunidades associadas de canais de cálcio dependentes de voltagem14,22,26. É melhor usado ao investigar o impacto de mutações genéticas e, portanto, requer que a intensidade de fluorescência intrínseca da construção de tipo selvagem marcada com fluorescência seja pelo menos 10 a 100 vezes maior do que a intensidade de fluorescência d...

Este documento proporciona um ensaio fiável para relatar a expressão na superfície celular relativa das proteínas de membrana, tais como canais de iões expressos em células recombinantes que utilizam a tecnologia de citometria de fluxo existente. canais de iões são proteínas de membrana de poros de formação que são responsáveis ​​por controlar os sinais eléctricos por gating o fluxo de iões através da membrana celular. Eles são classificados pelo mecanismo de ativação, natureza, e seletividade de espécies de íon de trânsito através do poro onde eles estão localizados. Nos níveis celulares e teciduais, os fluxos de iões macroscópicas através de canais iónicos são o produto de imóveis 1 biofísico (gating e permeação), bioquímicos (fosforilação) e biogênese (síntese, glicosilação, tráfico e degradação). Cada um destes processos é único para cada tipo de canais iónicos e é optimizado para desempenhar o papel fisiológico do canal de iões. Consequentemente, as alterações em qualquer um destes processos afinadas através de umherdada ou uma modificação genética, muitas vezes referida como &quot;canalopatia&quot;, pode ser prejudicial para a homeostase celular. É importante salientar que entregar a quantidade &quot;certa&quot; dos canais de íons na superfície da célula é fundamental para a homeostase celular. Mesmo pequenos aumentos (ganho de função) e pequenas diminuições (perda de função) em actividade de canal iónico tem o potencial de causar uma patologia grave ao longo da vida. Os defeitos na superfície da célula de entrega dos canais de iões maduros é um determinante importante em numerosos canalopatias, tais como a fibrose cística (CFTR canal de iões) 2 e arritmias cardíacas de forma a síndrome de QT longo (canais de potássio cardíacos) 3. Canalopatias estão associadas à morte súbita cardíaca 4. A prevalência mundial atual de todos os canalopatias cardíacas é pensado para ser, pelo menos, 1: 2,000-1: 3.000 por pessoa 5 e são responsáveis por cerca de metade da súbita por arritmia ca morte cardíacases 6. Disfunção cardíaca na voltagem-sódio, potássio, cálcio e canais iônicos seletivos são conhecidos por desempenhar um papel fundamental neste processo. O 1.2 canais de cálcio voltagem-L-type Ca V é necessária para iniciar a contração do músculo do coração sincronizados. A cardíaca L-type Ca V 1.2 canal é um complexo de proteínas multi-subunidade composta de o principal formador de poros Ca subunidade V α1 e Ca V ß e Ca V α2δ1 subunidades auxiliares 7-12. Note-se que o complemento total de subunidades auxiliares é necessário para produzir funcionais Ca V 1.2 canais na membrana plasmática e interacções dinâmicas entre as subunidades são essenciais para suportar a função eléctrica normal do coração 13. Ca V SS promove a expressão na superfície celular de Ca V 1.2 canais através de um não-covalente nanomolar de interacção hidrófoba 14. A co-expressão do Ca V Wi subunidade α2δ1th Ca V ß-bound Ca V α1 estimula a expressão corrente de pico (de 5 a 10 vezes) e promove a ativação do canal em voltagens mais negativas. Ganho de função mutações da subunidade formadora de poros Ca V 1.2 têm sido associados com uma forma de arritmias ventriculares chamado síndroma do QT longo de 15 enquanto que uma série de mutações pontuais nas três subunidades principais que formam o tipo L-Ca V canal 1.2 foram identificados em indivíduos que sofrem de arritmias de forma a síndroma QT curto 16,17. canais iônicos são proteínas de membrana que podem ser investigados a partir de um ponto de vista bioquímico (química de proteínas), ou usando ferramentas eletrofisiológicos (máquinas geradoras de corrente) e muitas vezes usando estas abordagens complementares. Eletrofisiologia, em particular de células inteiras patch-fixação, é uma abordagem adequada para elucidar a função de canais iônicos 15, mas não pode resolver modificações no tráfego de proteínas a partir de mudanças em seu biofísicopropriedades. Protein Chemistry tem, no entanto, muitas vezes limitado uso, devido à relativamente baixa expressão de proteínas de membrana grande em relação às proteínas solúveis menores. métodos de alto rendimento robustos usando leitura de fluorescência precisam ser desenvolvidos, a fim de abordar especificamente defeitos de biogênese de proteínas que causam alterações na expressão na superfície celular de canais iônicos. A citometria de fluxo é uma tecnologia biofísica empregada na contagem de células, a triagem, detecção de biomarcadores e engenharia de proteínas 18. Quando uma solução de amostra de células vivas ou em partículas é injectado num citómetro de fluxo, as células são ordenados numa única corrente que pode ser sondado por sistema de detecção da máquina (Figura 1). O primeiro instrumento de citometria de fluxo produzido em 1956 19 detectada apenas um parâmetro, mas citómetros de fluxo modernos têm múltiplos lasers e detectores de fluorescência que permitem a detecção de mais do que 30 parâmetros fluorescentes 20,21.Filtros e espelhos (óptica de emissão) dirigir a difusão da luz ou luz fluorescente de células a uma rede electrónica (fotodiodo e detectores) que convertem a luz proporcionalmente à sua intensidade. Os dados digitais são analisados usando software especializado e a saída primária é exibido como um gráfico de pontos 21. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54732/54732fig1.jpg" /> Figura 1:. Biophysical princípios de citometria de fluxo de triagem células individuais são empurradas através de um bico sob alta pressão dentro de um fluxo de fluido de revestimento que as move entre um ou mais pontos de interrogação laser. O feixe de luz é desviada por as células que passam e a luz recolhida na direcção para a frente (Forward Scatter, FCS) é enviada para um fotodíodo que converte a luz em um sinal proporcional ao tamanho da célula. A luz também é recolhida em um ângulo de 90 ° para o caminho do laser e enviado para detectores (também chamados de fotomultiplicadores (PMT)).Esta luz é encaminhado através de espelhos dicróicos que permitem a detecção do sinal de dispersão lateral (SSC), que reflecte a granularidade dentro das células, e as emissões fluorescentes excitadas se fluorocromos estão presentes na célula. Três detectores (verde, amarelo e vermelho) são representados com diferentes filtros de banda de comprimento de onda, permitindo a detecção simultânea de diferentes fluorocromos. Os diferentes sinais são digitalizados por um computador externo e convertidos em dados que serão analisados para quantificar as características das células. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54732/54732fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> A capacidade de alto rendimento de citómetros de fluxo foi explorada para quantificar a expressão relativa de membrana do tipo selvagem recombinante e do tipo L dependentes da voltagem tráfico deficiente em Ca V 1.2 canais e subunidades associadas em células vivas. co construções de ADNcDing para as proteínas foram duplamente marcado para realizar simultaneamente um epitopo extracelular não fluorescente que pode ser detectado por um anticorpo conjugado fluorescente impermeável e um fluoróforo intracelular que é constitutivamente fluorescente. Tanto o epitopo extracelular, inserido num loop extracelular da proteína, e o fluoróforo intracelular, inserido depois do terminal C, são convertidas com a proteína. Nesta série de experiências, a proteína V α2δ1 Ca foi manipulada para expressar um epitopo extracelular de hemaglutinina (HA) (YPYDVPDYA) detectado por um revestimento impermeável com FITC (isotiocianato de fluoresceína) -conjugated anti-HA e mCherry como o fluororo intracelular intrínseca. Para determinar o nível de expressão na superfície celular relativa do mCherry-Ca V α2δ1 proteína marcada com HA, as células recombinantes que expressam a proteína de fusão foram colhidas após a transfecção, e coradas com FITC-conjugado monoclonal de murganho anti-HA tag de epitopo AntibodY (Figura 2). FITC é um composto fluorescente orgânico que é consideravelmente menor do que os repórteres de enzimas e, portanto, não como susceptível de interferir com a função biológica. mCherry- Ca V α2δ1-HA sobre-expresso em TSA-201cells, produz um aumento de 3 log significativa na fluorescência FITC e mCherry fluorescência em parcelas bidimensionais 22. Uma vez que o epitopo de HA situa-se na porção extracelular da proteína, a intensidade de fluorescência obtida para FITC na presença de células intactas reflectir o índice relativo da expressão na superfície celular de proteína marcada com HA. A acessibilidade do epitopo de HA nas construções é sistematicamente validada medindo o sinal de FITC após permeabilização celular. Esta medida serve também para confirmar a expressão de proteína total normalizado desde as intensidades de fluorescência relativas para FITC estimado em células permeabilizadas são qualitativamente comparáveis ​​com os valores de fluorescência relativa for mCherry medidos sob condições permeabilizadas e não permeabilizadas 22,23. É importante notar que o espectro de fluorescência intrínseca é deslocada para valores mais elevados após permeabilização, mas que o único valor a ser reportada é a alteração na intensidade de fluorescência em comparação com a construção de controlo. mudanças relativas na intensidade de fluorescência para as construções de teste são estimadas utilizando a intensidade de fluorescência ΔMean (ΔMFI) valores para cada fluoróforo (mCherry ou FITC). As experiências são concebidos para medir a intensidade de fluorescência do construto de teste em relação à intensidade de fluorescência da construção de controlo expresso sob as mesmas condições experimentais para limitar as variações na fluorescência intrínseca do anticorpo fluoróforos. Duas proteínas de membrana foram estudados com êxito com este ensaio: a subunidade formadora de poros do tipo L, canal de cálcio dependentes da voltagem V Ca 1,2 e 14,22 de uma série diferente deexperimentos, o auxiliar extracelular Ca V α2δ1 subunidade 22,23. O protocolo seguinte foi utilizado para determinar a expressão na superfície celular do Ca V α2δ1 subunidade do tipo L cardíaca Ca V 1.2 canal sob condições de controlo e após a mutações que afectam a modificação pós-tradução do canal de iões. Sob condições experimentais padronizadas, a fluorescência da superfície celular de FITC aumenta quase linearmente com a expressão de ADNc que codifica para os mCherry-Ca V proteínas α2δ1-HA (Figura 5 de referência 22). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54732/54732fig2.jpg" /> Figura 2:. Representação esquemática da rotulagem total e membrana na citometria de fluxo protocolo experimental O esquema descreve algumas das principais medidas necessárias para quantificar a expressão total e da superfície celular relativa de canais de iões recombinantes por flow citometria. As células são transfectadas com a construção de marcação dupla mCherry-Ca V α2δ1-HA em células (1) TSA-201 e coradas antes ou após permeabilização (2). Dados multiparâmetros são adquiridos em um citômetro de fluxo (3) para a análise multivariada (4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54732/54732fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Q5 Kit de mutagênese dirigida ao local</td><td>New England Biolabs</td><td>E0554S</td><td>Pode ser substituído pelo kit de mutagênese dirigida ao local QuickChange (Agilent, # 200523).</td></tr><tr><td>Tubos 1.5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72-690-001</td><td></td></tr><tr><td>Tubos 15 ml&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>&nbsp; 62-554-002</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Transferência Graduadas Descartáveis&nbsp;</td><td>VWR</td><td>160001-192&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Para cultura padrão de células HEKT.</td></tr><tr><td>Placa de cultura de 35 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>Para cultura padrão de células HEKT.</td></tr><tr><td>Pipeta sorológica 1 ml</td><td>Sarstedt</td><td>86.1251.001</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica 5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.001</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica 10 ml</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica 25 ml</td><td>Sarstedt</td><td>86.1285.001</td><td></td></tr><tr><td>Meio de alta glicose Dulbecco</td><td>Life Technologies</td><td>12100-046</td><td>Quente em 37 & Graus; C banho-maria antes de usar.</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino, qualificado, inativado por calor, origem americana</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td>Para transfecção lipossomal. Pode ser substituído por transfecção de fosfato de cálcio.</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes de usar.</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (1x) 0,05%, vermelho de fenol</td><td>Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>microtubos de 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Solução salina tamponada com fosfato 1x</td><td>Fisher</td><td>BP661-10</td><td>Pode ser "caseiro".</td></tr><tr><td>Anticorpo conjugado anti-HA FITC</td><td>Sigma</td><td>H7411</td><td></td></tr><tr><td>IgG1&minus; Anticorpo de controle de isotipo FITC</td><td>Sigma</td><td>F6397</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Fixação/Permeabilização. Solução de permeabilização/lavagem, conservar a 4 °C.</td></tr><tr><td>Hemacitômetro</td><td>Fisher</td><td>49105161</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Fisher</td><td>15250061</td><td>Para acessar a viabilidade celular.</td></tr><tr><td>Microcentrífuga Refrigerada, 5430R</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>A14H172200</tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2 Incubadora</td><td>Fisher</td><td>370</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de Laboratório Rocker</td><td>Fisher</td><td>545034</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>VWR</td><td>89032-216</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSARIA III&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>648282</td><td>Citômetro de fluxo.</td></tr><tr><td>FlowJo Software v10</td><td>FlowJo</td><td>FlowJo v10 Dongle</td><td>Para análise de dados.</td></tr></tbody></table>

determinação da superfície celular relativa e expressão total de canais recombinante de iões utilizando citometria de fluxo

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Mutações hereditárias ou de novo em canais seletivos de cátions podem levar à morte súbita cardíaca. A alteração no tráfego da membrana plasmática dessas proteínas transmembranares multi-spanning, com ou sem alteração no canal Assim, tornou-se crítico desenvolver um método para quantificar a mudança da expressão relativa da superfície celular dos canais iônicos cardíacos em larga escala. Aqui, um protocolo detalhado é fornecido para determinar a expressão relativa total e da superfície celular dos canais cardíacos de cálcio tipo L CaV1.2 e subunidades associadas à membrana em células tsA-201 usando ensaios de citometria fluorescente de duas cores. Em comparação com outros métodos qualitativos baseados em microscopia ou immunoblotting, os experimentos de citometria de fluxo são ensaios rápidos, reprodutíveis e de grande volume que fornecem pontos finais quantificáveis em grandes amostras de células vivas (variando de 104 a 106 células) com características celulares semelhantes em um único fluxo. As construções foram projetadas para expressar constitutivamente mCherry no terminal C intracelular (permitindo assim uma avaliação rápida da expressão total da proteína) e expressar um epítopo de hemaglutinina (HA) voltado para extracelular para estimar a expressão da superfície celular de proteínas de membrana usando um anticorpo conjugado de fluorescência anti-HA. Para evitar falsos negativos, experimentos também foram conduzidos em células permeabilizadas para confirmar a acessibilidade e a expressão adequada do epítopo do AH. O procedimento detalhado fornece: (1) projeto de construções de DNA (ácido desoxirribonucléico) marcadas, (2) transfecção mediada por lipídios de construções em células tsA-201, (3) cultura, colheita e coloração de células não permeabilizadas e permeabilizadas e (4) aquisição e análise de sinais fluorescentes. Além disso, os princípios básicos da citometria de fluxo são explicados e o desenho experimental, incluindo a escolha de fluoróforos, titulação do anticorpo HA e experimentos de controle, é discutido minuciosamente. Essa abordagem específica oferece quantificação relativa objetiva da expressão total e da superfície celular dos canais iônicos que podem ser estendidas para estudar bombas iônicas e transportadores de membrana plasmática.

Este artigo descreve um protocolo fiável de quantificar a superfície total e células de canais de iões recombinantes expressas em TSA-201cells por um fluxo de duas cores ensaio de citometria. Como um exemplo, a superfície de célula relativa e expressão de proteína total foi quantificada para o V α2δ1subunit Ca. A fim de executar o fluxo de duas cores citometria de ensaio, Ca V α2δ1 foi duplamente marcado para expressar um epitopo de HA não fluorescente extracelular ...

arritmias cardíacas hereditárias são geralmente causadas por mutações que alteram a entrega de superfície de um ou mais canais de íons. Aqui, nós adaptar ensaios de citometria de fluxo para proporcionar uma quantificação da expressão de proteína total e a superfície celular relativa dos canais de iões recombinantes expressas em células TSA-201.

Determinação da superfície celular Relativa e Expressão total de canais recombinante de iões utilizando Citometria de Fluxo

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

O objetivo geral deste método é quantificar a expressão na superfície celular de proteínas de membrana utilizando um ensaio fluorescente espaçado. A principal vantagem desta técnica é que os ensaios de citometria de fluxo fornecem pontos finais quantificáveis em grandes volumes de células vivas em um único experimento. As implicações desta técnica estendem-se ao diagnóstico e à terapia de arritmias ventriculares cardíacas, pois essas patologias estão frequentemente associadas a mutações genéticas que causam defeitos no tráfego de canais iônicos cardíacos.Em geral, indivíduos novos neste método têm dificuldade em identificar um sítio de inserção extrorsal adequado para o epítopo que não prejudique a função da proteína e gere um sinal fluorescente forte na presença do anticorpo conjugado. Demonstrará este procedimento Benoite Bourdin, assistente de pesquisa do meu laboratório. Para começar, marque duplamente as construções de DNA com mCherry na extremidade C intracelular.Além disso, expresse um epítopo de hemaglutinina voltado para o exterior celular, que pode ser medido usando um anticorpo fluorescente para estimar a expressão na superfície celular de proteínas de membrana. Em segui

determination-relative-cell-surface-total-expression-recombinant-ion

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, demonstramos a interação entre proteínas e vesículas fosfolipídicas artificiais usando citometria de fluxo quantitativa. A ligação de proteínas marcadas com fluorescência a vesículas fosfolipídicas marcadas com fluorescência aumenta a intensidade média de fluorescência, e esse aumento é detectado por um citômetro de fluxo.

Citometria de fluxo quantitativa para estudar interações proteína-fosfolipídio veicular marcadas

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular fornece um método quantitativo de alto rendimento para estudar a interação proteína-proteína. Esta metodologia pode ser aplicada ao mapeamento de locais de ligação de proteína e para o rastreio de factores que regulam a interacção proteína-proteína.

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular: A alta taxa de transferência método quantitativo para estudo de interação proteína-proteína

O artigo descreve a metodologia detalhada para diferenciar de forma eficiente as células estaminais pluripotentes em cardiomiócitos de modular selectivamente a via Wnt, seguido por análise de citometria de fluxo de marcadores de referência para avaliar a homogeneidade e a identidade da população.

Diferenciação de alta eficiência de pluripotentes humanas células-tronco para Cardiomyocytes e Caracterização por citometria de fluxo

Fornecemos uma descrição detalhada de um protocolo para análise de citometria de fluxo de antígenos de superfície e/ou antígenos intracelulares em tipos de células neurais. Aspectos críticos do planejamento experimental, procedimentos metodológicos passo a passo e princípios fundamentais da citometria de fluxo são explicados para permitir que os neurobiólogos explorem essa poderosa tecnologia.

Citometria de Fluxo protocolos para a superfície e intracelular Antigen análises de tipos de células neurais

Este artigo descreve um método para medir a aloreactividade numa população mista de células T utilizando citometria de fluxo de imagem.

Medição do T celular aloreactividade usando imagens de Citometria de Fluxo

Um fluxo de ensaio de ligação celular baseados em citometria é descrito que é usado principalmente como uma ferramenta de triagem para identificar compostos que inibem a ligação de um ligante de chemokine CXC fluorescente etiquetada 12 (CXCL12) para o receptor do chemokine CXC 4 (CXCR4).

Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para identificar compostos que interrompem a ligação do ligante de Chemokine fluorescente-etiquetadas CXC 12 a CXC Chemokine Receptor 4

Este artigo descreve um protocolo fret-based do citometria do fluxo para quantificar o Self-assembly da proteína em células de S. cerevisiae e de HEK293T.

Detectando e caracterizando a auto-montagem da proteína in vivo por citometria de fluxo

O objetivo deste método é determinar a densidade cr1 nos eritrócitos de qualquer sujeito, comparando-se com três sujeitos cuja densidade eritrócito CR1 é conhecida. O método utiliza citometria de fluxo após a imunocoloração dos eritrócitos dos sujeitos por um anticorpo monoclonal anti-CR1 acoplado a um sistema amplificado usando ficoitrina (PE).

Medição do receptor complemento eririotcyte 1 usando citometria de fluxo

Aqui, descrevemos um conjunto de métodos para caracterizar a interação de proteínas com membranas de células ou microvesculas.

Analisando a Interação de Proteínas Fluorescentes com Microvesculas Fosfolipísicas Artificiais usando Citometria de Fluxo Quantitativo

Este protocolo descreve um método para o estudo de proteínas de membrana eletrogênicas através da medição de mudanças no potencial de membrana. Este ensaio fornece uma plataforma para a leitura funcional de múltiplos canais iônicos expressos endogenamente em linhagens celulares epiteliais.

Ensaio de Potencial de Membrana Baseado em Fluorescência para Estudo Funcional de Alto Rendimento de Dois Canais Iônicos Endógenos em Duas Linhagens Celulares Epiteliais

O influxo de cálcio, uma medida da sinalização de células T, é uma maneira eficaz de analisar as respostas à estimulação de receptores de células T. Este protocolo para multiplexação de Indo-1 com painéis de anticorpos direcionados a moléculas de superfície celular aproveita as capacidades altamente flexíveis da citometria de fluxo de espectro completo.

Análise do Influxo de Cálcio Induzido por Receptores de Células T em Células T Primárias Murinas por Citometria de Fluxo de Espectro Completo

Aprenda a quantificar a expressão de proteínas de membrana na superfície celular usando citometria de fluxo. Este método permite analisar grandes volumes de células vivas em uma única experiência, auxiliando no estudo de arritmias cardíacas.

Determinação da superfície celular Relativa e Expressão total de canais recombinante de iões utilizando Citometria de Fluxo

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