Determinação da superfície celular Relativa e Expressão total de canais recombinante de iões utilizando Citometria de Fluxo

O objetivo geral deste método é quantificar a expressão da superfície celular de proteínas de membrana usando um ensaio espaçado fluorescente. A principal vantagem dessa técnica é que os ensaios de citometria de fluxo fornecem pontos finais quantificáveis em grandes volumes de células vivas em um único experimento. As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico e à terapia das arritmias ventriculares cardíacas, pois essas patologias estão frequentemente associadas a mutações genéticas que causam defeitos no tráfego dos canais iônicos cardíacos.

Geralmente, os indivíduos novos neste método lutam para identificar um local de inserção extrorsal adequado para o epítopo que não prejudique sua função proteica e gere um forte sinal fluorescente na presença do anticorpo conjugado. Demonstrando esse procedimento estará Benoite Bourdin, assistente de pesquisa do meu laboratório. Para começar, marque duplamente as construções de DNA com mCherry no terminal C intracelular.

Além disso, expresse um epítopo de hemaglutinina extracelular voltado para o exterior, que pode ser medido usando um anticorpo de fluorescência para estimar a expressão da superfície celular de proteínas de membrana. Em seguida, cultive uma placa de células TSA201 usando técnicas padrão até atingirem 90% de confluência. Para cada amostra, prepare os reagentes de transfecção em dois tubos.

Prepare um tubo de 1,5 mililitro com quatro microgramas de DNA e 250 microlitros de meio de soro reduzido e um segundo tubo com 10 microlitros do reagente de transfecção mediado por lipossomas e 250 microlitros de meio de cultura reduzido de soro. Misture delicadamente os dois tubos e incube-os por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, combine suavemente o conteúdo do tubo um e do tubo dois e incube os complexos de DNA lipossomal por 20 minutos em temperatura ambiente.

Adicione os complexos às células cultivadas e balance suavemente a placa de cultura. Coloque o prato de volta a 37 graus Celsius e sob uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono por 24 horas. 24 horas após a adição do reagente de transfecção, remova o meio da placa de cultura e lave cuidadosamente as células com 400 microlitros de tripsina-EDTA pré-aquecido.

Em seguida, adicione 400 microlitros de tripsina-EDTA e incube o prato por cinco minutos para permitir que as células se desprendam do prato. Uma vez destacado, interrompa a digestão enzimática adicionando um mililitro de meio de cultura fria sem penicilina ou estreptomicina às células. Pipete suavemente o meio sobre a placa quatro a cinco vezes para lavar todas as células da superfície.

Em seguida, colete as células em tubos estéreis de 1,5 mililitro e coloque-as imediatamente no gelo. Para as próximas etapas, use uma solução gelada e mantenha as células a quatro graus para evitar a internalização do epítopo da superfície. Além disso, diminua a exposição das células à luz para limitar o fotobranqueamento do sinal fluorescente.

Em seguida, centrifugue os tubos para pellet as células. Em seguida, aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante resultante. Ressuspenda o pellet para preparar uma suspensão de célula única usando um mililitro de PBS.

Em seguida, centrifugue brevemente os tubos. Pulverize e ressuspenda as células mais uma vez para remover completamente o meio de cultura. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 600 microlitros de PBS.

Meça a concentração celular e ajuste-a para pelo menos três milhões de células por mililitro. Em seguida, divida as células em novos tubos de 1,5 mililitro. Certifique-se de incluir os controles apropriados para discriminar a coloração específica da coloração inespecífica e para a coloração extracelular e também para a coloração intracelular.

O anticorpo de controle de isótopo ajudará a avaliar o nível de coloração de fundo e deve corresponder ao anticorpo primário, isótopo auspicioso e fluoróforo. É importante usar o anticorpo isótopo de controle e o anticorpo fluorescente na mesma concentração. Para estimar a expressão da superfície celular das proteínas de membrana, primeiro rotule apenas o epítopo de HA extra celular usando um anticorpo conjugado com luz fluorescente.

Em seguida, adicione um anticorpo anti-HA monoclonal conjugado com FITC a cinco microgramas por mililitro ao tubo. Vórtice as células brevemente e depois incube-as em uma plataforma basculante no escuro. Remova as células do escuro e adicione 900 microlitros de PBS.

Em seguida, centrifugue o tubo para pellet as células e aspire o sobrenadante. Em seguida, lave as células ressuspendendo o pellet em um mililitro de PBS e fazendo um breve vórtice das células. Em seguida, repita a etapa da centrífuga para novamente pellet as células.

Repita esta etapa de lavagem um total de três vezes para remover qualquer anticorpo não ligado. Após a lavagem final, ressuspenda as células em 500 microlitros de PBS e transfira a suspensão de célula única para um tubo de citometria de fluxo de cinco mililitros. Mantenha as células no escuro a quatro graus Celsius até que a amostra seja executada.

Para estimar a expressão intracelular da proteína total, em seguida, rotule as células permeabilizadas. Isso é feito usando um protocolo semelhante à marcação extracelular, mas com a adição de um tampão de permeabilização celular à base de saponina. Pulverize as células, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 100 microlitros de solução de permeabilização de fixação diretamente do estoque preparado.

Incube as células no escuro a quatro graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de lavagem de permeabilização recém-preparado e faça um vórtice breve das células. Em seguida, pelete as células e lave-as mais duas vezes usando o tampão de lavagem de permeabilização.

Em seguida, adicione o anticorpo anti-HA monoclonal conjugado com FITC a 5 microgramas por mililitro e 100 microlitros do tampão de lavagem de permeabilização. Brevemente, o vórtice das células e incubar as células no escuro a quatro graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, adicione 100 microlitros do tampão de lavagem de permeabilização.

Pellet as células e lave-as três vezes em 100 microlitros do mesmo tampão mostrado anteriormente. Após a lavagem final, ressuspenda as células em 500 microlitros de PBS e transfira a suspensão de célula única para um tubo de citometria de fluxo de cinco mililitros. Passe as células não permeabilizadas e permeabilizadas pelo citômetro de fluxo no mesmo dia.

Para começar, inicie o software de análise de citometria de fluxo e importe os arquivos fcs criados durante a citometria de fluxo. Clique na primeira amostra e inicie o processo de passagem no gráfico de dispersão lateral versus dispersão direta. Em seguida, desenhe a porta P1 usando o ícone de elipse ao redor das células vivas para eliminar quaisquer detritos, células mortas ou agregados.

Em seguida, desenhe o gráfico de contorno do parâmetro do tubo do mCherry versus a intensidade de fluorescência do FITC. Defina a porta P2 ao redor das células positivas FITC e mCherry e a porta P3 ao redor da população de células negativas de fluorescência. Em seguida, selecione as portas P2 e P3 e clique no ícone adicionar estatísticas na janela do espaço de trabalho original.

Clique em contagem e depois clique em média. Finalmente, aplique os parâmetros e estatísticas das portas a todas as amostras sondadas pelo citômetro. Este protocolo foi usado para caracterizar o papel da N-glicosilação na expressão total e superficial de CaV Alpha 2 Delta 1 em células TSA201.

Para acessar a expressão da proteína da superfície celular, o HA foi medido em células não permeabilizadas que tiveram sítios de N-glicosilação interrompidos em quatro locais, 16 locais ou nenhum sítio. Os níveis de FITC foram fortes no tipo selvagem e as células com células de N-glicosilação foram interrompidas em quatro locais, mas apenas níveis de fundo foram encontrados nas células com 16 locais interrompidos. Para as células permeabilizadas, a fluorescência FITC aumentou para todas as condições, indicando que todas as proteínas CaV Alpha 2 Delta 1 transfectadas e marcadas com HA foram coradas e detectadas pelo anticorpo anti HA FITC.

Além disso, os níveis de fluorescência mCherry foram semelhantes para células permeabilizadas e não permeabilizadas, significando que a permeabilização não altera o sinal relativo de mCherry. Ensaios conduzidos após a permeabilização celular mostraram que a expressão total de proteínas para as células com 16 locais interrompidos também foi significativamente diminuída, seja inferida da fluorescência FITC em células permeabilizadas ou da fluorescência constitutiva mCherry medida em células não permeabilizadas e em células permeabilizadas. Além desse procedimento, registros fisiológicos extras podem ser realizados para correlacionar a expressão e a função dos canais iônicos.

Essa técnica também abre caminho para pesquisadores da área médica estudarem o impacto de mutações genéticas, modificações pós-traducionais, microRNAs, pequenas GTPases e o papel das chaperonas no tráfego de proteínas de membrana expressas em células recombinantes ou nativas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão sobre como realizar a transfecção de DNA em células recombinantes, corar NTAC e células permeabilizadas, bem como realizar análise de dados nas amostras. Não se esqueça de que trabalhar com células vivas requer precauções, como trabalhar no fluido helaminal para a transfixação e usar luvas ao manusear produtos químicos.