Name: Alto teor de gordura Alimentação Paradigma para larval Zebrafish: Alimentação, Imagens ao vivo, e quantificação da ingestão de alimentos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Aprenda a preparar dietas ricas em lipídios para larvas de Danio rerio e quantificar a ingestão alimentar usando análogos fluorescentes. Este método permite visualizar dinâmicas de absorção lipídica em tempo real.

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Os autores agradecem a Meng-Chieh Shen pelas imagens, Jennifer Anderson por fornecer comentários úteis sobre o manuscrito e aos membros do laboratório Farber por suas contribuições no desenvolvimento dessas técnicas. Este estudo foi financiado pelo NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker e Co-PI S.A.F) e F32DK096786 (J.P.O.). Este conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do NIH. Apoio adicional foi fornecido pela Fundação de Caridade G. Harold e Leila Y. Mathers ao laboratório da S.A.F e à doação da Carnegie Institution for Science.

Estes protocolos foram aprovados pela Carnegie Institution for Science Animal Care Institucional e Comitê de Uso (protocolo nº. 139). 1. Preparação de animais <ol><li> Manter adultos e larvas a 28 ° C em um 14 hr: luz 10 hr: ciclo escuro. Alimente adultos duas vezes por dia com Artemia shell livre (decapsulated, non-incubação, a partir de 14 dpf) e microaglomerados comerciais. </li><li> Estes protocolos são optimizados para o uso de 6-7 larvas dpf recolhido por desova natural do fundo AB. Os protocolos podem ser modificados para larvas de outras idades e origens. Não fornecer alimentos exógena antes de 6 dpf. </li><li> Anestesiar larvas com tricaina em meios de embrião (EM) (4,2 ml de 4 mg / tricaina ml por 100 ml de Em) à temperatura ambiente (TA). </li></ol> 2. Preparação de rica em lipídios Gema de Ovo Alimentação <ol><li> Preparar e armazenar as gemas de ovos de galinha. Separar a gema ea clara de 12 ovos de galinha. Reunir as gemas, alíquota de 1 ml em 1,5tubos ml e armazenar a -80 ° C até 1 ano (12 gemas fará ~ 80 alíquotas). Associação A brancos, armazenar e usar como um feed de lipídios-pobre, rica em proteínas. </li><li> Prepare analógico lípido fluorescente (s) a ser adicionado à alimentação de gema de ovo, se desejado. <ol><li> Suspender o, análogo lipídico comprada em pó fluorescente em etanol a 100% ou 100% de clorofórmio a 0,1 mg / mL (ver nota seguinte discussão solventes), da alíquota em tubos de vidro opaco, selar com parafilme e armazenamento de acordo com as instruções do fabricante. Devido à rápida evaporação de solventes orgânicos não usar volumes alíquotas inferior a ~ 400 ul para o armazenamento a longo prazo. Nota: Se o análogo de lípido é suspenso em etanol, grandes volumes de o análogo de lípido será utilizado porque secam rapidamente sob N2 de clorofórmio. Se o análogo de lípido é suspenso em etanol que não tem de ser seco e ressuspenso antes de o adicionar à ração lipossoma no passo 2.2.4, mas a concentração total de etanol não deve ser superior a 0.1% na ração de lipossomas para evitar os efeitos fisiológicos potencialmente confusão de etanol. </li><li> Para os análogos de ácidos gordos fluorescentes: Preparar um volume total de 20 ml de 5% de emulsão de gema de ovo em EM. A partir desse preparar aliquotas de 5 ml com uma concentração final de 6,4 uM 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indaceno (BODIPY C 16) para os ensaios de imagiologia confocal vivo e se alimentar ou 1 ug / ml BODIPY C 12 para imagiologia estereomicroscópio. Transferir a quantidade desejada do análogo de lípido fluorescente dentro de um tubo de plástico de 1,5 ml. Seca-se o lípido sob uma corrente de N 2, tomando cuidado para não soprar o lípido para fora do tubo. </li><li> Imediatamente, ressuspender em 5 ul de etanol a 100% por pipetagem de uma corrente para baixo os lados do tubo, adicionar 95 ul de EM, e misturar bem. Nota: A mistura deve aparecer homogénea; Se lípido cor permanece sobre os lados do tubo ou do líquido aparece agrupado, o lípido não foi totalmente solubilizado e requer mais etanol. Proteger o tubo from luz e armazenar no gelo. </li><li> Para analógico colesterol fluorescente: preparar uma concentração final de 2,4 ug / ml de colesterol em 5 ml de 0,5-5% de emulsão de gema de ovo para estudos de imagem ao vivo. Transferir a quantidade desejada de colesterol para um tubo de plástico de 1,5 ml. Seca-se o lípido sob uma corrente de N 2, tomando cuidado para não soprar o lípido para fora do tubo. </li><li> Imediatamente, ressuspender em 15 ul de etanol a 100% RT por pipetagem de uma corrente para baixo os lados do tubo e misturar-se com 85 ul de RT 1% de BSA livre de ácido gordo em H 2 O. purificado Proteger o tubo da luz e armazenar no gelo. </li></ol></li><li> Prepare Gema de Ovo de Lipossomas de alimentação. <ol><li> Adicionar uma alíquota descongelada de gema de ovo para EM em um tubo de 50 ml. Vortex a mistura de gema de ovo diluída para 1-2 min; a mistura deve parecer ser uma emulsão homogénea. </li><li> Despeje a mistura por uma peneira de malha fina para remover conglomerados de proteína e recolher em um novo, fresco tubo de 50 ml. </li><li> Sonica pulsote a mistura de ovos com um MICROTIP cônico um quarto de polegada (5 vezes (5 x 1 segundo ligado, 1 seg desligado) parando 5-10 segundos entre cada conjunto; intensidade de saída: 6 W) à temperatura ambiente para criar lipossomas. configurações de energia Sonicator são dependentes instrumento e, portanto, requerem otimização para cada instrumento e MICROTIP. Nota: Continuamente mistura agitar à TA de lipossomas para manter a homogeneidade até à sua utilização. </li></ol></li><li> Adicionar o análogo de lípido fluorescente para os lipossomas de gema de ovo, se desejado. Imediatamente após a soni cação, pipetar os lípidos preparados na mistura lipossoma e vórtice a alta velocidade durante 30 segundos para incorporar em lipossomas. Proteger a mistura da luz envolvendo o tubo em folha e continuar balançando à temperatura ambiente. </li></ol> 3. Alimentação Paradigm <ol><li> Prepare as larvas para a alimentação. <ol><li> Antes de iniciar a alimentação, as larvas de tela para defeitos morfológicos óbvios que podem impedir a alimentação. Transferência das larvas para 60 mm x 15 mm ou placas de Petri de 6 ou 12 poços PLATES, EM reduzir a um mínimo, e substituir com 5 ml da solução de lipossoma preparado. </li><li> Se necessário, a transferência das larvas de controle não alimentado para 5 ml de Em e / ou 5 ml de 5% de clara de ovo em EM e tratar em paralelo. </li></ol></li><li> Agite suavemente as larvas em um balancim incubadas (29-31 ° C a 30 rpm) durante todo o feed para incentivar a ingestão de alimentos, continuando a proteger da luz, se análogos lipídicos fluorescentes estão presentes. Se larvas precisam ser expostos à luz, minimizar a exposição com uma tampa de incubadora de vidros fumados. </li><li> No final do período de alimentação, lavar as larvas que nadam livremente em EM 3 vezes. Nota: As larvas podem começar a consumir lipossomas em qualquer ponto durante a alimentação. Se é crítico que as larvas começar a alimentação ao mesmo tempo, a tela de ingestão de alimentos (ver 3.4) após 1 h de alimentação e retornar apenas larvas que têm início a alimentação de emulsão de gema de ovo para completar a alimentação. </li><li> Tela as larvas neste momento para a ingestão de alimentos como um número pequeno não pode eAT (~ geralmente 0-5%). Examinar os intestinos de larvas que foram anestesiados ou ligeiramente arrefecido em um bloco de metal em gelo para determinar se eles alimentados: larvas que tenham consumido lipossomas terão uma escurecida intestino (Figura 1). </li><li> Imagens ou processo de larvas para a ingestão de comida imediatamente. Alternativamente, as larvas lugar em EM fresco e incuba-se a 28 ° C para permitir o processamento metabólico de ocorrer. </li></ol> 4. Montagem Larvas for Imaging ao vivo <ol><li> Preparação da mídia de montagem. <ol><li> Por metil celulose 3%: adicionar 0,75 g de metil-celulose a 25 ml de ebulição próximo EM, vórtice, rocha à TA 2-3 dias até que esteja completamente dissolvido, e armazenar a 4 ° C, durante anos a -20 ° C. Os ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, a 4 ° C irá remover as bolhas de ar. Armazenar 3% de celulose de metilo em gelo durante a montagem larvas. </li><li> Para 1,2% de agarose de baixo-mount: adicionar 0,3 g de agarose de baixa fusão a 25 mL EM e dissolver, trazendo a ferver, alíquota em 2 ml de tUBEs, e manter a 26-28 ° C em um bloco de aquecimento. alíquotas não utilizados podem ser armazenados à temperatura ambiente ou -20 ° C e fervida novamente no momento da utilização. Certifique-se de que agarose é fresco bastante para segurar antes de expor a larvas ou eles podem ser sobre-aquecido. </li></ol></li><li> Para baixa ampliação, de médio rendimento imagens ao vivo, coloque uma lâmina de vidro em um tecido em um bloco de metal no gelo e esperar que o slide para esfriar. Aplique uma quantidade generosa de metilcelulose a 3% (que foi mantido a 4 ° C no gelo) sobre a lâmina, transferir uma larva para a metilcelulose a 3%, utilizando um poker-linha de pesca (linha de pesca de diâmetro 0,41 milímetros colado à extremidade de um tubo capilar de vidro) criar um Troth para drenar o excesso eM (de modo que a metilcelulose não será diluída) e posicionar as larvas se o desejar. </li><li> Para a curto prazo (&lt;20 min), de grande ampliação de imagens ao vivo com um objetivo emersão de óleo na posição vertical, montagem larvas com a lamela método lean-to. <ol><li> Use cola à base de cianoacrilato (Super Bonder) paraanexar AA lamela 22 milímetros x 30 mm a uma extremidade de uma lâmina de vidro. Use um poker para colocar uma linha fina de metilcelulose a 3% no slide ao lado da lamela e transferir as larvas para o slide com uma grande furo Pasteur pipeta. Retire o excesso de EM por isso não vai diluir a metilcelulose. </li><li> Usando um póquer, suavemente posicionar larvas no metilcelulose sobre os seus lados (lado esquerdo para cima à imagem mais do fígado, do lado direito para cima para a imagem da vesícula biliar), com as cabeças ao lado da lamela. </li><li> Ponto supercola nos cantos de uma segunda lamela e gentilmente colocar uma borda da lamela na lamela montado eo outro no slide, ponte larvas. Tome cuidado para não aplicar pressão excessiva durante esta etapa ou com o objetivo, enquanto imagem de modo a que as larvas permanecem sem ferimentos. </li></ol></li><li> Para longo prazo, imagens de alta ampliação com uma objectiva de imersão vertical, montagem larvas em agarose. Adicionar uma larva de uma pequena alíquota de 1,2% baixo ponto de fusão agarose, em seguida, transferir olarva em um pequeno volume de agarose para uma placa de Petri. <ol><li> posicionar rapidamente as larvas com um poker antes os solidifica de agarose. Permitir que a agarose a secar durante 2-3 min e cobrir totalmente a agarose com EM frescos para evitar a sua secagem. </li></ol></li><li> Para longo prazo, imagens de alta ampliação com um objetivo invertido, montar larvas em um prato com fundo de vidro em agarose. <ol><li> Arrefecer um bloco de metal no gelo. Coloque o prato no bloco de metal separadas por um tecido para evitar o resfriamento excessivo e congelamento larval. Transferir uma larva para o prato e remover o EM por absorção com papel absorvente. </li><li> Coloque uma gota de 28 ° C agarose de baixo ponto de fusão (1,2%) no topo da larva e posicionar imediatamente com um póquer (lado esquerdo para baixo a melhor imagem do fígado, do lado direito para baixo a imagem da vesícula biliar). Remover prato do bloco frio, deixe secar por 2-3 min, e adicionar um volume suficiente de EM fresco para cobrir a agarose (~ 2-5 ml). </li></ol></li></ol> Ingestão 5. AlimentosEnsaio <ol><li> No fim de uma alimentação de lipossoma de gema de ovo contendo 6,4 uM BODIPY C 16, reunir um mínimo de 10 larvas lavadas em um tubo de plástico de 1,5 ml ou 2, remover o EM, e encaixe congelamento. As amostras podem ser armazenadas a -80 ° C ao abrigo da luz durante vários meses. Nota: Se possível, recolher várias repetições. É importante recolher larvas não alimentadas neste passo para normalizar para a fluorescência de fundo de lípido (larvas idealmente a partir da mesma embraiagem são utilizados). </li><li> Realizar uma extração de lipídios Bligh-Dyer modificada 3,21. <ol><li> Adicionar 100 ul de tampão de homogeneização (20 mM de Tris-Cl, EDTA 1 mM) à amostra em gelo (H 2 O, alternativamente, purificado pode ser utilizado). Homogeneizar no gelo com um sonicador MICROTIP (5 segundos no total: 1 segundo em 1 seg desligado). Verifique se as larvas são totalmente homogeneizada; Se não, repita. Transfira para uma ml tubo de cultura de vidro descartável 13 (podem ser utilizados outros tubos de vidro). Nota: O clorofórmio é perigosa; praticar todos os ex lipídico subsequenteetapas de tração em temperatura ambiente em uma capa química. </li><li> Para cada 100 ul de tampão de homogeneização utilizadas, adicionar 375 ul de 1: 2 (clorofórmio: metanol). 30-60 seg Vortex, incubar 10 min, adicionar 125 ul de clorofórmio por 100 ul de tampão de homogeneização utilizada, e agitar com vortex 30 seg. </li><li> Adicionar 125 ul de Tris 200 mM, pH 7,5 por 100 ul de tampão de homogeneização utilizada, vortex 30 seg, e centrifugar (2000 x g, 5 min, temperatura ambiente, protegidas da luz). Remova cuidadosamente as amostras da centrifugadora. Eles vão ser separado em duas fases: uma fase aquosa superior é, uma interface de detritos das larvas, e uma fase orgânica inferior (contém lípidos). </li><li> Com uma pipeta de vidro limpo recolher o fundo, fase orgânica e transferi-lo para um tubo de vidro de 13 ml limpo. Nota: Tome cuidado para evitar a fase aquosa e detritos larval na interface; se a contaminação ocorre, repita o passo centrifugação e recoleta. Descarte a fase superior, aquosa; pode ser útil para remover e descartar estefase, antes de recolher a fase orgânica. A amostra pode ser armazenada a -80 ° C durante até 1 mês. </li><li> Seca-se a fase orgânica sob vácuo (0,12 atm), ao mesmo tempo proteger da luz. Não continue a secar as amostras após o líquido tenha evaporado uma vez que irá reduzir a solubilidade lipídica. Ressuspender os lípidos em 2: 1 (clorofórmio: metanol) e armazenar em gelo. O volume óptimo de clorofórmio: metanol a solução depende do método de detecção utilizado; iniciar e continuar baixo para diluir conforme necessário. A orientação geral é a utilização de 10 ml para 10 larvas em pool. </li></ol></li><li> Manchar todo o volume da amostra em intervalos uniformemente espaçados sobre uma placa de TLC canalizada e digitalizar a placa com um scanner a laser rotineiramente utilizado para imagiologia biomolecular (por exemplo, um leitor de placas fluorescente). Para os análogos de lipídios fluorescentes incluídos na lista de materiais que têm uma maxima de excitação 500-650 maxima nm e emissão 510-665 nm, utilizar um laser de 488 nm e com a coleta de emissão a 520 nm. <ol><li> Quantificar a fluorescência total de cada local com software de imagem. Nota: Corrigir que ocorrem naturalmente fundo lipídico fluorescência subtraindo a fluorescência, amostras de larvas em jejum emparelhados. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

As técnicas descritas aqui permitem aos pesquisadores para tratar peixe-zebra larval com uma alimentação rica em lipídios, visualizar o processamento de lípidos na dieta em larvas vivas, e quantificar a ingestão de alimentos larval. Para garantir o sucesso, deve ser dada especial atenção a vários passos críticos. ovos de galinha comerciais variam; para minimizar a variabilidade potencial realizamos todos os ensaios em ovos orgânicos de galinhas livres de gaiolas que não tenham sido enriquecido para ácidos graxos ômega-3...

Os mecanismos pelos quais o intestino regula o processamento de lípidos na dieta, o fígado controla complexo metabolismo síntese de lípidos e lipoproteínas, e como estes órgãos trabalhar com o sistema nervoso central para controlar a ingestão de alimentos está compreendida de forma incompleta. É de interesse biomédico para elucidar este biologia à luz dos actuais epidemias de obesidade, doenças cardiovasculares, diabetes e doença hepática gordurosa não-alcoólica. Estudos em cultura de células e camundongos forneceram a maioria da nossa compreensão das relações mecanicistas entre lipídios na dieta e doenças, e peixe-zebra (Danio rerio) estão emergindo como um modelo ideal para complementar este trabalho. Peixe-zebra tem gastrointestinal semelhante (GI) órgãos, metabolismo lipídico e de transporte de lipoproteínas de vertebrados superiores 1,2, desenvolver-se rapidamente, e são geneticamente tratável. A limpidez óptica do peixe-zebra larval facilita estudos in vivo, uma particulavantagem r para o estudo do sistema de GI como seu meio extracelular (ou seja, bile, microbiota, endócrino sinalização) é praticamente impossível modelo ex vivo. Em conformidade, um corpo de pesquisa que combina a rastreabilidade genética e conducividade a viver imagiologia de larvas do peixe com uma variedade de manipulações dietéticas (elevado teor de gordura, 3,4 5 -colesterol, e dietas -carbohydrate 6,7), e os modelos de doença cardiovascular 8, diabetes 9,10, esteatose hepática 11-13, 14-16 e obesidade, estão surgindo para fornecer uma série de insights metabólicas. Um aspecto essencial da transição peixe-zebra larval em pesquisa metabólica é a otimização de técnicas desenvolvidas em outros animais modelo para o peixe-zebra e do desenvolvimento de novos ensaios que exploram os pontos fortes únicas do peixe-zebra. Este protocolo apresenta técnicas desenvolvidas e otimizadas para alimentar peixe-zebra larval um Lipi-D refeição rica, visualizar processamento de lipídios na dieta de corpo inteiro para subcelular resolução, e medir a ingestão de alimentos. gema de ovo de galinha foi escolhido para compor a refeição rica em lipídios, já que contém altos níveis de gorduras e colesterol (lipídios compor ~ 58% de gema de ovo de galinha, dos quais ~ 5% é o colesterol, 60% são triglicéridos, e 35% são fosfolipídios ). Gema de ovo de galinha fornece mais gordura do que os alimentos típicos comerciais de peixe-zebra de micropastilha (~ 15% de lipídios) e a vantagem de que é uma alimentação padronizada com percentagens conhecidas de espécies de ácidos graxos específicos, como dietas de peixe-zebra e regimentos de alimentação não foram padronizadas em laboratórios 17. Além disso, os análogos de lipídios fluorescentes fornecidas na gema de ovo visualizar transporte e acumulação de lípidos na dieta 18, componentes celulares de imagem, incluindo gotículas lipídicas, agindo ambos os corantes como vitais 3 e através da incorporação covalente em lípidos complexos, investigar o metabolismo através de cromatografia em camada delgada (TLC) 19 </sup&gt; E cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (SAF dados não publicados), e fornecer um ensaio quantitativo para a ingestão total de alimentos 20.

<table><tbody><tr><td>Tricaína (sal de metanossulofnato de etilo 3-aminobenzoato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Anestesia para larvas de peixe-zebra</td></tr><tr><td>Ovos de galinha</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Ovos orgânicos, livres de gaiolas, não enriquecidos para ácidos graxos omege-3</td></tr><tr><td>Processador ultrassônico 3000 sonicator</td><td>Misonix, Inc.</td><td>S-3000</td><td>Para fazer lipossomas de gema de ovo</td></tr><tr><td>Sonabox gabinete acústico</td><td>Misonix, Inc.</td><td>432B</td><td>Para fazer lipossomas de gema de ovo</td></tr><tr><td>1/8" microtip cônico</td><td>Misonix, Inc.</td><td>419</td><td>Para fazer lipossomas de gema de ovo</td></tr><tr><td>Frascos âmbar (4 ml, vidro)</td> <td>National Scientific</td><td>13-425</td><td>Armazenamento de lipídios; inclui frascos, tampas abertas e septos de tampa</td></tr><tr><td>Incu-Shaker Mini&nbsp;</td><td>Shaker</td> incubado Benchmark <td>1222U12</td><td>para rações</td></tr><tr><td>BODIPY FL C16&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3821</td><td>Análogo lipídico fluorescente; (Ácido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-hexadecanóico)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C12&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3822</td><td>Analógico lipídico fluorescente; (ácido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-dodecanóico)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3834</td><td>Analógico lipídico fluorescente; (Ácido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-pentanóico)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D2183</td><td>Analógico lipídico fluorescente; (Ácido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-propiónico)</td></tr><tr><td>TopFluor colesterol&nbsp;</td><td>Avanti Lipídios Polares Inc.</td><td>810255</td><td>Análogo lipídico fluorescente; 23-(dipirrometeneboro difluoreto)-24-norcolesterol</td></tr><tr><td>BSA livre de ácidos graxos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0281-1G</td><td>Para solubilização de colesterol TopFluor</td></tr><tr><td>Metilcelulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0387</td><td>Mídia de montagem para imagens larvais vivas; 75 x 25 x 1 mm</td></tr><tr><td>Agarose de baixa fusão</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Mídia de montagem para larvas vivas imagiologia; 22 x 30</td></tr><tr><td>lâminas de microscópio VWR&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>16004-422</td><td>Montando larvas para imagens ao vivo</td></tr><tr><td>Coverslips&nbsp;</td><td>Vidro de Cobertura</td><td>12-544A</td><td>Montagem de larvas para imagens ao vivo</td></tr><tr><td>Super cola</td><td>Loctite</td><td>LOC01-30379</td><td>Montagem de larvas para imagens ao vivo</td></tr><tr><td>FluoroDish (prato de fundo de vidro)</td><td>World Precision Instruments, Inc.&nbsp;</td><td>FD35-100</td><td>Montagem de larvas para imagens ao vivo; prato de 35 mm, vidro de 23 mm, espessura de vidro de 0,17 mm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Leica Microsytems</td><td>SP-2, SP-5</td><td>Microscópio para imagem ao vivo de alta ampliação</td></tr><tr><td>Estereoscópio</td><td>Nikon</td><td>SM21500</td><td>Microscópio para imagem ao vivo de baixa ampliação</td></tr><tr><td>Tubos de cultura de vidro&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>73500-13100</td><td>Extração de lipídios; (13 x 100 mm; 13 ml)</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Plus&nbsp;</td><td>ThermoQuest</td><td>SC210A</td><td>Extração de lipídios</td></tr><tr><td>Placas TLC canalizadas</td><td>Whatman Scientific</td><td>WC4855-821 Ensaio de</td><td>ingestão de alimentos; LK5D Sílica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um de espessura; Placas</td></tr><tr><td>TLC canalizadas descontinuadas</td><td>Analtech, Inc.</td><td>66911</td><td>Ensaio de ingestão de alimentos; Substituição direta para placas Whatman Scientific TLC</td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Variable Mode Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>9410</td><td>Leitor de placa fluorescente para ensaio de ingestão de alimentos</td></tr><tr><td>Software ImageQuant GE</td><td>Healthcare</td><td>29000605</td><td>Análise de ensaio de ingestão de alimentos</td></tr><tr><td>5 3/4' Pipetas de pasteur descartáveis de borosilicato de diâmetro largo &nbsp; &nbsp;</td><td>Kimble</td><td>63A53WT</td><td>Larvas de transferência</td></tr></tbody></table>

alto teor de gordura alimentação paradigma para larval zebrafish: alimentação, imagens ao vivo, e quantificação da ingestão de alimentos

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

O peixe-zebra está emergindo como um modelo de processamento de lipídios na dieta e doenças metabólicas. Este protocolo descreve como alimentar larvas de peixe-zebra com uma refeição rica em lipídios, que consiste em uma emulsão de lipossomas de gema de ovo de galinha criados pela sonicação da gema de ovo em meio embrionário. Instruções detalhadas são fornecidas para rastrear as larvas quanto ao consumo de gema de ovo, para que as larvas que não se alimentam não confundam os resultados experimentais. Os lipossomas de gema de ovo de galinha podem ser enriquecidos com análogos lipídicos fluorescentes, incluindo ácidos graxos e colesterol, permitindo a visualização sistêmica e subcelular do processamento lipídico da dieta. Vários métodos são descritos para montar larvas que são propícias a imagens ao vivo de curto e longo prazo com objetivas verticais e invertidas em alta e baixa ampliação. Além disso, é apresentado um ensaio para quantificar a ingestão de alimentos larvais extraindo os lipídios de larvas alimentadas com análogos lipídicos fluorescentes, identificando os lipídios em uma placa de cromatografia em camada fina e quantificando a fluorescência. Finalmente, são discutidos aspectos críticos dos procedimentos, controles importantes, opções para modificar os protocolos para abordar questões experimentais específicas e possíveis limitações. Essas técnicas podem ser aplicadas não apenas a investigações focadas e orientadas por hipóteses, mas também a uma variedade de telas e técnicas de imagem ao vivo para estudar o metabolismo lipídico da dieta e o controle da ingestão de alimentos.

Quando alimentados com uma cadeira de balanço em 29-31 ° C, a maioria das larvas saudáveis ​​(≥95%) vai comer dentro de 1 hora. Após a consumir a emulsão de gema de ovo, o intestino das larvas em cor escurece. Muito intestinos escuras pode ser observada em 2 horas (Figura 1). Se as larvas estão em jejum ou não avançam, o intestino continua a ser clara. As larvas ovo alimentado exposições branco Um distendidas lúmen intestinal que não escurece na cor. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-p...

O peixe-zebra está emergindo como um modelo valioso de processamento de lipídios na dieta e doenças metabólicas. São descritos protocolos de alimentação de larvas ricas em lipídios, imagens ao vivo de análogos lipídicos fluorescentes da dieta e quantificação da ingestão de alimentos. Essas técnicas podem ser aplicadas a uma variedade de técnicas de triagem, imagem e investigação orientada por hipóteses.

Alto teor de gordura Alimentação Paradigma para larval Zebrafish: Alimentação, Imagens ao vivo, e quantificação da ingestão de alimentos

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

O objetivo geral deste protocolo experimental é alimentar larvas de peixe-zebra com uma refeição rica em lipídios que pode ser enriquecida com um análogo fluorescente de lipídio, a fim de observar a dinâmica de captação de lipídios nas larvas e quantificar a ingestão dietética de lipídios. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de metabolismo e biologia gastrointestinal, como a forma como os lipídios dietéticos são metabolizados e como a ingestão alimentar é regulada. A principal vantagem desta técnica é que análogos fluorescentes de lipídios podem ser eficientemente entregues em lipossomos dietéticos.A transparência óptica do peixe-zebra larval permite a microscopia revelar o processamento de lipídios em nível subcelular. Para começar, suspenda um miligrama de análogo lipídico fluorescente em pó em dois mililitros de clorofórmio a 100% para obter uma concentração final de 0,5 microgramas por microlitro. Aliquote o análogo em tubos de vidro âmbar com tampas rosqueáveis compatíveis com o solvente e que contenham uma junta de teflon.Armazene essas soluções estoque no congelador. Adicione 10,4 microlitros da solução estoque de análogo lipídico fluorescente a 0,5 micrograma por microlitro a um tubo de 1,5 mililitro e seque sob fluxo de nitrogênio, tomando cuidado para não expelir o lipídio para fora do tubo. Reconstitua imediatamente o lipídio seco em cinco microlitros de etanol a 100% pipetando um filete pelas paredes internas do tubo.Em seguida, adicione 95 microlitros de meio para embrião e misture bem por pipetagem para cima e para baixo até que a mistura pareça homogênea. Proteja o tubo da luz e armazene-o em gelo até o momento do uso. Para preparar uma solução de lipossomos fluorescentes de colesterol, adicione quantidade suficiente de estoque do análogo fluorescente de colesterol em um tubo de 1,5 mililitro para obter uma concentração final de 2,5 microgramas por mililitro quando for adicionado à emulsão de gema de ovo.Seque o estoque de colesterol sob um fluxo de nitrogênio, como anteriormente. Imediatamente, reconstitua o análogo fluorescente de colesterol em 15 microlitros de etanol a 100% em temperatura ambiente, pipetando um filete pela lateral do tubo. E misture com 85 microlitros de BSA livre de ácidos graxos a 1% e água.É essencial solubilizar completamente o análogo lipídico fluorescente em etanol e meio para embriões antes de adicioná-lo à emulsão de gema de ovo, para garantir uma distribuição homogênea do lipídio na ração e disponibilidade uniforme para todas as larvas. Proteja o tubo da luz com papel alumínio e armazene-o em gelo. Para preparar a solução alimentar, adicione 19 mililitros de meio para embriões a um tubo cônico de 50 mililitros e, em seguida, adicione uma alíquota de um mililitro de gema de ovo.Vortexe a mistura por um a dois minutos para obter uma emulsão homogênea. Despeje a mistura através de um filtro fino para remover conglomerados proteicos e colete-a em um novo tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, sonique a mistura de ovo cinco vezes, com um segundo ligado e um segundo desligado, utilizando uma microponta cônica de 1/4 de polegada e potência de seis watts.Repita o programa de sonicação mais quatro vezes. Isso cria os lipossomos, que agora devem ser agitados continuamente até o uso para manter a homogeneidade. Adicione a quantidade apropriada de análogos lipídicos fluorescentes a cinco mililitros da mistura de lipossomos imediatamente após a sonicação.Vortexie em alta velocidade por 30 segundos para incorporar os análogos lipídicos fluorescentes aos lipossomos. Proteja a mistura da luz envolvendo o tubo com papel alumínio e retorne-o ao agitador. Adicione cinquenta larvas a um recipiente de alimentação, remova o meio de embrião e adicione 5 mililitros de alimento.Para estimular a ingestão de alimento, balance suavemente as larvas em um agitador incubado e proteja-as da luz, caso análogos lipídicos fluorescentes estejam sendo utilizados. Ao final do período de alimentação, lave as larvas com cinco mililitros de meio para embriões, repetindo o procedimento três vezes. Para imobilizar as larvas, coloque um bloco de metal sobre gelo, cubra-o com um tecido para evitar resfriamento excessivo e, em seguida, posicione as larvas no recipiente com meio para embriões em cima do conjunto para resfriá-las.Observe as larvas em 10x sob um microscópio estereoscópico e determine quais delas consumiram a ração de lipossomos. As larvas que consumiram lipossomos terão o intestino escurecido. É fundamental determinar se uma larva se alimentou verificando o escurecimento do intestino.Tipicamente, de um a cinco por cento das larvas não se alimentarão e poderiam confundir os resultados experimentais se não fossem identificadas e removidas. Para imagens de longa duração com alta magnificação usando uma objetiva invertida, resfrie primeiro as larvas em um bloco de metal sobre gelo. Transfira uma larva para um recipiente com fundo de vidro e remova o meio embrionário por capilaridade com um papel absorvente.Coloque uma gota de agarose a 1,2% de baixo ponto de fusão a 42 graus Celsius sobre a larva e, imediatamente, posicione-a com uma agulha. Retire a placa do bloco frio e deixe a agarose repousar por dois a três minutos. Por fim, adicione um volume suficiente de meio fresco para embrião para cobrir a agarose e evitar a dessecação.Os espécimes agora estão prontos para a obtenção de imagens. Ao final de uma alimentação com lipossomos, reúna no mínimo 10 larvas lavadas em um tubo de 1,5 mililitro. Remova o meio de embrião e, em seguida, congele rapidamente as larvas.Repita em um tubo separado com 10 larvas não alimentadas como controle. Mantendo a amostra em gelo, adicione 100 microlitros de tampão de homogeneização a cada tubo e, em seguida, homogeneíze com um sonicador de microponta. Transfira o tecido para um tubo de cultura de 13 mililitros.Adicione 375 microlitros de uma a duas partes de clorofórmio em metanol a cada suspensão de tampão de homogeneização. Agite em vórtex por 30 a 60 segundos e, em seguida, incube por 10 minutos à temperatura ambiente. Adicione mais 125 microlitros de clorofórmio e agite em vórtex por 30 segundos.Em seguida, adicione 125 microlitros de TRIS 200 milimolar pH 7,5, vortexie por 30 segundos e, então, centrifugue a 2000 ×g durante cinco minutos protegido da luz. Remova as amostras da centrífuga com cuidado para evitar perturbar as fases separadas. Usando uma pipeta de vidro limpa, colete a fase orgânica inferior e transfira para um tubo de vidro limpo de 13 mililitros.Evite cuidadosamente transferir qualquer parte das fases aquosa superior ou de detritos larvais intermediária e descarte-as. Seque a fase orgânica sob vácuo a 0,12 atm, protegendo-a da luz, tomando cuidado para interromper assim que o líquido evaporar. Re-suspenda uma única amostra em 10 microlitros de clorofórmio:metanol na proporção de dois para um e aplique todo o volume da amostra em uma placa de cromatografia em camada delgada com canais.Repita com as amostras restantes, aplicando-as em intervalos igualmente espaçados. Por fim, leia a placa em um leitor de placas com detecção de fluorescência. O exame de larvas mantidas em agitação sob condições experimentais mostra intestinos escurecidos, típicos de peixes que ingeriram a emulsão de gema de ovo.Larvas não alimentadas geralmente possuem intestinos claros, portanto aquelas que não consumiram a fórmula da dieta durante o período de alimentação são facilmente identificáveis. Uma larva alimentada com um análogo fluorescente de lipídio permite visualizar o transporte e o acúmulo desse lipídio dietético. Aqui, o sinal fluorescente é observado em todos os órgãos digestivos após oito horas de alimentação.Vários análogos de lipídios são incorporados a, e assim permitem visualizar, conjuntos exclusivos de estruturas celulares, já que são metabolicamente convertidos em lipídios complexos de maneira diferencial. Aqui, os análogos Fluorescent-C16 e C12 marcam gotículas lipídicas. O análogo Fluorescent-C5 marca ductos hepáticos e pancreáticos, gotículas lipídicas, membranas celulares e redes arteriais.E as etiquetas análogas do Fluorescent-C2 marcam os ductos hepáticos e pancreáticos e as membranas celulares. Ensaios de ingestão alimentar em larvas foram utilizados para estudar a alimentação de larvas selvagens em comparação com larvas transgênicas que superexpressam Apolipoproteína A4B1, e mostraram que, durante alimentações de quatro horas, as larvas transgênicas ingeriram menos do que as larvas selvagens. Os cruzamentos foram normalizados utilizando larvas-controle emparelhadas e não alimentadas.A quantificação da fluorescência de larvas selvagens e transgênicas, que superexpressam Apo A4 após a alimentação, mostra uma ingestão significativamente reduzida nas larvas transgênicas quando comparadas às selvagens. Após dominar a técnica, a ração com análogo lipídico fluorescente de gema de ovo pode ser preparada em cerca de 15 minutos. A ingestão alimentar pode ser quantificada a partir de 10 a 12 amostras agrupadas em aproximadamente quatro horas.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de triar as larvas em busca de defeitos no desenvolvimento que possam comprometer a ingestão de alimento, como mandíbula malformada, intestino subdesenvolvido ou mobilidade reduzida. Métodos como tratamentos farmacológicos ou engenharia do genoma podem ser incorporados a este protocolo experimental com o objetivo de responder perguntas adicionais, como a forma pela qual proteínas específicas e vias de sinalização celular regulam a ingestão alimentar e o metabolismo de lipídios. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de fisiologia gastrointestinal e biologia celular visualizarem o transporte e o acúmulo de lipídios dietéticos em larvas de peixe-zebra.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar uma ração rica em lipídios para larvas de peixe-zebra, triar larvas para a ingestão de alimento, montar larvas para imagens de curto e longo prazo e quantificar a ingestão de alimento. Não se esqueça de que trabalhar com um sonicator pode ser perigoso. Deve-se usar proteção auricular ao realizar este procedimento.

high-fat-feeding-paradigm-for-larval-zebrafish-feeding-live-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Alto teor de gordura Alimentação Paradigma para larval Zebrafish: Alimentação, Imagens ao vivo, e quantificação da ingestão de alimentos (Vídeo) | JoVE Journal

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