Name: O uso de um cartucho de filtro para Amostras de filtração de água e extração de DNA Ambiental (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprenda a extrair DNA ambiental de amostras de água usando cartuchos de filtro sem abrir a carcaça. Este método permite processar grandes volumes de água de forma estéril para metabarcoding de organismos aquáticos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudo foi apoiado como pesquisa básica pelo CREST da Agência de Ciência e Tecnologia do Japão (JST) e por doações da JSPS/MEXT KAKENHI (Número 26291083) e da Fundação Canon para M.M. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

NOTA: Este protocolo não lidar com métodos de amostragem de água e metabarcoding. A água pode ser colhidas amostras de diferentes maneiras, dependendo fins de estudo 16 e veja Miya et al. 12 para detalhes dos métodos metabarcoding usando primers MiFish. Note-se que a água amostra deve ser mantido muito frio e filtrou-se dentro de algumas horas para evitar a degradação de EdNA. Observe também que este protocolo envolve o uso de um agitador rotativo e uma incubadora, e este último deve ser grande o suficiente para acomodar o ex. Além disso, uma centrifugadora que pode acomodar-se a 15 ml e 50 ml de tubos cónicos é indispensável para remover o líquido remanescente no filtro e pós-filtragem para recolher DNA extraído no interior do cartucho, respectivamente. 1. O processamento de uma tampa de rosca e um L saco de plástico 1 NOTA: Ignore esta etapa se o volume de filtração é&gt; 4 L. <ol><li> Perfurar um furo através do centro de um parafuso cAP (ligado a um saco de plástico descartável de 1 L) com o mesmo diâmetro (4,8 mm) como o tubo que se projecta a partir de um conector luer macho. Usando alicates diagonais, encurtar o tubo do conector luer macho de um comprimento apropriado (ca. 3 mm), para evitar o entupimento de uma pequena quantidade de água no interior da tampa depois de filtração. </li><li> Aplicar uma cola adesiva especializada para o polietileno (PE) e polipropileno (PP) para que o fundo e a superfície do conector luer macho e tampa de rosca, respectivamente. Aguarde alguns minutos para uma boa união adesiva (consulte as instruções do fabricante). </li><li> Insira o conector luer macho no buraco da tampa de rosca. Aguardar até que a ligação adesiva completa das duas partes (normalmente&gt; 24 hr). Esterilizar a tampa de rosca com o conector macho luer com 10% de lixívia comercial (ca. 0,6% de hipoclorito de sódio) antes do uso. </li><li> Perfurar dois buracos nos dois cantos inferiores do saco de plástico 1 L, de modo a pendurar-lo de um mesh painel (passo 3). Certifique-se de que o diâmetro dos furos é maior do que o das pontas sobre o painel de malha. </li></ol> 2. Montagem do Sistema de Filtração <ol><li> Prenda o tubo de vácuo elevado para o conector de entrada de uma bomba de aspiração e fixar a outra extremidade do tubo a um colector. Certifique-se de que os três t-válvulas vermelhas do colector estão na &quot;posição de desligado&quot; (ou seja, horizontal). </li><li> Vestindo um jogo limpo de luvas, inserir um luer fêmea montagem e um conector de vácuo nas extremidades superior e inferior do tubo de borracha de vácuo para filtração, respectivamente. </li><li> Cuidadosamente anexar o luer fêmea encaixe para um orifício de saída do cartucho de filtro e montar o conector de vácuo para uma rolha de silicone. </li></ol> 3. Filtração de amostras de água (≤4 L), utilizando o cartucho de filtro NOTA: Ignore esta etapa se o volume de filtração é&gt; 4 L. Este sistema de filtragem requer uma auto-pé painel fou pendurar o saco de plástico cheio com 1 L de água. Um painel de malha, vários dentes, e um suporte para o painel, todos disponíveis a partir de lojas on-line, seria útil para a montagem desta unidade. Autoclave a entrada e saída tampas luer do cartucho do filtro antes do uso. <ol><li> Despeje a 1 L de água recolhidos num saco de plástico e feche a tampa de rosca com o conector luer macho. </li><li> Cuidadosamente ligar um orifício de entrada do cartucho de filtro montado com o conector luer macho do saco de plástico. Não aperte o conector luer-lock; caso contrário, a unidade vai vazar uma vez que o bombeamento começa. Certifique-se de que todas as ligações estão seguras antes de pendurar o saco de plástico a partir de um painel de malha. </li><li> pendurar cuidadosamente o saco de plástico com o cartucho de filtro a partir de dois pinos no painel de malha e inserir uma rolha de silicone a uma porta de entrada do colector. </li><li> Ligue o aspirador. Abra as t-válvulas vermelhas para filtração. Executar o colector até que o cartucho de filtro é seco, then transformar o t-válvula vermelha para a posição desligado. </li><li> Repetir 3.1-3.4 passos até que a quantidade desejada de água é filtrada. NOTA: Para 1 L de água retirado dos recifes de coral subtropicais, leva cerca de três minutos para a filtração. </li><li> Remova cuidadosamente o cartucho do filtro do saco de plástico e o conector de vácuo. </li><li> Tapar ambas as extremidades do cartucho com as tampas de entrada e de saída luer. </li><li> Rotular a tampa do cartucho e luer de entrada adequadamente usando uma caneta de solvente-prova para secagem rápida e rotulagem não-manchas. </li><li> Armazenar o cartucho do filtro a -20 ° C antes da extração de DNA. </li></ol> 4. Filtração de água (&gt; 4 L) amostras utilizando o cartucho de filtro Nota: Ignore esta etapa se o volume de filtração de água é ≤4 L. Este sistema de filtragem requer uma garrafa livro 10 L equipado com uma válvula e uma ponta de pipeta de 10 ml descartável. Um diâmetro interno de 10 ml a ponta da pipeta (15,0 mm) e uma conicidade da pontafinal deve caber a um diâmetro externo da válvula (15,0 mm) e a porta de entrada do cartucho do filtro, respectivamente. Ambas as ligações são firmemente retidas durante a filtração num encaixe por atrito. Esterilizar a ponta da pipeta com lixívia comercial a 10% (cerca de 0,6% de hipoclorito de sódio) antes do uso. <ol><li> Prepara-se uma quantidade apropriada de água amostrada na garrafa livro. Firmemente inserir o 10 ml ponta da pipeta na válvula de 10 L garrafa livro. </li><li> Inserir firmemente a porta de saída do cartucho de filtro na extremidade da ponta da pipeta e inserir a rolha de silicone para o orifício de entrada do colector. Ligue o aspirador. Abra as t-válvulas vermelhas para filtração. Execute o colector até que o cartucho de filtro é seca, em seguida, vire o t-válvula vermelha para a posição desligado. NOTA: Para 10 L de água do mar tomado a partir dos recifes de coral subtropicais exteriores, que leva cerca de 30-40 min para a filtração. </li><li> Remova cuidadosamente o cartucho do filtro do saco de plástico e o conector de vácuo. Cap tantoextremidades do cartucho com as tampas de entrada e de saída luer. Rotular a tampa do cartucho e luer de entrada adequadamente usando uma caneta de solvente-prova para secagem rápida e rotulagem não-manchas. Armazenar o cartucho de filtro a -20 ° C antes da extracção do ADN. </li></ol> 5. Extração de Edna do Filtro NOTA: Nos passos 4 e 5, usamos um kit comercial, em grande parte, na sequência de um protocolo para &quot;sangue nucleada&quot; fornecido pelo kit. Para simplificar, descreve-se o procedimento para o processamento de um cartucho individual. Na prática, recomenda-processamento 8 (ou o número máximo de centrífuga) ou menos filtros de cada vez. <ol><li> Pré-aqueça uma incubadora a 56 ° C. </li><li> Preparar um tubo de 2,0 ml por corte da tampa articulada do tubo. Elimine a tampa. NOTA: Este tubo é usado como tubo de recolha para o líquido remanescente no filtro. </li><li> Remova a entrada (NÃO saída) tampa luer do cartucho do filtro e inserir o i porta de entradanto do tubo de coleta. Firmemente selar um tubo de ligação entre o cartucho e a recolha utilização de uma película de auto-selagem. </li><li> Insira a unidade combinados em um adaptador de centrífuga para um tubo cônico de 15 ml. Centrifuga-se o cartucho em 5000 xg durante 1 min para remover o líquido remanescente no filtro. </li><li> Remover o tubo de recolha do cartucho de filtro e rejeitar o tubo. Re-tampa da abertura de entrada do cartucho. </li><li> Prepara-se uma mistura de 20 ul de solução de proteinase-K, 220 ul de PBS (salino tamponado com fosfato; não fornecida pelo kit) e 200 ul de tampão de AL. NOTA: O cartucho do filtro acomoda até quatro vezes os volumes de mistura (. Ca 1,8 ml). </li><li> Retire a tampa de entrada e adicione a mistura (440 mL) para dentro do cartucho do filtro utilizando uma ponta de pipeta. Inserir a pipeta completamente para dentro da abertura de entrada de modo a que a ponta da pipeta é visível no interior do cartucho imediatamente acima da membrana. </li><li> Re-tampa da abertura de entrada e posicionar o carro filtroTridge num agitador rotativo. </li><li> Coloque o agitador rotativo na incubadora pré-aquecido a 56 ° C e ligar o agitador a uma velocidade de 20 rpm durante 20 min. </li><li> Durante a incubação, preparar um novo tubo de 2,0 ml, rotular o tubo adequadamente usando uma caneta de solvente-prova e colocá-lo em um tubo cônico de 50 ml. NOTA: Os primeiros (2,0 ml) e últimos tubos (50 ml) são utilizados para a recolha do ADN extraído e para segurar o tubo de 2,0 ml, respectivamente. </li><li> Após a incubação, remover a tampa de entrada e inserir a entrada (NÃO saída) da porta do cartucho dentro do tubo de 2,0 ml dentro do tubo de 50 ml. Fechar o tubo cónico de 50 ml com uma tampa de rosca. </li><li> Centrifuga-se o tubo cónico de 50 ml a 5000 xg durante 1 min para recolher o ADN extraído a partir do cartucho. Remova o cartucho do filtro e do tubo de 2,0 ml usando uma pinça esterilizados e tampa do tubo. Descarte o cartucho do filtro. </li></ol> 6. Purificação de DNA extraído NOTA: Nós eluir Edna com 100 ul de tampão AE em vez de 200 ul especificadas no manual do kit comercial. <ol><li> Adicionar 200 uL de etanol (96-100%) para o DNA extraído no tubo de 2,0 ml a partir do passo acima (ca. 440 uL), e homogeneizar por agitação em vórtex. </li><li> Pipetar a mistura numa coluna de rotação colocados num tubo de recolha de 2 ml. Centrifugar a 5.000 xg durante 1 min. Descartar o escoamento e o tubo de recolha. </li><li> Colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 2 ml, adicionar 500 ul de tampão de AW1, e centrifugação durante 1 min a 5000 x g. Descartar o escoamento e o tubo de recolha. </li><li> Colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 2 ml, adicionar AW2 tampão de 500 ul, e centrifuga-se durante 3 min a 20.000 x g. Descartar o escoamento e o tubo de recolha. </li><li> Prepare um novo tubo de 1,5 ml (não fornecido no kit) e rotular o tubo adequadamente usando uma caneta à prova d&#39;água para a secagem rápida e não-manchando rotulagem. Transferir a coluna de centrifugação tO tubo de 1,5 ml. </li><li> Elui-se o ADN por adição de 100 ul de tampão AE para o centro da membrana por coluna de centrifugação. Incubar durante 1 min à temperatura ambiente, e depois centrifugar a 6000 xg durante 1 min. </li><li> Descartar a coluna de rotação e tampa do tubo. Armazenar o ADN purificado a -20 ° C. </li></ol>

<ol><li>Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+environmental+DNA+to+estimate+the+distribution+of+an+invasive+fish+species+in+ponds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds.</a> PLoS ONE. 8, e56584(2013).</li>
<li>Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+fish+biomass+using+environmental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Estimation of fish biomass using environmental DNA.</a> PLoS ONE. 7, e35868(2012).</li>
<li>Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+near-extinct+European+weather+loach+in+Denmark+based+on+environmental+DNA+from+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Conserv%22%5BJournal%5D)">Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples.</a> Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).</li>
<li>Jerde, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Asian+carp+DNA+as+part+of+a+Great+Lakes+basin-wide+surveillance+program%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Fish.+Aquat.+Sci%22%5BJournal%5D)">Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program.</a> Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).</li>
<li>Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BSight-unseen%26%2334%3B+detection+of+rare+aquatic+species+using+environmental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Conserv.+Lett%22%5BJournal%5D)">&#34;Sight-unseen&#34; detection of rare aquatic species using environmental DNA.</a> Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).</li>
<li>Mahon, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+eDNA+surveillance+sensitivity+for+detection+of+Asian+carps+in+controlled+and+field+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments.</a> PLoS ONE. 8, e58316(2013).</li>
<li>Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+of+fish+species+composition+using+environmental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology%22%5BJournal%5D)">Surveillance of fish species composition using environmental DNA.</a> Limnology. 13, 193-197 (2012).</li>
<li>Keskin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+invasive+freshwater+fish+species+using+environmental+DNA+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Syst.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey.</a> Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).</li>
<li>Wilcox, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+detection+of+rare+species+using+environmental+DNA%3A+the+importance+of+primer+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity.</a> PLoS ONE. 8, e59520(2013).</li>
<li>Thomsen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+a+diverse+marine+fish+fauna+using+environmental+DNA+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples.</a> PLoS ONE. 7, e41732(2012).</li>
<li>Kelly, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+DNA+to+improve+environmental+management%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Harnessing DNA to improve environmental management.</a> Science. 344, 1455-1456 (2014).</li>
<li>Miya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mifish%2C+a+set+of+universal+PCR+primers+for+metabarcoding+environmental+DNA+from+fishes%3A+detection+of+more+than+230+subtropical+marine+species%5BTitle%5D)+AND+%22Roy.+Soc.+Open+Sci%22%5BJournal%5D)">Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species.</a> Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088(2015).</li>
<li>Port, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+vertebrate+biodiversity+in+a+kelp+forest+ecosystem+using+environmental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA.</a> Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).</li>
<li>Yamamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+DNA+provides+a+%27snapshot%27+of+fish+distribution%3A+a+case+study+of+Japanese+jack+mackerel+in+Maizuru+Bay%2C+Sea+of+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Environmental DNA provides a 'snapshot' of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan.</a> PLoS ONE. 11, e0149786(2016).</li>
<li>Valentini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+monitoring+of+aquatic+biodiversity+using+environmental+DNA+metabarcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding.</a> Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).</li>
<li>Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+The+detection+of+aquatic+animal+species+using+environmental+DNA+-+a+review+of+eDNA+as+a+survey+tool+in+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology.</a> J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).</li>
<li>Stewart, F. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStewart%2C+FJ+%22Microbial+metagenomics%2C+Metatranscriptomics%2C+and+metaprotenomics+Vol.+531+Methods+in+Enzymology%22">Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology</a>. DeLong, E. E. 10, Elsevier. Ch. 10 187-218 (2013).</li>
<li>Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+%2820L%2B%29+filtration+of+coastal+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples.</a> J Vis Exp. (28), e1161(2009).</li>
<li>Smalla, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmalla%2C+K+%22Molecular+Microbial+Ecology+Manual%22">Molecular Microbial Ecology Manual</a>. Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. , Springer. 13-22 (1995).</li>
<li>Thomsen, P. F., Willerslev, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+DNA+-+An+emerging+tool+in+conservation+for+monitoring+past+and+present+biodiversity%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Conserv%22%5BJournal%5D)">Environmental DNA - An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity.</a> Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).</li>
<li>Pedersen, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+and+modern+environmental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Ancient and modern environmental DNA.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383(2015).</li>
<li>Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+basin+scale+application+of+environmental+DNA+assessment+for+rare+endemic+species+and+closely+related+exotic+species+in+rivers%3A+a+case+study+of+giant+salamanders+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Ecol%22%5BJournal%5D)">A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan.</a> J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).</li>
<li>Yamanaka, H., Minamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+environmental+DNA+of+fishes+as+an+efficient+method+of+determining+habitat+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol.+Indicators%22%5BJournal%5D)">The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity.</a> Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).</li>
<li>Moss, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliated+protists+from+the+nepheloid+layer+and+water+column+of+sites+affected+by+the+Deepwater+Horizon+oil+spill+in+the+Northeastern+Gulf+of+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22Deep+Sea+Res.+Pt+I%22%5BJournal%5D)">Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico.</a> Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).</li>
<li>Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metatranscriptomics+of+N2-fixing+cyanobacteria+in+the+Amazon+River+plume%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume.</a> The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).</li>
<li>Deiner, K., Walser, J. -C., Mächler, E., Altermatt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+capture+and+extraction+methods+affect+detection+of+freshwater+biodiversity+from+environmental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Conserv%22%5BJournal%5D)">Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA.</a> Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).</li>
<li>Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+techniques+to+capture+and+extract+environmental+DNA+for+detection+and+quantification+of+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol.+Res%22%5BJournal%5D)">Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish.</a> Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).</li>
<li>Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLemarchand%2C+K+%22Sample+Preparation+Techniques+for+Soil%2C+Plant%2C+and+Animal+Samples%27Springer+Protocols+Handbooks%22">Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples'Springer Protocols Handbooks</a>. Micic, M. , Springer. 325-339 (2016).</li>
<li>Turner, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+size+distribution+and+optimal+capture+of+aqueous+macrobial+eDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Ecol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA.</a> Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).</li>
<li>Barnes, M. A., Turner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecology+of+environmental+DNA+and+implications+for+conservation+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Conserv.+Genet%22%5BJournal%5D)">The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics.</a> Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).</li>
<li>Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopolymers+for+sample+collection%2C+protection%2C+and+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biopolymers for sample collection, protection, and preservation.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).</li>
<li>Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+room+temperature+preservation+of+filtered+environmental+DNA+samples+and+assimilation+into+a+Phenol-Chloroform-Isoamyl+alcohol+DNA+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol.+Res%22%5BJournal%5D)">The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction.</a> Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Em muitos estudos metabarcoding utilizando amostras ambientais, tais como a água eo solo, tratamento pós-filtração do cartucho de filtro é geralmente da seguinte forma 24,25: 1) o corte aberto ou fissuras da caixa com ferramentas manuais (cortador de tubos ou um alicate); 2) remoção do filtro a partir do cartucho; e 3) o filtro de corte em pedaços pequenos com uma lâmina de barbear para a extracção do ADN. Para evitar tais pesado e procedimentos que são propensas à contaminação no laboratório demorado, nós te...

DNA Ambiental (Edna) em ambientes aquáticos refere-se a material genético encontrado na coluna de água. Estudos recentes demonstraram a utilidade de Edna para a detecção de peixes de vários ambientes aquáticos, incluindo lagoas 1-3, 4-8 rios, córregos 9, e água do mar 10-14. A maioria destes estudos focados em detecção de um único ou poucos invasiva 1,4-6,8,14 e raras ou ameaçadas espécies de 3,9, enquanto alguns estudos recentes tentativa de detecção simultânea de múltiplas espécies em comunidades de peixes locais 7,9, 12,13,15 e mesocosmos 11,12. A última abordagem é chamada de &quot;metabarcoding&quot; e Edna metabarcoding utiliza um ou vários conjuntos de primers de PCR para coamplify uma região do gene através de amostras taxonomicamente diversas. Isto é seguido por uma preparação da biblioteca com indexação e adição do adaptador, e as bibliotecas indexados são analisados ​​por uma sequenciação de alto rendimento paraleloplataforma. Recentemente Miya et al. 12 desenvolveram iniciadores de PCR universais para metabarcoding Edna de peixes (chamados &quot;MiFish&quot;). Os primers MiFish alvo uma região hipervariável do gene 12S rRNA mitocondrial (163-185 pb), que contém informações suficientes para identificar os peixes a família taxonômica, gênero e espécie, exceto para alguns dos congéneres estreitamente relacionadas. Com o uso desses iniciadores em Edna metabarcoding, Miya et al. 12 detectou mais de 230 espécies marinhas subtropicais de aquários com conhecidos de composição de espécies e os recifes de coral perto do aquário. Além de otimizar o protocolo metabarcoding para acomodar a água do mar natural, com diferentes níveis de concentração de Edna de peixes, temos notado que os primers MiFish ocasionalmente falhou para amplificar a região alvo para a preparação da biblioteca subsequente. Uma das razões mais prováveis ​​para esta amplificação PCR vencida é a falta de quantidades adequadas de teADN mplate contida em pequenos volumes de água filtrada (isto é, 1-2 G). Embora a concentração Edna de um grupo taxonômico específico é desconhecido antes da amplificação, filtragem de grandes volumes de água (&gt; 1-2 L) seria um meio simples e eficaz para recolher mais Edna dos ambientes aquáticos com abundância de peixes raros e de biomassa, tal como -mar aberto e de profundidade ecossistemas. Em relação a filtros de fibra de disco convencionalmente utilizados em uma série de pesquisas EdNA peixe 16, os cartuchos de filtro têm a vantagem de acomodar maiores volumes de água antes de entupimento 17. Na verdade, um estudo recente mostrou grande volume (&gt; 20 L) filtração de amostras de água do mar costeiras usando cartuchos de filtro 18. Além disso, eles são embalados individualmente e estéril, e vários passos do fluxo de trabalho experimental pode ser realizada no invólucro do filtro, reduzindo assim a probabilidade de contaminação a partir do laboratório de 19. O últimoO recurso é fundamental para Edna metabarcoding, em que o risco de contaminação permanece entre os maiores experimental desafia 20,21. Apesar destas vantagens técnicas de cartuchos de filtro, que não tem sido usado em estudos EdNA de peixes com duas excepções 8,15. Aqui nós fornecemos um protocolo para a filtração de amostras de água com o cartucho de filtro e a extracção de EdNA a partir do seu filtro sem ter que cortar abrir o invólucro. Nós também fornecemos dois sistemas de filtração de água alternativas, dependendo dos volumes de água (≤4 L ou&gt; 4 L). Para comparar o desempenho do protocolo recém-desenvolvido e um protocolo previamente utilizados através de um filtro de fibra de vidro em nosso grupo de pesquisa 12,14,22,23, eu executo Edna metabarcoding análise da água do mar a partir de um tanque do aquário enorme (7.500 m 3 ) com a composição de espécies conhecidas, e mostrar o número de espécies detectadas derivados dos dois protocolos como resultados representativos. Este protocolo hcomo foi desenvolvido para metabarcoding EdNA de peixes, mas também é aplicável a EdNA de outros organismos.

<table><tbody><tr><td>Painel de malha</td><td>Iris Ohyama</td><td>MPP-3060-BE</td><td></td></tr><tr><td>Pino de metal</td><td>Iris Ohyama</td><td>MR12F</td><td></td></tr><tr><td>Suporte para o painel de malha</td><td>Sem marca</td><td>4184-9507</td><td>disponível na Amazon Japan</td></tr><tr><td>Saco plástico de 1 L com tampa de rosca</td><td>Yanagi</td><td>DP16-TN1000</td><td></td></tr><tr><td>Conector luer-lock macho</td><td>ISIS</td><td>11620</td><td></td></tr><tr><td>Ponta de pipeta de 10 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 000.765</td><td></td></tr><tr><td>Garrafa de livro de 10 L com válvula</td><td>As One</td><td>1-2169-01</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Sterivex-HV</td><td>Millipore</td><td>SVHVL10RC</td><td>indicado como "cartucho de filtro" em todo o ms e usado no protocolo</td></tr><tr><td>Conexão luer macho</td><td>As One</td><td>1-7379-04</td><td></td></tr><tr><td>Conexão luer fêmea</td><td>As One</td><td>5-1043-14&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tampa luer de entrada</td><td>ISIS</td><td>VRMP6</td><td></td></tr><tr><td>Tampa luer de saída</td><td>ISIS</td><td>VRFP6</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação de alto vácuo</td><td>como um</td><td>6-590-01</td><td></td></tr><tr><td>Conector de vácuo</td><td>como um</td><td>6-663-02</td><td></td></tr><tr><td>Rolha de silicone</td><td>como um</td><td>1-7650-07</td><td></td></tr><tr><td>Manifold</td><td>como um</td><td>2-258-01</td><td></td></tr><tr><td>Aspirador-GAS-1</td><td>Como Um</td><td>1-7483-21</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Sangue & Kit de Tecido (250)</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>PowerWater Sterivex Kit de Isolamento de DNA</td><td>MO BIO</td><td>14600-50-NF</td><td>indicado como "kit opcional" no ms</td></tr><tr><td>Centrífuga de Mesa</td><td>Kubota</td><td>Modelo 4000</td><td>Velocidade máxima 6.000 rpm</td></tr><tr><td>Rotor de ângulo fixo Adaptador</td><td>Kubota</td><td>AT-508C</td><td></td></tr><tr><td>para um tubo cônico de 15 ml</td><td>Kubota</td><td>055-1280</td><td></td></tr><tr><td>Solução de estabilização de RNAlater</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Parafilm</td><td>PM992</td><td>denotado como "filme autovedante"</td></tr></tbody></table>

o uso de um cartucho de filtro para amostras de filtração de água e extração de dna ambiental

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

Estudos recentes demonstraram que o uso de DNA ambiental (eDNA) de peixes é apropriado como uma ferramenta de monitoramento não invasiva. A maioria desses estudos empregou filtros de fibra de disco para coletar eDNA de amostras de água, embora vários estudos microbianos em ambientes aquáticos tenham empregado cartuchos de filtro, porque o cartucho tem a vantagem de acomodar grandes volumes de água e de facilidade geral de uso. Aqui, fornecemos um protocolo para filtração de amostras de água usando o cartucho do filtro e extração de eDNA do filtro sem ter que abrir a carcaça. As principais partes deste protocolo consistem em 1) filtração de amostras de água (volumes de água ≤4 L ou >4 L); (2) extração de DNA no filtro usando um agitador de rolos colocado em uma incubadora pré-aquecida; e (3) purificação do DNA usando um kit comercial. Com o uso deste e de protocolos usados anteriormente, realizamos análises de metabarcoding de eDNA retirado de um enorme tanque de aquário (7.500 m3) com composição de espécies conhecidas, e mostramos o número de espécies detectadas por biblioteca dos dois protocolos como resultados representativos. Este protocolo foi desenvolvido para metabarcoding eDNA de peixes, mas também é aplicável ao eDNA de outros organismos.

É tecnicamente difícil isolar e quantificar única Edna peixe da Edna volume extraído, porque os primers MiFish coamplify região alvo de alguns vertebrados não-peixes, tais como aves e mamíferos, com produtos de PCR do mesmo tamanho (ca. 170 pb ) 12. Em vez de quantificar peixes Edna, realizamos MiFish metabarcoding análise de Edna de um tanque do aquário com composição de espécies conhecidas usando dois métodos diferentes de filtração e extracção do ADN e comparar os ...

Descrevemos um protocolo para filtração de amostras de água com um cartucho de filtro e extração de DNA ambiental (eDNA) sem ter que abrir a caixa para remover o filtro. Este protocolo é desenvolvido para metabarcoding eDNA de peixes, mas também é aplicável a eDNA de outros organismos.

O uso de um cartucho de filtro para Amostras de filtração de água e extração de DNA Ambiental

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

O objetivo geral deste protocolo é filtrar amostras de água com um cartucho de filtro e extrair o DNA ambiental sem a necessidade de cortar o invólucro para remover o filtro, a fim de realizar o metabarcoding de eDNA de diversos organismos aquáticos. Este método pode auxiliar na resposta de questões fundamentais na área ecológica, como o monitoramento da biodiversidade e a ecologia de comunidades. A principal vantagem desta técnica é que os cartuchos de filtro podem acomodar maiores volumes de água e a filtração e extração de DNA podem ser realizadas de maneira estéril.Para iniciar este procedimento, conecte uma tubulação de vácuo alto ao conector de entrada de uma bomba de aspiração. Conecte a outra extremidade da tubulação a um manifold. Certifique-se de que as três válvulas em T vermelhas no manifold estejam na posição desligada.Em seguida, coloque um novo par de luvas limpas. Insira um encaixe luer fêmea na extremidade superior da mangueira de vácuo de borracha. Depois, insira um conector de vácuo na extremidade inferior.Acople cuidadosamente o encaixe luer fêmea a uma porta de saída do cartucho do filtro. Em seguida, conecte o conector de vácuo a uma rolha de silicone. Despeje um litro de água amostrada dentro do saco plástico preparado.Envolva a tampa rosqueável com o conector luer-lock macho. Em seguida, conecte cuidadosamente um orifício de entrada do cartucho de filtro montado ao conector luer-lock macho. Certifique-se de que todas as conexões estejam firmes.Em seguida, pendure a bolsa plástica em dois ganchos no painel de malha. Insira uma rolha de silicone na porta de entrada do manifold. Depois, ligue o aspirador.Abra as válvulas em T vermelhas para filtração. Execute o sistema até que o cartucho do filtro esteja seco. Em seguida, feche as válvulas em T vermelhas.Repita todo este processo para filtrar a quantidade desejada de água. Após toda a água coletada ter sido filtrada, remova cuidadosamente o cartucho do filtro da bolsa plástica e do recipiente a vácuo. Tampe ambas as extremidades do cartucho com as tampas luer apropriadas.Em seguida, utilizando uma caneta resistente a solventes, identifique o cartucho e a tampa do conector de entrada. Armazene a 20 graus Celsius até o momento de realizar a extração de DNA. Para amostras maiores que quatro litros, prepare um frasco de dez litros conforme detalhado no protocolo textual.Adicione a amostra de água a ser filtrada. Em seguida, insira firmemente uma ponteira de pipeta de dez mililitros na válvula do frasco tipo livro. Insira firmemente a porta de entrada do cartucho do filtro na ponteira de pipeta.Em seguida, insira uma rolha de silicone na porta de entrada do manifold. Ligue o aspirador. Depois, abra as válvulas em T vermelhas para filtração.Execute o sistema até que o cartucho do filtro esteja seco. Após a conclusão da filtração, feche as válvulas em T vermelhas. Remova cuidadosamente o cartucho da bolsa plástica e do conector de vácuo.Em seguida, tampe ambas as extremidades do cartucho com as tampas luer apropriadas. Utilize uma caneta resistente a solventes para rotular o cartucho e a tampa luer de entrada. Armazene a 20 graus Celsius até o momento de realizar a extração de DNA.Pré-aqueça uma estufa a 56 graus Celsius. Em seguida, corte a tampa articulada de um tubo de 2,0 mililitros e descarte a tampa. Remova a tampa luer de entrada do cartucho de filtro.Em seguida, insira o orifício de entrada no tubo de 2,0 mililitros. Usando uma película autoadesiva, feche firmemente a conexão entre o cartucho e o tubo de coleta. Depois, insira a unidade combinada em um adaptador de centrífuga para tubo cônico de 15 mililitros.Centrifugue o cartucho por um minuto a 5000 vezes g para remover o líquido remanescente no filtro. Após a conclusão da centrifugação, remova o tubo de coleta do cartucho do filtro e descarte o tubo. Em seguida, tampe a entrada.Em seguida, misture 20 microlitros da solução de proteína A-Case, 220 microlitros de solução salina tamponada com fosfato e 200 microlitros do tampão AL. Remova a tampa da entrada e adicione a mistura na cartela usando uma pipeta, inserindo completamente a pipeta na porta de entrada. Tampe novamente a porta de entrada. Em seguida, coloque a cartela de filtro em um agitador rotativo.Coloque o agitador rotativo no incubador pré-aquecido e ajuste o agitador para 20 rpm durante 20 minutos. Durante a incubação, identifique um novo tubo de 2,0 mililitros com uma caneta resistente a solventes. Em seguida, coloque-o em um tubo cônico de 50 mililitros.Após a conclusão da incubação, remova a tampa de entrada. Em seguida, insira a porta de entrada no novo tubo de 2,0 mililitros. Tampe o tubo cônico com uma tampa de rosca.Centrifugue por um minuto a 5000 vezes g para recolher o DNA extraído. Em seguida, remova o cartucho no tubo de 2,0 mililitros usando pinças esterilizadas. Tampe o tubo e purifique o DNA extraído conforme descrito no protocolo textual.Neste procedimento, quatro volumes diferentes de água do mar são filtrados no mesmo manifold utilizando dois filtros distintos, e o DNAe é posteriormente extraído. O cartucho de filtro detectou, em média, 50% mais espécies do que os filtros de fibra de vidro. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas horas, se for executada corretamente.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como filtrar amostras de água com um cartucho de filtro e de como extrair eDNA sem precisar cortar o invólucro para remover o filtro, no contexto de eDNA de metabarcodificação de diversos organismos aquáticos.

use-filter-cartridge-for-filtration-water-samples-extraction

Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Nós descrevemos um método para extração de DNA genômico de alto peso molecular a partir da biomassa planctônica concentrou-se em 0,22 mM filtros Sterivex, seguido por centrifugação em gradiente de cloreto de césio densidade para purificação.

Extração de DNA de 0,22 mM Sterivex Filtros e Césio cloreto de centrifugação em gradiente de densidade

Este manuscrito descreve uma abordagem automatizada de seleção de tamanho de gel para purificar fragmentos de DNA para sequenciamento de próxima geração. A tecnologia Ranger fornece automação completa de todo o processo de carregamento de gel de agarose, análise eletroforética e recuperação de fragmentos de DNA direcionados, permitindo bibliotecas de sequenciamento de última geração de alto rendimento e alta qualidade.

Automated Gel seleção de tamanho para melhorar a qualidade das bibliotecas de sequenciação de próxima geração Preparado a partir de amostras de água do ambiente

Este protocolo é para a extração e concentração de proteína e DNA de biomassa microbiana coletada da água do mar, seguida pela geração de peptídeos trípticos adequados para análise proteômica baseada em espectrometria de massa em tandem.

Um Aquatic Microbial metaproteômica fluxo de trabalho: a partir de células para Tryptic Peptides adequado para análise baseada em espectrometria de massa em tandem

Duas análises complementares de partículas biológicas atmosféricas de filtros de amostras de ar são descritas aqui: a extração e detecção de endotoxina e de DNA.

Análise Filtro amostrado-Air para endotoxinas e conteúdo de DNA

Descrevemos aqui um método de extração de DNA simples e rápido em papel de DNA pró-viral do HIV de sangue total detectado por PCR quantitativa. Este protocolo pode ser estendida para utilização na detecção de outros marcadores genéticos, ou utilizando métodos de amplificação alternativos.

Isolamento de filtração de Ácidos Nucleicos: Um Método de extracção de DNA simples e rápido

Aqui, apresentamos um protocolo para investigar os impactos da fratura hidráulica nos córregos próximos, analisando suas comunidades microbianas de água e sedimentos.

Avaliando o impacto da fratura hidráulica nos córregos usando assinaturas moleculares microbianas

Aqui, apresentamos uma técnica simples para avaliar a resistência antimicrobiana ambiental (AMR), aumentando a proporção de DNA extracelular de baixo peso molecular. O tratamento prévio com 20%-30% de PEG e 1,2 M NaCl permite a detecção de genes de AMR genômicos e transferidos horizontalmente. O protocolo se presta a um processo sem kit com otimização adicional.

Extração aprimorada de DNA de baixo peso molecular de águas residuais para avaliação abrangente da resistência antimicrobiana 

Aqui, apresentamos um novo protocolo para recuperar o eDNA marinho por meio da coleta e filtragem de amostras de água do mar de balsas em operação e outras embarcações comerciais.

O Laboratório Flutuante: Procedimento Operacional Padrão para Coleta e Filtragem de Amostras de Água do Mar de Balsas em Operação para Análise de DNA Ambiental

Formas confiáveis e precisas de análise de DNA implantável em campo são cruciais para muitas indústrias. Este artigo oferece dois métodos para análise microbiana ambiental em campo: 1) o isolamento de DNA microbiano de amostras ambientais usando um kit de extração biológica de campo, e 2) a análise do DNA via unidade qPCR de campo.

Análise de DNA microbiano em campo usando um kit de extração biológica de campo e uma unidade qPCR de campo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho padronizado para coletar amostras de DNA ambiental de cetáceos (eDNA) de embarcações de observação de baleias. A viabilidade para pesquisadores e cientistas cidadãos treinados é priorizada, enquanto condições ambientais, tempo de filtragem, turbidez e logística a bordo definem os limites práticos de sua aplicação.

Amostragem de DNA Ambiental de Embarcações de Observação de Baleias para Monitoramento de Cetáceos

Aprenda a extrair DNA ambiental de amostras de água usando cartuchos de filtro sem abrir a carcaça. Este método permite processar grandes volumes de água de forma estéril para metabarcoding de organismos aquáticos.

O uso de um cartucho de filtro para Amostras de filtração de água e extração de DNA Ambiental

Explorar mais vídeos