O uso de um cartucho de filtro para Amostras de filtração de água e extração de DNA Ambiental

O objetivo geral deste protocolo é filtrar amostras de água com um cartucho de filtro e extrair o DNA ambiental sem a necessidade de cortar o invólucro para remover o filtro, a fim de realizar o metabarcoding de eDNA de diversos organismos aquáticos. Este método pode auxiliar na resposta de questões fundamentais na área ecológica, como o monitoramento da biodiversidade e a ecologia de comunidades. A principal vantagem desta técnica é que os cartuchos de filtro podem acomodar maiores volumes de água e a filtração e extração de DNA podem ser realizadas de maneira estéril.

Para iniciar este procedimento, conecte uma tubulação de vácuo alto ao conector de entrada de uma bomba de aspiração. Conecte a outra extremidade da tubulação a um manifold. Certifique-se de que as três válvulas em T vermelhas no manifold estejam na posição desligada.

Em seguida, coloque um novo par de luvas limpas. Insira um encaixe luer fêmea na extremidade superior da mangueira de vácuo de borracha. Depois, insira um conector de vácuo na extremidade inferior.

Acople cuidadosamente o encaixe luer fêmea a uma porta de saída do cartucho do filtro. Em seguida, conecte o conector de vácuo a uma rolha de silicone. Despeje um litro de água amostrada dentro do saco plástico preparado.

Envolva a tampa rosqueável com o conector luer-lock macho. Em seguida, conecte cuidadosamente um orifício de entrada do cartucho de filtro montado ao conector luer-lock macho. Certifique-se de que todas as conexões estejam firmes.

Em seguida, pendure a bolsa plástica em dois ganchos no painel de malha. Insira uma rolha de silicone na porta de entrada do manifold. Depois, ligue o aspirador.

Abra as válvulas em T vermelhas para filtração. Execute o sistema até que o cartucho do filtro esteja seco. Em seguida, feche as válvulas em T vermelhas.

Repita todo este processo para filtrar a quantidade desejada de água. Após toda a água coletada ter sido filtrada, remova cuidadosamente o cartucho do filtro da bolsa plástica e do recipiente a vácuo. Tampe ambas as extremidades do cartucho com as tampas luer apropriadas.

Em seguida, utilizando uma caneta resistente a solventes, identifique o cartucho e a tampa do conector de entrada. Armazene a 20 graus Celsius até o momento de realizar a extração de DNA. Para amostras maiores que quatro litros, prepare um frasco de dez litros conforme detalhado no protocolo textual.

Adicione a amostra de água a ser filtrada. Em seguida, insira firmemente uma ponteira de pipeta de dez mililitros na válvula do frasco tipo livro. Insira firmemente a porta de entrada do cartucho do filtro na ponteira de pipeta.

Em seguida, insira uma rolha de silicone na porta de entrada do manifold. Ligue o aspirador. Depois, abra as válvulas em T vermelhas para filtração.

Execute o sistema até que o cartucho do filtro esteja seco. Após a conclusão da filtração, feche as válvulas em T vermelhas. Remova cuidadosamente o cartucho da bolsa plástica e do conector de vácuo.

Em seguida, tampe ambas as extremidades do cartucho com as tampas luer apropriadas. Utilize uma caneta resistente a solventes para rotular o cartucho e a tampa luer de entrada. Armazene a 20 graus Celsius até o momento de realizar a extração de DNA.

Pré-aqueça uma estufa a 56 graus Celsius. Em seguida, corte a tampa articulada de um tubo de 2,0 mililitros e descarte a tampa. Remova a tampa luer de entrada do cartucho de filtro.

Em seguida, insira o orifício de entrada no tubo de 2,0 mililitros. Usando uma película autoadesiva, feche firmemente a conexão entre o cartucho e o tubo de coleta. Depois, insira a unidade combinada em um adaptador de centrífuga para tubo cônico de 15 mililitros.

Centrifugue o cartucho por um minuto a 5000 vezes g para remover o líquido remanescente no filtro. Após a conclusão da centrifugação, remova o tubo de coleta do cartucho do filtro e descarte o tubo. Em seguida, tampe a entrada.

Em seguida, misture 20 microlitros da solução de proteína A-Case, 220 microlitros de solução salina tamponada com fosfato e 200 microlitros do tampão AL. Remova a tampa da entrada e adicione a mistura na cartela usando uma pipeta, inserindo completamente a pipeta na porta de entrada. Tampe novamente a porta de entrada. Em seguida, coloque a cartela de filtro em um agitador rotativo.

Coloque o agitador rotativo no incubador pré-aquecido e ajuste o agitador para 20 rpm durante 20 minutos. Durante a incubação, identifique um novo tubo de 2,0 mililitros com uma caneta resistente a solventes. Em seguida, coloque-o em um tubo cônico de 50 mililitros.

Após a conclusão da incubação, remova a tampa de entrada. Em seguida, insira a porta de entrada no novo tubo de 2,0 mililitros. Tampe o tubo cônico com uma tampa de rosca.

Centrifugue por um minuto a 5000 vezes g para recolher o DNA extraído. Em seguida, remova o cartucho no tubo de 2,0 mililitros usando pinças esterilizadas. Tampe o tubo e purifique o DNA extraído conforme descrito no protocolo textual.

Neste procedimento, quatro volumes diferentes de água do mar são filtrados no mesmo manifold utilizando dois filtros distintos, e o DNAe é posteriormente extraído. O cartucho de filtro detectou, em média, 50% mais espécies do que os filtros de fibra de vidro. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas horas, se for executada corretamente.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como filtrar amostras de água com um cartucho de filtro e de como extrair eDNA sem precisar cortar o invólucro para remover o filtro, no contexto de eDNA de metabarcodificação de diversos organismos aquáticos.