O uso de um cartucho de filtro para Amostras de filtração de água e extração de DNA Ambiental

O objetivo geral deste protocolo é filtrar amostras de água com um cartucho de filtro e extrair DNA ambiental sem ter que abrir o invólucro para remover o filtro do eDNA de metabarcoding de vários organismos aquáticos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo ecológico, como monitoramento da biodiversidade e ecologia de comunidades. A principal vantagem desta técnica é que os cartuchos de filtro podem acomodar volumes maiores de água e a filtração e extração de DNA podem ser realizadas de maneira estéril.

Para iniciar este procedimento, conecte a tubulação de alto vácuo ao conector de entrada de uma bomba aspiradora. Conecte a outra extremidade da tubulação a um coletor. Certifique-se de que as três válvulas T vermelhas no coletor estejam na posição desligada.

Em seguida, coloque um conjunto limpo de luvas. Insira um encaixe luer fêmea na extremidade superior do tubo de borracha a vácuo. Em seguida, insira um conector de vácuo na extremidade inferior.

Conecte cuidadosamente o encaixe luer fêmea a uma porta de saída do cartucho do filtro. Em seguida, conecte o conector de vácuo a uma rolha de silicone. Despeje um litro de água amostrada no saco plástico preparado.

Coloque a tampa de rosca com o conector luer-lock macho. Em seguida, conecte cuidadosamente uma porta de entrada do cartucho do filtro montado com o conector luer-lock macho. Certifique-se de que todas as conexões estejam seguras.

Em seguida, pendure o saco plástico em dois pinos no painel de malha. Insira uma rolha de silicone na porta de entrada do coletor. Em seguida, ligue o aspirador.

Abra as válvulas T vermelhas para filtração. Execute o coletor até que o cartucho do filtro esteja seco. Em seguida, feche as válvulas T vermelhas.

Repita todo esse processo para filtrar a quantidade desejada de água. Depois que toda a água amostrada tiver sido filtrada, remova cuidadosamente o cartucho do filtro do saco plástico e do recipiente de vácuo. Tampe ambas as extremidades do cartucho com as tampas luer apropriadas.

Em seguida, usando uma caneta à prova de solventes, rotule o cartucho e a tampa luer de entrada. Armazene a 20 graus Celsius até que esteja pronto para realizar a extração de DNA. Para amostras maiores que quatro litros, prepare uma garrafa de livro de dez litros, conforme detalhado no protocolo de texto.

Adicione a amostra de água a ser filtrada. Em seguida, insira firmemente uma ponta de pipeta de dez mililitros na válvula do frasco do livro. Insira firmemente a porta de entrada do cartucho do filtro na ponta da pipeta.

Em seguida, insira uma rolha de silicone na porta de entrada do coletor. Ligue o aspirador. Em seguida, abra as válvulas T vermelhas para filtração.

Execute o coletor até que o cartucho do filtro esteja seco. Após a conclusão da filtração, feche as válvulas T vermelhas. Remova cuidadosamente o cartucho do saco plástico e do conector de vácuo.

Em seguida, tampe ambas as extremidades do cartucho com as tampas luer apropriadas. Use uma caneta à prova de solvente para rotular o cartucho e a tampa luer de entrada. Armazene a 20 graus Celsius até que esteja pronto para realizar a extração de DNA.

Pré-aqueça uma incubadora a 56 graus Celsius. Em seguida, corte a tampa articulada de um tubo de 2,0 mililitros e descarte a tampa. Remova a tampa luer de entrada do cartucho do filtro.

Em seguida, insira a porta de entrada no tubo de 2.0 mililitros. Usando um filme autovedante, sele firmemente a conexão entre o cartucho e o tubo de coleta. Em seguida, insira a unidade combinada em um adaptador de centrífuga para um tubo cônico de 15 mililitros.

Centrifugue o cartucho durante um minuto a 5000 vezes g para remover o líquido restante do filtro. Quando a centrifugação estiver concluída, remova o tubo de coleta do cartucho do filtro e descarte o tubo. Em seguida, recapitule a porta de entrada.

Em seguida, misture 20 microlitros de solução de proteína A-Case, 220 microlitros de solução salina tamponada com fosfato e 200 microlitros de tampão AL. Remova a tampa de entrada e adicione a mistura ao cartucho usando uma pipeta, inserindo a pipeta completamente na porta de entrada. Recapitule a porta de entrada. Em seguida, coloque o cartucho do filtro em um agitador rotativo.

Coloque o agitador rotativo na incubadora pré-aquecida e ajuste-o para 20 rpm por 20 minutos. Durante a incubação, rotule um novo tubo de 2,0 mililitros com uma caneta à prova de solvente. Em seguida, coloque-o em um tubo cônico de 50 mililitros.

Após a conclusão da incubação, remova a tampa de entrada. Em seguida, insira a porta de entrada no novo tubo de 2.0 mililitros. Tampe o tubo cônico com uma tampa de rosca.

Centrifugue durante um minuto a 5000 vezes g para recolher o ADN extraído. Em seguida, remova o cartucho no tubo de 2,0 mililitros usando uma pinça esterilizada. Tampe o tubo e purifique o DNA extraído conforme descrito no protocolo de texto.

Neste procedimento, quatro volumes diferentes de água do mar são filtrados no mesmo coletor usando dois filtros exclusivos, e o eDNA é posteriormente extraído. O cartucho do filtro detectou, em média, 50% mais espécies do que os filtros de fibra de vidro. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas se for executada corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como filtrar amostras de água com um cartucho de filtro e como extrair o eDNA sem ter que abrir a caixa para remover o filtro do eDNA metabarcoding de vários organismos aquáticos.