Name: Um método eficiente para a Síntese de Peptóides com Monómeros Mixed tipo de lisina / arginina-tipo e avaliação da sua actividade anti-leishmaniose (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Aprenda a sintetizar peptóides com funcionalidade catiônica mista usando monômeros tipo lisina e arginina. Avalie a atividade contra Leishmania mexicana, parasita causador da leishmaniose cutânea, e desenvolva novos agentes anti-infecciosos.

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Agradecemos ao Conselho de Engenharia e Ciências Físicas Research (EPSRC) para apoio financeiro (HLB). Agradecemos também Sridevi Maalika Ramanoudjame por sua assistência durante as filmagens deste procedimento.

Síntese 1. em fase sólida de Peptóides NOTA: Peptóides são sintetizados manualmente utilizando o procedimento submonï¿½ero de síntese em fase sólida peptóide. Este método permite alta eficiência de acoplamento e bons rendimentos do produto final. Síntese em fase sólida, também permite que os reagentes em excesso para ser removida facilmente no final de cada passo e o método foi modificado aqui para permitir (resíduos ou seja, do tipo arginina e do tipo lisina) diferentes funcionalizados monómeros catiónicos para ser incluído dentro da mesma sequência. 1,2 <ol><li> Síntese de um peptóide linear Atenção: Realizar avaliações de segurança antes de iniciar a síntese. Realizar todas as reações em um exaustor e usar equipamento de protecção individual adequado, conforme apropriado (ou seja, luvas de borracha nitrílica descartáveis, óculos de segurança e uma bata de laboratório). Tome cuidado especial ao utilizar os seguintes reagentes e solventes. Dimetilformamida (DMF) é um agente teratogénico e d suspeitaichloromethane (DCM) é um agente cancerígeno. N, diisopropilcarbodiimida N &#39;(DIC) e piperidina são perigosos para os olhos, pele, por inalação respiratório e pode causar sensibilização da pele. Hidrazina é um cancerígeno, fatal se for inalado e causa queimaduras graves na pele ou olhos. ácido bromoacético também é perigoso para a pele, olhos e trato respiratório e pode causar queimaduras por contacto. ácido trifluoroacético (TFA) é um líquido volátil e pode causar queimaduras graves por isso manuseie com cuidado. luvas pesados ​​são recomendados. <ol><li> Adicionar 0,12 g de resina de Rink amida protegida com Fmoc (0,1 mmol, carga típica 0,7 mmol / g) a um vaso reaccional de 20 ml de polipropileno tapados com duas fritas. Adicionar 5 ml de dimetilformamida (DMF) a inchar a resina e deixar o recipiente em repouso durante pelo menos 60 minutos à temperatura ambiente. Drenar o DMF, utilizando uma plataforma de vácuo de extracção em fase sólida. </li><li> Para desproteger o grupo Fmoc na resina aumentada de volume, adiciona-se 2 ml de solução de piperidina (20% em DMF v / v). Colocar o recipiente sobreuma plataforma de agitação à temperatura ambiente (450 rpm) e agitar durante 5 min. Remover a solução através da estação de vácuo. <ol><li> Repetir desprotecção Fmoc com 2 ml de solução de piperidina e agita-se durante 15 min à temperatura ambiente. Escorra a solução como antes. </li></ol></li><li> Lava-se a resina por adição de 2 ml de DMF e a mistura da resina durante 30 seg. Escorra o DMF e repita três vezes mais. </li><li> Para a acetilação, adicionar 1 ml de uma solução de ácido bromoacético (0,6 M em DMF) e 0,2 ml de N, solução de diisopropilcarbodiimida N &#39;(DIC, 50% em DMF v / v). Deixar vaso de reacção a agitar durante 20 min à temperatura ambiente. Drenar a solução e lava-se a resina com 2 ml de DMF três vezes. </li><li> Para o deslocamento, adicionar 1 ml de uma solução de amina (1,5 M em DMF). Agitar a resina durante 60 minutos à temperatura ambiente. Drenar a solução e lava-se a resina com 2 ml de DMF três vezes. <ol><li> Para adicionar um monômero do tipo arginina, siga o passo 1.7. Dependendo da sequência desejada peptóide, aminas diferentesserá adicionado. </li></ol></li><li> Repita os passos 1.1.4 e 1.1.5. </li><li> Para incluir um monómero funcionalizado de guanidina (isto é, N Arg), adicionar 1 ml de uma solução de diamina não protegida (1,5 M no seio de DMF) à resina e agita-se durante 60 min à temperatura ambiente. <ol><li> Drenar a solução e lava-se a resina com 2 ml de DMF três vezes. </li><li> Adicionar 2-acetyldimedone (0,2 g, 1 mmol em 0,5 mL de DMF, 10 equivalentes) para adicionar o grupo Dde para a amina primária livre e agitar por 60 min à temperatura ambiente. Drenar a solução e lava-se a resina com 2 ml de DMF três vezes. </li></ol></li><li> Continuar a síntese submonï¿½ero como em 1.1.4 a 1.1.7 até que a sequência desejada é feita. Adicionar 2 ml de DMF para se lavar a resina e repetir três vezes. </li><li> Para desproteger o grupo Dde em resina, adicionar solução de hidrazina 4 ml de 2% (em DMF v / v) e agita-se durante 3 minutos à temperatura ambiente. Escorra a solução e repita três vezes. </li><li> Drenar a solução e lava-se a resina com 2 ml de DMF três times. </li><li> Adicionar pirazole-1-carboxamidina (6 equivalentes por amina livre, ou seja, por monómeros N Arg, no volume mínimo de DMF) e N, N-diisopropiletilamina ou DIPEA (6 equivalentes por amina livre) e agitar à temperatura ambiente durante 60 min . </li><li> Drenar a solução e lava-se a resina com 2 ml de diclorometano três vezes. Deixar a resina a secar ao ar durante 10 min, em seguida, a resina pode ser armazenado até clivagem (secção 2). </li><li> Para interromper a síntese, lava-se a resina com 2 ml de DMF três vezes. Adicionar 2 ml de DMF, tapar o vaso de síntese e deixar à temperatura ambiente numa hotte. NOTA: A síntese pode ser pausado depois (podem ser formadas, exceto o segundo passo deslocamento como dicetopiperazinas) qualquer fase de deslocamento. </li></ol></li><li> A desprotecção da cadeia lateral e clivagem a partir da resina <ol><li> Realizar um cleave de teste para verificar o progresso da síntese (pureza e massa) em qualquer ponto durante a síntese após o displaetapas de cimento, adição ou remoção dos grupo protectores Dde ou depois da sequência final tenha sido feita. <ol><li> Transferir cerca de 10 pérolas de resina do recipiente de reacção para um novo cartucho de filtro de vidro sinterizado 8 ml de polipropileno. </li><li> Adicionar 1 ml de cocktail de clivagem de ácido trifluoroacético (contendo 95% de TFA, 2,5% de H2O, 2,5% de triisopropilsilano) e agitar durante 90 min à temperatura ambiente. </li><li> Filtra-se o cocktail de clivagem de TFA da resina utilizando o vaso de reacção de vidro sinterizado de 10 ml em frasco de fundo redondo. </li><li> Evapora-se o cocktail de clivagem utilizando um evaporador rotativo e redissolver o óleo resultante em 1 ml de acetonitrilo / água para a apresentação de LC-MS ou HPLC analítica. </li></ol></li><li> Para a clivagem final: no mesmo cartucho de frita de polipropileno de reacção utilizado para a síntese, adicionar 4 ml de cocktail de TFA a clivagem (95% de TFA, 2,5% de H2O, 2,5% de triisopropilsilano) e cobrir o recipiente. Agitar por 90 min à temperatura ambiente. </li><li> th filtroe TFA cocktail de clivagem a partir da resina utilizando o vaso de reacção de vidro sinterizado de 50 ml em frasco de fundo redondo. </li><li> Evapora-se o cocktail de clivagem utilizando um evaporador rotativo. Após o TFA foi removido, o produto deve ser obtido na forma de um óleo. Para facilitar a remoção de TFA a partir deste óleo em bruto, adiciona-se éter dietílico anidro e 2 ml da peptóide deve precipitar. <ol><li> De qualquer remover o éter dietílico através de uma pipeta e desfazer-se ou evapora-se utilizando um evaporador rotativo. Repita éter dietílico a precipitação três vezes. </li></ol></li><li> Dissolve-se o peptóide em bruto em 10 ml de solução de acetonitrilo / água acidificada (50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA em água v / v). Transferir para um recipiente pré-pesado, congelar a 20 ° C e liofilizar para um pó seco. </li></ol></li></ol> 2. Purificação e Caracterização NOTA: A síntese peptóide pode ser monitorizado e o último peptóide avaliada através de fase reversa HPLC analítica utilizando uma coluna C18 e Elespectrometria ectrospray-cromatograf ia líquida de massa (LC-MS). Todos os solventes de HPLC de solventes para LC-MS deve ser preparada. <ol><li> CLAP analítica <ol><li> Pesar 1 mg de peptóide num pequeno frasco de vidro. Adicionar o volume mínimo de acetonitrilo para dissolver e dilua para 1 ml com água. Certifique-se de que o peptóide se ter dissolvido completamente. </li><li> Injectam-se 10 uL para HPLC analítica (gradiente sugeriu 0 - 100% de solvente B ao longo de 30 minutos, onde o solvente A = 95% água, 5% acetonitrilo, 0,05% de TFA e o solvente B = 95% acetonitrilo, 5% de água, 0,03% de TFA) , de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Visualizar espectro de UV a 220 nm. </li></ol></li><li> ESI CL-EM <ol><li> Adicione uma solução peptóide mg / ml, tal como no passo 2.1.1. </li><li> Injectar 1 ul de electropulverização LC-MS para determinar se o peso molecular do peptóide alvo está presente, utilizando as instruções do fabricante. </li><li> Verifique a massa alvo da sequência peptï¿½de usando um Peptcalculadora oid, conforme instruções da calculadora. 26 Este utilitário web também permite a atribuição de quaisquer exclusão / produtos de adição visto no espectro de massa 26. </li></ol></li><li> HPLC de fase inversa preparativa <ol><li> Dissolver peptï¿½des bruto em 2 ml de água acidificada / acetonitrilo (95% água, 5% de MeCN, 0,1% de TFA) e purifica-se por RP-HPLC preparativa utilizando o protocolo do fabricante. Determinar o gradiente por o tempo de eluição obtido a partir de HPLC analítica e a quantidade injectada irá depender das dimensões da coluna. </li><li> Visualizar usando um detector ajustado a 220 nm. </li><li> Recolha fracções em tubos de 15 ml de centrífuga, congelar a 20 ° C e liofilizar. </li><li> Re-analisar fracções utilizando LC-MS e HPLC analítico de acordo com o protocolo do fabricante. Reunir em fracções purificadas. </li></ol></li></ol> 3. Teste Biológica contra a Leishmania mexicana Parasitas Caução:. As avaliações de segurança deve ser realizada antes de iniciar a síntese de Leishmania mexicana é classificada um perigo grupo 2 patógeno no Reino Unido e medidas de controlo adequadas devem estar no local antes de iniciar o teste. Todo o trabalho deve ser realizado numa câmara de segurança microbiológica classe 2 e equipamento de protecção individual adequado usado como adequadas (ou seja, luvas de borracha nitrílica, óculos de segurança e uma bata de laboratório). <ol><li> Subcultura de parasitas <ol><li> Descongelar 1 ml de -150 ° C estoque congelada Leishmania mexicana M379 colocando frasco num banho de água a 37 ° C durante 30 seg. </li><li> Transferir a solução de reserva a 10 ml de meio de insecto de Schneider (a pH 7,0 suplementado com 15% de soro bovino fetal inactivado por calor e 1% de penicilina / estreptomicina) num balão de cultura de 25 centímetros de células 3 com uma tampa não-ventilada. </li><li> Incubar a 26 ° C durante 72 h. </li><li> Examine parasitas sob o microscópio (aumento de 400X) para verificar a condição. ºey deve ser promastigotas estágio de insetos, as formas procíclica em fase log com muitas células em divisão. </li><li> Manter promastigotas procíclicos por parasitas sub-cultura a uma concentração de 5 x 10 5 parasitas / ml a cada três dias. Contagem de células utilizando um hemocitómetro de Neubauer melhorada. </li></ol></li><li> Transformação de L. mexicana estágio inseto em forma amastigota de mamíferos estágio axênico 27 <ol><li> Dia 0: Preparar 10 ml de cultura de parasitas de fase log em 5 x 10 5 parasitas / ml em meio de insecto de Schneider (a pH 7,0 suplementado com 15% de calor-inactivado de soro fetal bovino e 1% de penicilina / estreptomicina) num três células 25 centímetros frasco de cultura com uma tampa não ventilada. </li><li> Incubar a 26 ° C durante 48 h. </li><li> Dia 3: Transferir 10 ml de cultura para um tubo de centrífuga de 50 ml e centrifugar a 447 xg durante 5 min. </li><li> Deitar fora meio antigo e adicionar 10 ml de meio Insect da Schneider (pH 5,5 suplementado com 20% hcomer inactivado de soro fetal bovino e 1% de penicilina / estreptomicina). Suavemente ressuspender o sedimento de parasitas no novo meio utilizando uma pipeta. </li><li> Contar o número de parasitas, utilizando uma melhoria hemocitômetro Neubauer. Dilui-se a uma concentração de 5 x 10 5 parasitas / ml, com pH 5,5 e meio de transferência para um frasco de cultura de 25 centímetros de células 3. </li><li> Incubar a 26 ° C durante aproximadamente 6 dias. </li><li> Dia 9: Examine parasitas sob um microscópio (400X). Eles devem estar no não-replicante, fase de promastigote infeccioso metacíclica. </li><li> Contar o número de parasitas, utilizando uma melhoria hemocitômetro Neubauer. Dilui-se a uma concentração de 5 x 10 5 parasitas / ml com meio de pH 5,5. </li><li> Retirar 10 ml de cultura de células e transferir para um frasco de cultura de células. Incubar a 32 ° C durante 5 dias. </li><li> Dia 14: Verifique aparecimento de parasitas sob o microscópio (400X). Eles devem estar na fase de amastigote patogénico, sem o carácter flageloistic de promastigotas, e pronto para o ensaio. </li></ol></li><li> Ensaio de citotoxicidade em L. mexicana amastigotas axênicas. NOTA: O teste biológico dos peptï¿½des utiliza ensaios de alto rendimento realizados em placas de 96 poços. Este protocolo descreve o ensaio de L. mexicana amastigotas axênicas, mas ensaios idênticos também podem ser realizadas sobre os parasitas fase promastigotas em meio adequado. Os compostos são incubados com parasitas em concentrações a partir de 3 - 100 uM durante 60 min e, em seguida, incubadas durante 24 horas na sequência de uma diluição de 10 vezes. Os resultados são obtidos através da medição da fluorescência dos poços após a incubação com a solução de viabilidade celular baseado em Resazurina (por exemplo, alamarBlue). <ol><li> Preparar soluções de reserva dos compostos. Pesar 1 mg do produto peptóide final purificado utilizando uma balança analítica. Adicionar o volume apropriado de sulfóxido de dimetilo de grau de biologia molecular (DMSO) a uma concentração de 5 mM. Faça 6 mL alíquotas econgelar a -20 ° C. </li><li> Preparar soluções de compostos em placas de 96 poços (de uma placa de layout recomendada pode ser visto na secção de resultados, a Figura 6), em triplicado, 100-3 uM. Adicionar 2 ml de solução de estoque de 5 mM de cada composto da linha superior (isto é, A). Adicionar 48 ul de meio de insecto de Schneider fresco (a pH 5,5 e soro de bovino fetal a 20% (FBS), 1% de penicilina / estreptomicina (P / S)) a linha superior, utilizando uma pipeta multi-canal. Adicionar 25 ul meio de insecto de Schneider para todas as outras linhas (B - F). <ol><li> Realizar uma diluição em série por pipetagem 25 solução ul a partir da linha superior. Adicione a linha abaixo e misture. Efectuar diluições até a última fila, onde a última solução de 25 ul deve ser descartado. </li><li> Use anfotericina B (5 mM de stocks) como um controlo positivo e DMSO (solução 2%) como um controlo negativo em triplicado. </li></ol></li><li> Preparar a solução parasita: cultura da transferência para um tubo de centrífuga de 50 ml e centrifugar a447 xg durante 5 min. Decantar meio antigo e adicionam-se 10 ml de meio de Schneider Insecto (a pH 5,5 e 20% de FBS, 1% de P / S). </li><li> Suavemente dissolver o sedimento de parasitas no novo meio utilizando uma pipeta e contagem usando um hemocitómetro de Neubauer melhorada. Dilui-se a cultura a 8 x 10 6 parasitas / ml. </li><li> Adicionar 25 ul L. Mexicana cultura a cada poço. Incubar as placas durante 60 min a 32 ° C. </li><li> Remova a placa do incubador e remover a solução de 40 ul de cada poço. </li><li> Adicionar 90 ul de meio fresco e incuba-se durante 24 h a 32 ° C. </li><li> Adicionar 10 ul de solução de viabilidade celular baseado em Resazurina a cada poço. Incuba-se durante 4 h a 32 ° C. </li><li> Medir a fluorescência utilizando um leitor de placas (ex λ = 540 nm, em = λ 600 nm), de acordo com as instruções do fabricante. Analisar os dados através da remoção de fundo médio (a partir de meio apenas poços) e comparando a fluorescência dos poços após a normalização em relação a tele DMSO controlos. </li></ol></li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

<html> Peptóides estão cada vez mais a ser estudados na biologia química e campos de química medicinal em aplicações tais como novas terapias 3-5, agentes de entrega de células 18,20 e ferramentas de diagnóstico. 29 Tipicamente, estas sequências são catiónico para proporcionar um grau de selectividade para o agente patogénico sobre células de mamíferos, a capacidade de penetrar através das membranas celulares e também ajudar a solubilidade em sistemas aquosos. Existem inúmeros exemplos de peptoids catiônicos que contêm resíduos exclusivamente lisina- ou arginina-mimética na literatura. No entanto, até à data, a síntese de peptóides que contêm ambos estes resíduos catiónicos na mesma sequência tem sido dificultada pela falta de um processo de síntese adequado. O protocolo aqui descrito permite peptï¿½des catiónicos mistos a ser sintetizado de uma maneira eficiente e é altamente desejável, uma vez que oferece uma via para modular as propriedades biológicas e químicas do peptï¿½des anfipáticos. nt &quot;&gt; O nosso método utiliza uma adaptação à síntese peptóide submonï¿½ero comumente utilizados e permite a adição de ambos os monómeros de lisina- e do tipo arginina dentro da mesma sequência. Ela usa acoplamentos temperatura ambiente e estabeleceu protector da química do grupo assim prevê-se que este método irá ser útil para a maioria dos grupos de pesquisa. para adicionar protecção ortogonal para o resíduo de tipo arginina, uma diamina não protegida é adicionada sob condições padrão de deslocamento e, em seguida, protegida num acoplamento de 60 minutos com Dde-OH. uma variedade de diaminas podem ser utilizada que permite que as cadeias laterais de dois carbonos a 6 carbonos de comprimento ser instalado, ou seja, 1,2-diaminoetano, a 1,6-diamino-hexano respectivamente. a protecção Dde-OH dissolve bem em DMF e é um grupo de protecção muito eficaz e selectivo para aminas primárias. o grupo de protecção Dde-aminas secundárias folhas inalteradas, por exemplo, o terminal N desprotegido da cadeia peptóide. 30 Uma limitação é que todo o syntese foi realizada manualmente; No entanto, antecipa-se que as condições de acoplamento desenvolvido tornar o método favorável para uso com o péptido / sintetizadores automatizados peptï¿½des. A resina na desprotecção dos grupos Dde é realizado utilizando-se uma solução de hidrazina a 2% em DMF para deixar aminas livres que podem ser guanidinylated na resina utilizando pirazole-1-carboxamidina. Seis equivalentes do pirazole-1-carboxamidina e seis equivalentes de DIPEA são utilizados por amina livre na resina (isto é, seis equivalentes de cada tipo de monómero N Arg a ser instalada). Mais uma vez, esta reacção também é eficiente e o reagente de pirazole-1-carboxamidina tem boa solubilidade em DMF. A conclusão da reacção é normalmente visto através de LC-MS depois de 60 minutos à temperatura ambiente. Devido à versatilidade do método do submonï¿½ero, uma ampla variedade de aminas primárias pode ser utilizado no passo de deslocamento de modo que as condições podem necessitar de ser optimizado para aumentar a efi acoplamentoeficiência e rendimentos globais de produtos ou pureza. 31 Para as sequências discutidas acima, há condições especiais eram necessárias para acoplamentos bem sucedidos. No entanto, tempos mais longos de deslocamento ou concentrações mais elevadas de amina pode ser utilizado para deslocamentos problemáticos (isto é, para aminas estericamente volumosos nucleofílicos ou mal). Algumas aminas podem não ser completamente solúveis em DMF, caso em que é recomendado para os dissolver em N-metil-2-pirrolidona (NMP), ou outros solventes adequados para as reacções em fase sólida, em vez de em um método para a síntese anterior abrangente submonï¿½ero de peptóides. 32 para incorporar monómeros que contêm heteroátomos não protegidos nas cadeias laterais, acetilação utilizando ácido cloroacético tem sido mostrado para ser eficaz por outros grupos. 33 Adicionalmente, outras resinas podem ser utilizadas com este método para se obter peptï¿½des com diferentes funcionalização do terminal C. Wang resinas e resinas de cloreto de 2-clorotritilo são rotineiramente utilizados nasubmonï¿½ero síntese de peptóides. Por exemplo, este método tem sido usado com sucesso com resina de cloreto de 2-clorotritilo no nosso grupo. 2 diferentes suportes sólidos irá exigir um procedimento de carga diferente de Rink amida discutidos aqui (dependente da resina específica utilizada) de modo que este deve ser verificado com a literatura antes da síntese. Semelhante a síntese de péptidos, as condições para a clivagem final da resina peptóide fora também pode ser optimizado para a sequência específica. Neste protocolo, um cocktail de clivagem TFA foi utilizado (com triisopropilsilano e água como catadores). Os peptoids aqui apresentados continha apenas protecção Boc que é um grupo lábil razoavelmente ácido. Para assegurar a desprotecção completa das sequências com uma maior proporção de resíduos de ácido protegido ou menos grupos de protecção lábil, os tempos de clivagem mais longos podem ser necessários (isto é, os tempos de clivagem em excesso de 2 horas são recomendados para sequências que contêm Pbf ou terc-buéster Tyl grupos protegidos). sequestrantes alternativos também podem ser usados ​​para as cadeias laterais especializadas (por exemplo, de etanoditiol ou de 2-mercaptoetanol são muitas vezes utilizados em péptidos que têm cadeias laterais contendo enxofre tais como a cisteína ou metionina). O ensaio biológico é apresentado um ensaio de citotoxicidade padrão que pode ser alterado para se adequar a diferentes linhas celulares. É importante notar que cada placa de 96 poços deverão conter controlos suficientes para permitir que a confiança nos resultados obtidos. Neste caso, a anfotericina B é utilizado como um controlo positivo, uma vez que é uma droga conhecida utilizada para tratar a doença e DMSO é usado como um controlo negativo como este é o solvente usado para fazer reservas de composto para o ensaio. Se outras linhas de células estão a ser utilizados, os controlos adequados, alternativos deve ser obtida e validada antes da utilização. L. Mexicana é incubada com o peptóide a concentrações entre 100 e 2 ^ M, durante uma hora, e, em seguida, a solução parasita / peptóide é diluída pelaum factor de dez para incubação durante a noite (isto é, os poços inicialmente com 100 uM da peptóide são diluídos para 10 | iM). O reagente de viabilidade de células são adicionados a cada poço (10% do volume total do bem) no final do ensaio. Uma mudança de cor visível é visto entre poços com parasitas viáveis ​​(rosa), os poços de controlo sem parasitas viáveis ​​(azul) e um espectro entre com os números intermédios de parasitas viáveis. A fluorescência é proporcional ao número de células vivas e corresponde à actividade metabólica das células; resazurina corante (não fluorescente) é convertido para o fluorescente resorufina por meio de reacções de redução nas células metabolicamente activas. 34 Neste ensaio, o tempo de incubação com o reagente de viabilidade celular foi optimizado para L. mexicana. Os tempos de incubação com o reagente de viabilidade variará para placas semeadas em concentrações de células diferentes ou com diferentes linhas de células (por exemplo, este método também pode ser usadocom células de mamíferos). Dependendo do leitor de placas exacta utilizada, considerações devem ser feitas antes das medições de fluorescência são tomadas. Quaisquer bolhas de ar em cavidades deve ser removida para garantir leituras precisas podem ser tomadas. Alguns leitores de placas de ler a partir do fundo de placas, no qual caso de fundo plano de 96 placas de poços devem ser usados. Outras máquinas podem ler a partir do topo da placa, de modo que a tampa da placa deve ser removida antes da medição. Finalmente, no futuro, este protocolo pode ser compatível com sintetizadores automatizados que são capazes de fazer muitas sequências em paralelo. Além disso, a síntese de peptóides cíclicos também é possível, utilizando este método. Este protocolo deve fornecer aos pesquisadores um procedimento sintético prático que pode ser usado para acessar novos scaffolds peptï¿½des com ambos os monómeros lisina- e do tipo arginina, que podem ser de uso em muitas aplicações, incluindo materiais ou campos medicinais.

Peptóides (ou poli- N-substituído glycines) são uma classe de miméticos de péptidos-que oferecem propriedades semelhantes a péptidos e, como tal, estão cada vez mais a ser investigados para aplicações medicinais e materiais. Em péptidos, a cadeia lateral de cada aminoácido está ligado ao α-carbono da espinha dorsal de amida; em peptï¿½des as cadeias laterais são deslocados para o átomo de azoto do esqueleto. Fundamentalmente, isto dá peptï¿½des maior resistência à proteólise. Peptóides são normalmente sintetizados utilizando o método submonï¿½ero iniciada por Zuckermann et al., Onde monómeros peptï¿½des pode ser construído por haloacetylation sequencial de uma funcionalidade amina ligado a um suporte sólido e subsequente deslocamento do halogéneo com uma amina primária. 1 O nosso grupo desenvolveu recentemente uma adaptação deste método para permitir submonï¿½ero lisina- e do tipo arginina resíduos peptï¿½des para ser incluído dentro da mesma sequência para o f peptóideirst tempo. 2 Esta abordagem manual em fase sólida para a síntese de peptï¿½des utiliza reagentes comercialmente disponíveis e equipamentos de laboratório comum, tornando-o acessível para a maioria dos laboratórios. Peptóides ter sido demonstrado ter actividade promissora contra uma vasta gama de bactérias Gram-negativas, as espécies bacterianas e fúngicas Gram-positivas que são comparáveis aos diversos péptidos antimicrobianos conhecidos. 09/03 Em nosso trabalho, peptoids têm sido usados como compostos anti-infecciosos inovadoras para o tratamento da leishmaniose doença tropical negligenciada. 5,10 leishmaniose é endêmica em mais de 80 países em todo o mundo e estima-se que mais de 12 milhões de pessoas estão infectadas em todo o mundo. 11 A doença é causada por parasitas protozoários que são transmitidos pela picada de um mosquito pólvora. espécie de Leishmania pode causar leishmaniose cutânea, uma condição que conduz à formação de cicatrizes e a lesão das membranas mucosas, ou a leis visceral com risco de vidahmaniasis, o que provoca danos em órgãos fatal. Nenhuma vacina está actualmente disponível para esta doença e os tratamentos actuais dependem de um pequeno número de fármacos que têm efeitos secundários graves. Além disso, a resistência a fármacos existentes é um problema emergente e grave assim novos tratamentos são desesperadamente necessário para tratar eficazmente a leishmaniose no futuro 12-16. Nestas aplicações antimicrobianas, peptóides são frequentemente concebidos para serem anfipático com uma mistura de monómeros hidrófobos e catiónico. Isto pode dar 3,4 peptï¿½des um grau de selectividade em relação a células bacterianas, reduzir a toxicidade para as células de mamíferos, e para melhorar a sua actividade como transportadores moleculares . 17-20 a maioria dos peptï¿½des anti-infecciosos na literatura contêm cadeias laterais catiónicas que são exclusivamente constituídas por qualquer amino funcionalizado monómeros do tipo lisina ou resíduos de tipo arginina. quimeras péptido-peptï¿½des, onde as cadeias catiónicos são compostos de um amino ácidos lisina ou arginina, também foram sintetizados para analisar o efeito de grupos catiónicos sobre a actividade e a toxicidade 21-25. peptï¿½des poli-lisina podem ser facilmente sintetizados utilizando aminas protegidas com Boc comercialmente disponíveis. Os peptóides poli-arginina relatado pode ser feita utilizando um método que utiliza pirazole-1-carboxamidina como um agente guanidinylation. 18 No entanto, isso só pode ser realizada após a peptóide foi clivado a partir da resina e a protecção Boc na cadeia lateral removida, assim cada resíduo de tipo lisina dentro da sequência é transformada em um resíduo de arginina. Num esforço para aperfeiçoar as propriedades químicas e biológicas dos compostos, foi desenvolvido um método que permite a dupla funcionalidade catiónica (por exemplo, N e N Lys Arg) para ser incluído em qualquer dada sequência peptóide pela primeira vez 2. Aqui, nós descrevemos a síntese, purificação e caracterização de TWo romance peptoids que contêm ambos os resíduos lisina- e do tipo arginina na mesma sequência. O método utiliza ortogonal protecção N-Boc e N -Dde em resina com pirazole-1-carboxamidina como um reagente guanidinylation. A avaliação biológica destas peptï¿½des também é descrito em ensaios de citotoxicidade contra Leishmania mexicana, o agente causador da leishmaniose cutânea. Isto fornece um método prático para acessar peptoids com a funcionalidade catiônica dupla e para avaliar sua atividade biológica. Espera-se que este método vai ajudar a síntese de peptóides anfipáticos pela comunidade peptóide no futuro.

<table><tbody><tr><td>Cartuchos de extração em fase sólida de polipropileno com duas fritas</td><td>Crawford Scientific</td><td>12131017 e 12131015</td><td>cartuchos de 20 ml e 6 ml usados nesta preparação</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Tokyo Chemical Industry (Europe)</td><td>T0431-100g</td><td>>98%; CUIDADO: pode causar queimaduras graves e irritação respiratória<</td></tr><tr><td>em>N,N'-diisopropilcarbodiimida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>38370-100ML</td>><td>98%; CUIDADO: perigoso para os olhos, pele e por inalação respiratória, também pode causar sensibilização</td></tr><tr><td>Dimetilformamida</td><td>Fischer Scientific</td><td>10346180</td><td>grau HPLC; CUIDADO: suspeita de teratogênio</td></tr><tr><td>Acetonitrila Fischer</td><td>Scientific</td><td>10407440</td><td>grau HPLC</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Fischer Scientific</td><td>10354263</td><td>99,8%; CUIDADO: suspeita cancerígena</td></tr><tr><td>de ácido bromacético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17000-100G</td><td>>99%; CUIDADO: causa queimaduras e é perigoso para a pele, olhos e trato respiratório</td></tr> <tr><td>(S) - (-) -alfa metilbenzilamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>115568-100G</td><td>98%; CUIDADO: nocivo se ingerido, tóxico em contato com a pele, causa queimaduras graves na pele e danos aos olhos, usado para sintetizar o monômero Nspe</td></tr> <tr><td> N-Boc 1,4-diaminobutano</td><td>Tokyo Chemical Industry (Europa)</td> <td>A1373-25g</td> <td>> 98%; CUIDADO: causa queimaduras graves na pele e danos aos olhos, usado para sintetizar o monômero NLys</td></tr> <tr><td> N-Boc 1,2-diaminoetano</td><td>Tokyo Chemical Industry (Europa)</td> <td>A1371-25g</td> <td>> 97%; CUIDADO: causa queimaduras graves na pele e danos aos olhos, usado para sintetizar o monômero Nae</td></tr><tr><td>1,2-diaminobutano</td><td>Sigma</td><td>Aldrich D13208-100G</td><td>99%; CUIDADO: líquido e vapor inflamáveis, nocivos se ingeridos ou inalados, tóxicos em contato com a pele, causam queimaduras graves na pele e danos aos olhos, usados na síntese do monômero NhArg</td></tr><tr><td>1,4-diaminoetano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03550-250ML</td>><td>99,5%; CUIDADO: líquido e vapor inflamáveis, nocivos se ingeridos ou inalados, tóxicos em contato com a pele, causam queimaduras graves na pele e danos aos olhos, usados na síntese do monômero NnArg &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>1H-pirazol-1-carboxamidina HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>402516-10G</td><td>como sal de HCl; CUIDADO: prejudicial se ingerido e pode causar uma reação alérgica na pele, causa sérios danos aos olhos</td></tr><tr><td>Hidrazina monohidratada</td><td>Sigma Aldrich</td><td>207942-5G</td><td>grau reagente; CUIDADO: suspeita de ser cancerígena, fatal se inalada e causar queimaduras graves na pele e nos olhos</td></tr><tr><td>2-acetil dimedona</td><td>Novabiochem</td><td>8510150005</td><td>Dde-OH</td></tr><tr><td>Rink Amide resina</td><td>Novabiochem</td><td>8551190005</td><td>100-200 mesh, alta carga</td></tr><tr><td>Piperidina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>411027-1L</td><td>>99,5%, uma substância controlada, portanto, a permissão adequada deve ser obtida antes da compra; CUIDADO: líquido e vapor altamente inflamáveis, nocivos se ingeridos e tóxicos em contato com a pele ou se inalados, causam queimaduras graves na pele e danos aos olhos, prejudiciais aos organismos aquáticos com efeitos duradouros</td></tr><tr><td>Triisopropilsilano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>233781-50G</td><td>98%; CUIDADO: líquido e vapor inflamáveis, causa irritação na pele e irritação ocular séria</td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>ThermoFischer&nbsp;</td><td>DAL1025</td><td>Não classificado como perigoso</td></tr><tr><td>Schneider's Insect Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9895-1L</td><td>Em pó, o meio deve ser feito antes da utilização seguindo as instruções do fabricante; deixar aquecer à temperatura ambiente antes de ser utilizado em ensaios biológicos</td></tr><tr><td>Placas de 96 poços</td><td>VWR</td><td>734-1793</td><td>Fundo plano (para permitir a medição da fluorescência a partir do fundo), tratado com cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Reservatórios de solvente</td><td>VWR</td><td>613-1182</td><td>Usado com pipeta multicanal</td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>Eppendorf</td><td>3122000043</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta</td><td>Starlab Group</td><td>S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810</td><td>O volume da ponteira depende da pipeta usada. 10&nbsp; &micro; l, 10 - 200&nbsp; &micro; l e 1.000&nbsp; &micro; l recomendado para ensaios</td></tr><tr><td>25 cm3 frascos de cultura de células</td><td>VWR</td><td>734-2312</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 ml</td><td>VWR</td><td>525-0791</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (grau de biologia molecular)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td>Não classificado como perigoso</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFischer&nbsp;</td><td>10082139-100mL</td><td>Gibco</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>ThermoFischer&nbsp;</td><td>15140148-20mL</td><td>Abreviatura: P / S</td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46006-100mg</td><td>Anfotericina B trihidratada, padrão analítico VetranalTM</td></tr></tbody></table>

um método eficiente para a síntese de peptóides com monómeros mixed tipo de lisina / arginina-tipo e avaliação da sua actividade anti-leishmaniose

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

Este protocolo descreve a síntese manual em fase sólida de peptóides lineares que contêm dois monômeros catiônicos funcionalizados de forma diferente. Neste procedimento, os monômeros peptóides de 'lisina' funcionalizados com amino e guanido podem ser incluídos na mesma sequência peptóide. Este procedimento utiliza proteção em resina (N-(1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)etil) ou Dde, condições ortogonais à proteção Boc dos monômeros de lisina. A desproteção subsequente permite que uma reação eficiente de guanidinilação na resina forme os resíduos de arginina. O procedimento é compatível com o método de síntese de peptóides submonômeros comumente usado, permitindo que peptóides simples sejam feitos usando equipamentos de laboratório comuns e reagentes disponíveis comercialmente. A síntese, purificação e caracterização representativas de dois peptóides mistos são descritas. A avaliação desses compostos como potenciais anti-infecciosos em ensaios de triagem contra Leishmania mexicana também é descrita. O protozoário parasita L. mexicana é um agente causador da leishmaniose tegumentar, uma doença tropical negligenciada que afeta até 12 milhões de pessoas em todo o mundo.

Como um resultado representativo, a síntese e a caracterização de duas 12 peptï¿½des resíduo contendo dois monómeros do tipo de lisina e arginina do tipo de dois monómeros de cada um serão descritas. Os resultados de ensaio de citotoxicidade subsequentes também são mostrados. Dois peptóides [(N Narg N SPE N SPE) (N AE N SPE N SPE)] 2 (a) e [(hArg N SPE N SPE N) (N Lys N SPE N SPE)] 2 (b) foram sintetizados usando 120 mg de resina de Rink amida cada (carga = 0,79 mmol / g). Todos os passos de acetilação e de deslocamento foram realizados como descrito acima, com todos os reagentes adquiridos comercialmente. Para estes resíduos, as seguintes aminas foram usadas na fase de deslocamento: N SPE (S) - (-) - α-metilbenzilamina, N AE N - (terc-butoxicarbonil) -1,2-diaminoethane, N Lys N - (terc-butoxicarbonil) -1,4-diaminobutano. Para os resíduos derivado de arginina, as seguintes diaminas não protegidos foram acoplados: N hArg 1,4-diaminobutano ou N Narg 1,2-diaminoetano, seguido de protecção sobre resina com 2-acetyldimedone (Dde-OH). Depois de toda a sequência ter sido sintetizado, hidrazina desprotecção do Dde produz aminas livres nos guanidinylate. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig1.jpg" /> Figura 1. peptóide estruturas (a) [(N Narg N N SPE SPE) (AE N N N SPE SPE)] 2 e (b) [(N hArg N N SPE SPE) (N <stro<html> ng&gt; Lys N spe N spe)] 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig2.jpg" /> Figura 2. O método utilizado para sintetizar peptï¿½des arginina / lisina mistos. I. etapa deslocamento padrão no método submonï¿½ero com diamina; II. A adição de DDE-oh, 90 minutos para proteger amina livre; III. Mais adições para estender a cadeia peptóide usando o método submonï¿½ero; IV. A desprotecção de Dde utilizando 2% de hidrazina em DMF; V. Guanidinylation de amina livre na resina com pirazole-1-carboxamidina e DIPEA em DMF; vi. clivagem ácida da resina e desprotecção de grupos Boc.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. A seguir à clivagem a partir da resina e liof ilização, os produtos em bruto foram obtidos na forma de pós brancos: (a) 154 mg, (b) 163 mg. Os produtos foram purificados por meio de RP-HPLC, tal como descrito com um máximo de 50 mg injecções usando uma bomba de cromatografia líquida, com um detector de UV-VIS (λ = 250 nm) numa coluna analítica, 250 mm x 10 mm, 5 mm; caudal = 2 ml / min. As fracções correspondentes à massa alvo foram combinadas e obtido na forma de pós brancos: (a) 54 mg (b) 65 mg, rendimento final de aproximadamente 30% para as fracções&gt; 90% puros. As identidades composto final, depois da purificação foram confirmados por LC-MS (ver Figura 3), utilizando um espectrómetro de massa de quadrupolo triplo equipado com um UPLC e um detector de arranjo de fotodiodos. espectrometria de massa exata foi realizada usando o mesmo espectrómetro em t<html> ele [M + 2H] 2+. A seguir, calculado e massas observadas foram encontrados em estreita concordância (Figura 4): (a) calculado = 896,0026 amu, observado = 896,0038 amu; (B) calculado = 952,0691 amu, observado = 952,0730 amu. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig3.jpg" /> Figura 3. LC-MS para peptï¿½des purificadas. (A) m / z = 1792 e (b) m / z = 1903. Onde o topo é TIC, meio espectro de LC-MS, cromatograma UV inferior a 220 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig4.jpg" /> Figura 4. Dados de espectrometria de massa precisas para peptóides (a) e (b).&quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. A pureza do produto foi avaliada utilizando um RP-HPLC (Bomba LC com um detector de UV-vis numa coluna analítica, 4,6 mm x 100 mm, 3,5 uM; taxa de fluxo = 1 mL / min) analítica, e visualizados a 220 nm, a absorvância amida do esqueleto. a Figura 5a e 5b mostra que os compostos são homogéneas. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig5.jpg" /> Figura 5. HPLC analítica para os peptï¿½des purificados (a) e (b). Existe um gradiente de 0-100% de B ao longo de 30 minutos, forno de coluna a 40 ° C (A = 95% de H2O, 5% de MeCN, 0,05 % de TFA;. B = 95% de MeCN, 5% de H 2 O, 0,03% de TFA) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig5large.jpg" target="_blank">Por favor cl</a>ick aqui para ver uma versão maior desta figura. Os peptóides purificados (A) e (B) foram testadas em ensaios de citotoxicidade contra L. mexicana amastigotas axênicas. Reservas congeladas de L. Mexicana foram descongelados e transformado para o estádio de amastigote pronto para o ensaio. 72 horas após o descongelamento, os parasitas deve ser promastigotas estágio de insetos em sua forma pró-cíclica, em fase log com muitas células em divisão. Nesta fase, o parasita pode ser transformado no estádio de amastigote usando a mudança de pH e temperatura descrito. 27 No dia 9 da transformação, os parasitas se na fase de promastigote infeccioso metacíclica não replicantes. Finalmente, no dia 14, os parasitas deve estar na fase de amastigote patogénico parasitas onde falta a característica dos flagelos promastigotas 28. Soluções reserva 5 mM dos compostos foram feitas em DMSO de grau de cultura de células e testado em triplicado sobreum mínimo de duas ocasiões, para assegurar um conjunto de dados robusto foi recolhido. Um plano de placa de 96 poços representativo é mostrado na Figura 6. No final do ensaio, o reagente de viabilidade celular foi adicionado a cada poço e a fluorescência foi medida como descrito para calcular a viabilidade dos parasitas em cada concentração ensaiada (ver Figura 7 ). Os valores de ED50 foram calculados como peptóide (a)&gt; 100 uM e peptóide (b) 37 uM, respectivamente. As barras de erro plotados, mostram a variação entre os poços como um desvio padrão e pode ser visto que estes são razoáveis ​​para a maioria das barras. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig6.jpg" /> Figura 6. 96 representativas plano de placa bem para um ensaio de citotoxicidade em 2 peptï¿½des soluções (incluindo os controlos positivos e negativos). Med + = médio (Insecto meio de Schneider, pH 5,5, 20% de FBS, 1% de P / S). L. mex. =8 x 10 6 / ml cultura parasita no med +. AmphoB = 5 mM em DMSO. solução de peptï¿½de = 5 mM em DMSO. Poços vazios devem conter água estéril. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig7.jpg" /> Figura 7. Resultados do ensaio de citotoxicidade contra L. mexicana axénica parasitas amastigotas usando peptóide (a) e (b). Pode ser visto que o peptóide (b) é mais eficaz do que peptóide (a) a redução da percentagem de parasitas viáveis, com ambos os compostos tendo um efeito dependente da dose. As barras de erro plotados mostram a variação entre os poços como um desvio padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Um protocolo para sintetizar peptóides com funcionalidade catiônica mista na mesma sequência é apresentado (monômeros do tipo lisina e arginina). Testes subsequentes desses compostos contra Leishmania mexicana, os protozoários parasitas causadores da leishmaniose cutânea, também são descritos.

Um método eficiente para a Síntese de Peptóides com Monómeros Mixed tipo de lisina / arginina-tipo e avaliação da sua actividade anti-leishmaniose

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

O objetivo geral deste procedimento é introduzir monômeros dos tipos lisina e arginina dentro da mesma sequência de peptoides e avaliar a atividade desses compostos contra Leishmania mexicana, os parasitas causadores da leishmaniose cutânea, uma doença tropical negligenciada. Há uma necessidade urgente de novos terapêuticos para a leishmaniose cutânea, e este procedimento pode ajudar a identificar e desenvolver peptoides como uma nova classe de potenciais agentes anti-infecciosos para essa doença tropical negligenciada. A principal vantagem deste protocolo é que é possível sintetizar peptoides que contenham funcionalidade catiônica mista.Isso é altamente desejável, pois pode ajudar a modular as atividades biológicas das sequências. Embora este teste seja realizado contra a forma mamífera do parasita, ele também pode ser usado contra a fase insetoide de Leishmania mexicana ou aplicado a linhagens celulares de mamíferos. A demonstração visual deste método é realmente útil porque mostra a natureza sequencial da síntese e também a cultura do parasita em vários pontos do ciclo de vida de Leishmania mexicana.Para iniciar este procedimento, prepare as soluções em dimetilformamida conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, adicione 0,1 milimol de resina rink amida protegida com Fmoc a um vaso reacional de polipropileno com tampa e dois filtros, de 20 mililitros. Adicione cinco mililitros de dimetilformamida e deixe o vaso em repouso por 60 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, drene o DMF utilizando uma plataforma de vácuo para extração em fase sólida. Depois, adicione dois mililitros da solução de piperidina preparada. Coloque o recipiente em uma plataforma agitadora a 450 RPM, à temperatura ambiente, e agite por cinco minutos.Remova a solução utilizando a estação a vácuo. Em seguida, adicione dois mililitros de solução de piperidina e agite nas mesmas condições por 15 minutos. Após a conclusão da agitação, remova a solução por meio da estação a vácuo.Adicione dois mililitros de DMF e misture por 30 segundos para lavar a resina. Drene o DMF e repita a lavagem três vezes. Para iniciar a síntese por submonômeros, adicione um mililitro da solução preparada de ácido bromoacético e 0,2 mililitros da solução preparada de DIC.Agite durante 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, drene a solução e lave três vezes usando dois mililitros de DMF a cada vez. Adicione um mililitro da solução de amina preparada.Em seguida, agite a resina durante 60 minutos à temperatura ambiente. Drene a solução e lave a resina três vezes, utilizando dois mililitros de DMF cada vez. A seguir, adicione um mililitro de solução de ácido bromoacético e 0,2 mililitros de solução de DIC.Agite durante 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, drene a solução e lave três vezes utilizando dois mililitros de DMF a cada vez. Para introduzir um monômero funcionalizado com guanidina, adicione um mililitro de solução de diamina não protegida à resina.Agite durante 60 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, drene a solução e lave a resina com dois mililitros de DMF três vezes. Adicione 0,5 mililitros da solução preparada de 2-acetil dimedona.Agite durante 60 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, drene a solução e lave a resina com dois mililitros de DMF três vezes. Continue a síntese por submonômeros até que a sequência desejada seja obtida.Em seguida, adicione quatro mililitros da solução de hidrazina preparada e agite por três minutos à temperatura ambiente. Drene a solução e repita o procedimento três vezes. Depois, lave a resina três vezes utilizando dois mililitros de DMF em cada lavagem.Adicione DIPEA e seis equivalentes de pirazol-1-carboxamidina por amina livre na sequência do peptóide. Agite durante 60 minutos à temperatura ambiente. Após a conclusão da agitação, remova a solução.Lave a resina três vezes usando dois mililitros de diclorometano para cada lavagem. Seque a resina ao ar por 10 minutos e armazene para uso futuro. Uma clivagem de teste pode ser realizada após a adição de aminas para verificar o andamento da síntese.Para iniciar a clivagem final, adicione quatro mililitros de coquetel de clivagem ao mesmo cartucho de reação com fritta utilizado para a síntese e cubra o recipiente. Agite durante 90 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, utilizando o recipiente de reação com fritta, filtre o coquetel de clivagem da resina para um frasco de fundo redondo.Evapore o coquetel de clivagem utilizando um evaporador rotativo. Adicione dois mililitros de éter dietílico anidro para precipitar o peptoid. Usando uma pipeta, remova o éter dietílico e descarte.Em seguida, repita a precipitação com éter dietílico três vezes. Após a conclusão da precipitação, dissolva o peptoido bruto em 10 mililitros de solução preparada de acetonitrila e água acidificada. Transfira para um recipiente previamente pesado.Em seguida, congele a menos 20 graus Celsius e liofilize até obter um pó seco, pronto para purificação por CLAE em fase reversa. Após o cultivo dos parasitas Leishmania mexicana e transformação para a fase amastigota axênica, inicie o ensaio de citotoxicidade preparando soluções-estoque dos compostos conforme descrito no protocolo textual. Adicione dois microlitros de solução-estoque de peptóide a cinco milimolar, controle de anfotericina B e controle de DMSO à linha superior de uma placa de 96 poços conforme descrito no protocolo textual.Usando uma pipeta multicanal, adicione 48 microlitros de meio fresco à linha superior. Adicione 25 microlitros de meio fresco a todas as outras linhas. Em seguida, realize uma diluição em série pipetando 25 microlitros de solução da linha superior, adicionando-a à linha abaixo e misturando.Repita as diluições para toda a placa descartando os últimos 25 microlitros pipetados da fileira inferior. Em seguida, transfira um cultivo de parasita para um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugue por cinco minutos a 447 vezes g.Descarte o meio antigo e adicione 10 mililitros de meio fresco. Em seguida, usando uma pipeta, ressuspenda suavemente o pellet de parasitas no novo meio. Conte utilizando um hemocitômetro Neubauer aprimorado e dilua a cultura para oito milhões de parasitas por mililitro.Após a cultura ter sido diluída, adicione 25 microlitros de parasitas a cada poço. Incube a placa por 60 minutos a 32 graus Celsius. Após a conclusão da incubação, remova 40 microlitros de solução de cada poço.Adicione 90 microlitros de meio fresco a cada poço e incube a 32 graus Celsius por 24 horas. Em seguida, adicione 10 microlitros de solução à base de resazurina para viabilidade celular a cada poço. Incube a 32 graus Celsius por quatro horas.Após a conclusão da incubação, utilize um leitor de placas para medir a fluorescência. Analise os dados removendo a média do fundo e comparando a fluorescência dos poços após a normalização em relação aos controles de DMSO. Neste estudo, dois peptoides são sintetizados utilizando 120 miligramas de resina rink amida cada.Os produtos são purificados por cromatografia líquida de alta pressão em fase reversa, e as frações correspondentes à massa alvo são combinadas e obtidas como pós brancos. A quantidade obtida para os dois peptoides é apresentada aqui, com rendimentos de aproximadamente 30% para frações com pureza superior a 90%. A pureza do produto é avaliada por meio de CLAE analítica em fase reversa e visualizada a 220 nanômetros, correspondente à absorvância da cadeia peptídica de amida.Observa-se que os peptoides são ambos homogêneos. Aqui são apresentados os resultados representativos dos ensaios de citotoxicidade contra L. Mexicana. Soluções estoque de cinco milimolares dos compostos são preparadas em DMSO de grau para cultura celular e testadas em triplicata, pelo menos duas vezes, para garantir dados robustos.Pode-se observar que o peptóide B é mais eficaz do que o peptóide A na redução da porcentagem de parasitas viáveis, com ambos apresentando um efeito dependente da dose. Após assistir a este método, você deverá ter uma boa compreensão de como sintetizar, caracterizar e purificar peptóides que contenham monômeros do tipo lisina e do tipo arginina, bem como de como utilizá-los em ensaios de citotoxicidade contra Leishmania mexicana. Nosso método para adicionar funcionalidade catiônica dupla aos peptóides acrescenta apenas uma etapa simples adicional ao método de submonômero comumente utilizado na síntese de peptóides.Após este método, submonômeros do tipo lisina ou arginina de diferentes comprimentos podem ser adicionados para ajudar a aumentar a diversidade da biblioteca, por exemplo, com cadeias laterais de dois a seis carbonos de comprimento. Ao tentar a síntese de peptoides, é realmente importante lembrar de lavar bem a resina entre as etapas para evitar produtos indesejados de adição ou deleção. Este método abre caminho para que pesquisadores explorem a atividade biológica de peptoides funcionalizados cationicamente mistos e comparem essa atividade com a de peptoides que contêm exclusivamente monômeros do tipo lisina ou arginina.Por fim, não se esqueça de que os parasitas e vários dos reagentes utilizados neste protocolo podem ser extremamente perigosos. Portanto, é importante sempre utilizar equipamento de proteção individual adequado e trabalhar dentro de uma capela de exaustão ou de uma cabine de segurança microbiológica, quando apropriado.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Um método eficiente para a Síntese de Peptóides com Monómeros Mixed tipo de lisina / arginina-tipo e avaliação da sua actividade anti-leishmaniose (Vídeo) | JoVE Journal

Um método eficiente para a Síntese de Peptóides com Monómeros Mixed tipo de lisina / arginina-tipo e avaliação da sua actividade anti-leishmaniose

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