Um método eficiente para a Síntese de Peptóides com Monómeros Mixed tipo de lisina / arginina-tipo e avaliação da sua actividade anti-leishmaniose

O objetivo geral deste procedimento é introduzir monômeros do tipo lisina e arginina dentro da mesma sequência peptoide e avaliar a atividade desses compostos contra Leishmania mexicana, os parasitas causadores da doença tropical negligenciada leishmaniose cutânea. Novas terapêuticas são urgentemente necessárias para a leishmaniose tegumentar, e esse procedimento pode ajudar a identificar e desenvolver peptoides como uma nova classe de potenciais anti-infecciosos para essa doença tropical negligenciada. A principal vantagem deste protocolo é que podem ser sintetizados peptóides que contêm funcionalidade catiônica mista.

Isso é altamente desejável, pois pode ajudar a modular as atividades biológicas das sequências. Embora isso teste contra a forma mamífera do parasita, também pode ser usado contra o estágio de inseto de Leishmania mexicana ou aplicado a linhagens celulares de mamíferos. A demonstração visual deste método é realmente útil porque mostra a natureza gradual da síntese e também a cultura do parasita em vários pontos do ciclo de vida de Leishmania mexicana.

Para iniciar este procedimento, prepare soluções em dimetilformamida, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, adicione 0,1 milimoles de resina de amida de rinque protegida por Fmoc a um recipiente de reação de polipropileno de 20 mililitros tampado com duas batatas fritas. Adicione cinco mililitros de dimetilformamida e deixe o recipiente repousar por 60 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, drene o DMF usando uma plataforma de vácuo de extração em fase sólida. Em seguida, adicione dois mililitros de solução de piperidina preparada. Colocar o recipiente sobre uma plataforma agitadora a 450 RPM à temperatura ambiente e agitar durante cinco minutos.

Drene a solução usando a estação de vácuo. Em seguida, adicione dois mililitros de solução de piperidina e agite nas mesmas condições por 15 minutos. Após a agitação, drene a solução através de uma estação de vácuo.

Adicione dois mililitros de DMF e misture por 30 segundos para lavar a resina. Escorra o DMF e repita a lavagem três vezes. Para iniciar a síntese de submonômeros, adicione um mililitro de solução preparada de ácido bromoacético e 0,2 mililitros de solução preparada de CIVD.

Agite por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, escorra a solução e lave três vezes usando dois mililitros de DMF de cada vez. Adicione um mililitro de solução de amina preparada.

Em seguida, agite a resina por 60 minutos em temperatura ambiente. Escorra a solução e lave a resina três vezes usando dois mililitros de DMF de cada vez. Em seguida, adicione um mililitro de solução de ácido bromoacético e 0,2 mililitros de solução DIC.

Agite por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, escorra a solução e lave três vezes usando dois mililitros de DMF de cada vez. Para introduzir um monômero funcionalizado com guanidina, adicione um mililitro de solução de diamina desprotegida à resina.

Agite por 60 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, escorra a solução e lave a resina com dois mililitros de DMF três vezes. Adicione 0,5 mililitros de solução preparada de 2-acetil dimedona.

Agite por 60 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, escorra a solução e lave a resina com dois mililitros de DMF três vezes. Continue a síntese de submonômeros até que a sequência desejada seja feita.

Em seguida, adicione quatro mililitros de solução de hidrazina preparada e agite por três minutos em temperatura ambiente. Escorra a solução e repita três vezes. Em seguida, lave a resina três vezes usando dois mililitros de DMF para cada lavagem.

Adicione DIPEA e seis equivalentes de pirazol-1-carboxamidina por amina livre na sequência peptóide. Agite por 60 minutos em temperatura ambiente. Depois de terminar a agitação, escorra a solução.

Lave a resina três vezes usando dois mililitros de diclorometano para cada lavagem. Seque a resina ao ar por 10 minutos e guarde para uso futuro. Um teste de clivagem pode ser realizado após adições de amina para verificar o progresso da síntese.

Para iniciar a clivagem final, adicione quatro mililitros de coquetel de clivagem ao mesmo cartucho de reação frita usado para síntese e cubra o recipiente. Agite por 90 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, usando o recipiente de reação frita, filtre o coquetel de clivagem da resina para um balão de fundo redondo.

Evapore o coquetel de clivagem usando um evaporador rotativo. Adicione dois mililitros de éter dietílico anidro para precipitar o peptóide. Usando uma pipeta, remova o éter dietílico e descarte.

Em seguida, repetir três vezes a precipitação do éter dietílico. Quando a precipitação estiver completa, dissolva o peptóide bruto em 10 mililitros de acetonitrila preparada e solução aquosa acidificada. Transfira para um recipiente pré-pesado.

Em seguida, congelar a 20 graus Celsius negativos e liofilizar até obter um pó seco pronto para purificação por HPLC de fase reversa. Após a cultura dos parasitas Leishmania mexicana e a transformação para o estágio amastigota axênico, inicie o ensaio de citotoxicidade preparando soluções de estoque compostas conforme descrito no protocolo de texto. Adicione dois microlitros de solução estoque peptoide de cinco milimolares, controle de anfotericina B e controle de DMSO à linha superior de uma placa de 96 poços, conforme descrito no protocolo de texto.

Usando uma pipeta multicanal, adicione 48 microlitros de meio fresco à linha superior. Adicionar 25 microlitros de meio fresco a todas as outras linhas. Em seguida, efectuar uma diluição em série pipetando 25 microlitros de solução da linha superior, adicionando-a à linha inferior e misturando.

Repetir as diluições para toda a placa, rejeitando os últimos 25 microlitros pipetados da linha inferior. Em seguida, transfira uma cultura de parasitas para um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar durante cinco minutos a 447 vezes g.

Despeje o meio antigo e adicione 10 mililitros de meio fresco. Em seguida, usando uma pipeta, ressuspenda suavemente o pellet de parasitas no novo meio. Contagem usando um hemocitômetro aprimorado de Neubauer e diluir a cultura para oito milhões de parasitas por mililitro.

Depois que a cultura for diluída, adicione 25 microlitros de parasitas a cada poço. Incube a placa por 60 minutos a 32 graus Celsius. Quando a incubação estiver concluída, remova 40 microlitros de solução de cada poço.

Adicione 90 microlitros de meio fresco a cada poço e incube a 32 graus Celsius por 24 horas. Em seguida, adicione 10 microlitros de solução de viabilidade celular à base de resazurina a cada poço. Incube a 32 graus Celsius por quatro horas.

Após a conclusão da incubação, use um leitor de placas para medir a fluorescência. Analise os dados removendo o fundo médio e comparando a fluorescência dos poços após a normalização com a ressecção com os controles DMSO. Neste estudo, dois peptóides são sintetizados usando 120 miligramas de resina amida de rinque cada.

Os produtos são purificados por cromatografia líquida de alta pressão de fase reversa e as frações correspondentes à massa alvo são combinadas e obtidas como pós brancos. A quantidade coletada para os dois peptóides é mostrada aqui com rendimentos de aproximadamente 30% para frações acima de 90% de pureza. A pureza do produto é avaliada usando uma HPLC analítica de fase reversa e visualizada em 220 nanômetros, a absorbância da estrutura da amida.

Os peptóides são ambos vistos como homogêneos. Os resultados representativos dos ensaios de citotoxicidade contra L Mexicana são mostrados aqui. As soluções de estoque de cinco milimolares dos compostos são feitas em DMSO de grau de cultura de células e testadas em triplicados pelo menos duas vezes para garantir dados robustos.

Pode-se ver que o peptoide B é mais eficaz do que o peptoide A na redução da porcentagem de parasitas viáveis, com ambos tendo um efeito dose-dependente. Depois de assistir a este método, você deve ter uma boa compreensão de como sintetizar, caracterizar e purificar peptóides que contêm monômeros do tipo lisina e arginina e como usá-los em ensaios de citotoxicidade contra Leishmania mexicana. Nosso método para adicionar funcionalidade catiônica dupla em peptóides adiciona apenas uma etapa extra simples ao método de síntese de peptóides de submonômero comumente usado.

Seguindo este método, submonômeros do tipo lisina ou arginina de diferentes comprimentos podem ser adicionados para ajudar a aumentar a diversidade da biblioteca, por exemplo, com cadeias laterais de dois a seis carbonos de comprimento. Ao tentar a síntese peptóide, é muito importante lembrar de lavar bem a resina entre as etapas para evitar produtos indesejados de adição ou exclusão. Este método abre caminho para os pesquisadores explorarem a atividade biológica de peptóides catiônicos mistos funcionalizados e compararem essa atividade com aqueles que contêm exclusivamente monômeros do tipo lisina ou arginina.

Finalmente, não se esqueça de que os parasitas e vários dos reagentes usados neste protocolo podem ser extremamente perigosos. Portanto, é importante sempre usar equipamentos de proteção individual adequados e trabalhar dentro de uma capela de exaustão ou cabine de segurança microbiológica, quando apropriado.