Name: hiperpolarizado 13 C Metabolic Espectroscopia de Ressonância Magnética e imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Aprenda a hiperpolarizar moléculas de carbono-13 usando polarização nuclear dinâmica para medir conversão enzimática em tempo real em linhagens de células de carcinoma de próstata. Este método avançado permite estudar metabolismo celular com imagem por ressonância magnética.

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E.K. agradece o apoio da Escola de Pós-Graduação em Bioengenharia (GSB) da Technische Universität München. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) dentro do Centro de Pesquisa Colaborativa SFB 824, "Imagem para Seleção, Monitoramento e Individualização de Terapias contra o Câncer".

1. Amostra Preparação da Solução <ol><li> Adicionar gadoterate meglumina (GADM, 0,5 mol / L) de concentrado [1- 13 C] ácido pirúvico para dar uma concentração final de 1-mmol / L GADM. Adicionar tritilo radical tris (8-carboxi-2,2,6,6-tetra- (hidroxietil) -benzo- [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-il) - sal de sódio de metilo (OX063) a esta mistura para dar uma concentração final de 15 mmol / L. Vórtice até à dissolução completa. NOTA: Esta preparação de soluções de é projetado para uso com um 3.35-T hiperpolarizadora pré DNP. Quando um hiperpolarizadora clínica 7-T é utilizada, a meglumina gadoterate não é necessário porque, em um campo magnético mais elevado, as suas vantagens são insignificantes. A adição de um agente de contraste à base de gadolínio aumenta a polarização em estado sólido também possível, e a taxa de polarização. No entanto, no estado líquido, o agente de contraste reduz o tempo de relaxamento T1. </li></ol> 2. Crescer a cultura celular <ol><li cultivar c pc3 num frasco de cultura com uma>2 de crescimento de 125 cm. Use meio F-12K contendo 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e manter as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada a 5% CO 2. Antes do passo de dissolução, o meio de remover a partir do balão de cultura. NOTA: Cada linha de células requer um protocolo de preparação particular para a propagação de células. Consulte os requisitos com o fornecedor de linha celular. </li></ol> 3. Preparação das células para o experimento <ol><li> Remover o meio das células e lavar as células com ~ 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). </li><li> Adicionar 5 ml de tripsina ao balão e devolver os frascos de cultura celular na incubadora durante 3 a 5 min. </li><li> Adicionar ~ 5 mL de meio F-12K para desactivar a tripsina. </li><li> Contar as células usando um contador de células automático. Misturar 10 ul da solução de células com 10 uL da solução de coloração. Misturar bem com a pipeta e transferir 10 ul da mistura em the câmara de um "vidro contando". </li><li> Remover e contar as células no frasco (s). Transferir os volumes adequados contendo o número desejado de células (por exemplo, 5 x 10 6 a 10 8) em frascos de plástico. </li><li> Centrifugar as células a 1200 xg durante 5 min e desprezar o sobrenadante. </li><li> Re-suspender as células no meio F-12K contendo 10% de FCS até um volume total de 800 uL e transferi-los para um copo de reacção (2 mL). Coloque o copo de reacção para um frasco de plástico cheio de água morna. </li></ol> 4. A dissolução do agente Preparação NOTA: O agente de dissolução é um líquido que é utilizado para dissolver a amostra hiperpolarizado. Em aplicações biológicas, a dissolução é usualmente realizada com H2O ou com base em óxido de deutério (D 2 O) tampões baseados, tal como PBS ou Tris (hidroximetil) aminometano (Tris), contendo 1 g / l de ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA). <ol><li> Preparação de 20 mmol de tampão / L de PBS <ol><li> Para a preparação de 100 ml do agente de dissolução, dissolve-se 36 mg de fosfato monossódico (NaH 2 PO 4), 247 mg de fosfato de dissódio (Na 2 HPO 4), e 10 mg de EDTA numa solução de hidróxido de / L de sódio 20 mmol ( NaOH) em D 2 O. Mix corretamente até dissolução completa. NOTA: EDTA (1 g / L) é adicionado ao tampão para eliminar possíveis iões ferromagnéticas, que pode estragar a hiperpolarização. O NaOH é utilizado para neutralizar o ácido pirúvico em uma proporção de 1: 1 mol até atingir um pH de 7,4. </li></ol></li></ol> 5. temperatura variável Insert (VTI) Cooldown <ol><li> Na janela principal do programa polarizador DNP-RMN, clique em "Recarga". NOTA: Este liga a bomba de vácuo e evacua o VTI para aproximadamente 5,0 mbar. Subsequentemente, a válvula de agulha entre o reservatório e VTI hélio líquido totalmente aberta, permitindo que o hélio líquido a fluir para o VTI. A taxa de fluxo é regulated pela válvula de agulha para manter a quantidade óptima de hélio líquido na VTI até atingir a temperatura de ebulição do hélio. Em seguida, o VTI é evacuado a vácuo quase completa, e a temperatura atinge cerca de 1,4 K. A VTI é preenchido com hélio líquido-se a 65%. Neste ponto, o aparelho está pronto para a inserção da amostra. </li></ol> 6. Preparação de amostras e Inserção <ol><li> Usando uma micropipeta, adicione ~ 8 mL de 13 solução de amostra C-marcado em um copo de plástico. </li><li> Fixe o copo de plástico à haste de inserção e iniciar o processo de inserção de amostra pressionando "Inserir amostra" na janela principal do programa. Selecione "amostra Normal" e clique em "Continue". NOTA: Durante este processo, a primeira válvula de agulha fecha para interromperem o fluxo de hélio líquido em VTI, e a pressão no VTI, em seguida, aumenta. O suporte de amostras dentro do VTI é levantada a partir do hélio líquido, a válvula de entradana parte superior da VTI é aberta, e um fluxo de hélio gasoso é introduzido a partir da válvula de admissão para evitar a contaminação pela humidade do ar exterior. </li><li> Quando solicitado, empurre a vareta de inserção com o copo de plástico anexado para dentro do VTI. Certifique-se de atingir o suporte de amostra na parte inferior da VTI. Caso contrário, o hélio gasoso pode empurrar a amostra para fora do VTI. </li><li> Separar e remover a haste de inserção. </li><li> Terminar o procedimento, clicando em "Next" na janela de diálogo. O procedimento de inserção amostra não deve demorar mais do que 10 s. NOTA: A válvula de entrada fecha então, o fluxo de hélio gasoso é interrompido, o suporte de amostra com o copo de amostra é submersa em hélio líquido, e a válvula de agulha é aberta para permitir que o hélio líquido a fluir para o VTI. Após 5-10 minutos, o VTI é arrefecida abaixo de 1,4 K, permitindo que todos os electrões livres a ser polarizada. </li><li> Confirmar que o copo de plástico com a amostra foi introduzida correctamente no VTI, verificando tchapéu não está ligado à vareta de inserção ou empurrado para fora da VTI por gás hélio. Em seguida, clique em "Concluir". </li></ol> 7. Microondas varredura (opcional) NOTA: A remoção de microondas permite a determinação da frequência de microondas ideal para maximizar a taxa de hiperpolarização dos núcleos 13 C no composto alvo. <ol><li> Para medir a varredura microondas, iniciar o programa RINMR, digite "HYPERSENSENMR," e clique em "Selecionar Config" e "Do Microsweep." </li><li> Para iniciar o processo, selecione a guia "calibrar" na janela principal do programa. </li><li> Clique em "Generate" e escolha o início eo fim de frequência (por exemplo, 94,100 GHz-94,200 GHz), o tamanho do passo de frequência (por exemplo, 20 MHz), a alimentação (100 mW), eo tempo (60 s). Clique em "Continuar", "Ativar" e "Iniciar". NOTA: Com essas configurações, o hiperpolarizadora primeira polariza a amostradurante 60 s utilizando uma freqüência de microondas de 94.100 GHz e uma potência de 100 mW. Em seguida, aplica-se um pulso de 90 ° de rádio-frequência (RF) e adquire o sinal de 13 C hyperpolarized usando o espectrômetro de built-in. Estes passos são repetidos para cada passo na gama de frequências especificada. Para hiperpolarização posterior, escolha a freqüência de microondas com a amplitude do sinal máximo medido. </li></ol> 8. Polarização <ol><li> Para medir a polarização build-up, iniciar o programa RINMR, digite "HYPERSENSENMR," e clique em "Selecionar Config" e "Build-up sólido." </li><li> Na janela principal do programa polarizador DNP-RMN, clique em "polarização" para iniciar o processo de hiperpolarização. </li><li> Escolha a frequência ideal de microondas (obtido durante a varredura microondas) eo poder (por exemplo, 100 mW) para a amostra e clique em "Avançar". </li><li> Enable "Polarização monitoramento build-up" e clique em "Finish". </li><li> Polarizar a amostra&gt; 95% (~ 60 min para [1- 13 C] piruvato). Nota: Durante a polarização, as microondas são guiados para o VTI e para a amostra, fazendo com que a 13 C gira para alinhar com as rotações de electrões desemparelhados hiperpolarizados. Para medir a acumulação de hiperpolarização, pulsos de RF com um ângulo de aleta (FA) de 5 ° são aplicados periodicamente (por exemplo, a cada 300 s), e o sinal resultante é representada como uma curva de acumulação de polarização. </li></ol> 9. Dissolução <ol><li> Quando a polarização atinge&gt; 95%, dará início ao processo de dissolução, clicando em "Dissolução" na janela principal do programa polarizador DNP-RMN. </li><li> Escolha o processo de dissolução a partir do menu drop-down e clique em "Avançar". NOTA: O polarizador permite uma para definir o processo de dissolução desejado, escolhendo o momento do gás perseguição. </li><li> Carregar ~ 5 ml do agente de dissolução através da válvula de topo para um recipiente aquecido em tEle faz parte dissolução do polarizador. Calcular o volume exacto do agente de dissolução necessário, utilizando a equação seguinte: <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54751/54751eq1.jpg"> em que V é o volume DA desejada de agente de dissolução, M Pa, m OX063, e m Gade são as massas da piruvato, OX063 e meglumina gadoterate, respectivamente, adicionou-se à solução da amostra. </li><li> Coloque a vara de dissolução na posição activa acima da válvula de entrada. NOTA: Isso permite que o instrumento para conectar sua instrumentação dissolução do copo de amostra no VTI. </li><li> Clique em "Finish" para iniciar o processo de dissolução. NOTA: O agente de dissolução é pressurizado a 3 bar com gás hélio e é subsequentemente aquecida até 200 ° C, provocando um aumento da pressão. Quando a pressão atinge 10 bar, a válvula de agulha fecha para interromperem o fluxo de hélio líquido na VTI. O suporte de amostras levanta a taçado hélio líquido. A vara de dissolução é reduzido para o VTI e ligado ao copo de amostra. O agente de dissolução condicionado é empurrado pela pressão, que resulta a partir do vaso de aquecimento contendo o tampão de dissolução e de gás hélio, através da dissolução da vara para a taça, causando uma rápida dissolução da amostra. A solução, então, flui para fora para o balão de recolha através de tubos de plástico. A vara de dissolução com a taça ligada é então levantada a partir do VTI. </li><li> Mover a alavanca de dissolução com a taça ligado à posição "limpeza" e conclua o processo clicando em "Finish". </li></ol> Detecção 10. do C hyperpolarized Signal 13 <ol><li> 13 C metabólica espectroscopia de ressonância magnética in vitro <ol><li> Misturar 200 mL de o / L dissolvido amostra hiperpolarizado 20 mmol a partir do balão de recolha com 800 uL da solução de células. NOTA: A concentração final resultantede [1- 13 C] piruvato é 4 mmol / L. </li><li> Misture bem a suspensão utilizando uma micropipeta e a transferência de ~ 600 mL para um tubo de RMN de 5 mm. </li><li> Inserir o tubo de RMN de 5 mm para o espectrómetro de RMN de 1-T. Na janela principal do software, clique em "Executar" para iniciar a medição, aplicando série de cem 10 ° pulsos de RF a cada 3 s. NOTA: medir o tempo entre a mistura inicial da amostra hiperpolarizado com as células e o início da aquisição espectroscópica. Certifique-se de que o procedimento de mistura não exceda 30 s para minimizar a perda de polarização. </li></ol></li><li> 13 C ressonância magnética metabólica <ol><li> Para construir um recipiente para os experimentos in vitro, usando o espectrômetro de ressonância magnética, dê uma seringa de 5 ml e conectá-lo a um cateter (d = 1,2 mm) que é longo o suficiente para alcançar a partir iso-centro do espectrômetro para a área acessível do espectrômetro. </li><li> Encha o recipiente in vitro com thsolução de e células com a concentração desejada para a experiência (por exemplo, 10 8) ou com uma solução enzimática. </li><li> Coloque um recipiente in vitro no isocentro do magneto MRI. Coloque uma bobina receptora de rádio frequência 13 C-sintonizado no recipiente. Coloque um fantasma de calibração concentrada 13 marcado com C (por exemplo, 10 mol / L 13 C-ureia) nas proximidades. </li><li> Insira o "container in vitro" próximo iso-centro do scanner de RMN a. </li><li> Execute sequência de localização de 3 plano padrão do scanner e ajustar a posição do recipiente in vitro para iso-centro, conforme necessário. </li><li> Executar uma sequência pesada em T2 1 H "anatômica" cobrindo o in vitro recipiente de localização. Utilize as seguintes definições: spin echo 2D com orientação axial, tempo de repetição (TR) = 2.000 ms, tempo de eco (TE) = 20 ms, fatia de espessura = 1 mm, de campo de visão que cobre o recipiente in vitro, e16 ecos por excitação. Certifique-se de que calços campo é feito em protões durante este passo. </li><li> Nas imagens anatômicas, selecione 5 fatias contíguas centradas na região de interesse. Prescrever uma aquisição de calibração espectroscópica 13 C cobrindo as fatias anatômicas selecionados. Utilize as seguintes definições: sequência de calibração 2D Block-Siegert com orientação axial 12 x 12 centric codificado, TR = 1.000 ms, espessura de corte = 5 mm, campo de visão combinando imagens anatômicas, número de scans (NS) = 64, largura de banda = 5,000 Hz, e FA = 90 °. </li><li> Selecione a sequência de calibração espectroscópica 13 C (para mais informações, consulte Schulte et al. 2011) 75 da biblioteca sequência de impulsos. Baixar a sequência de pulso para o scanner do computador clicando em "Download". Clique em "Spectra Prescan" para executar o pré-digitalização espectroscópica. Na trama espectro de magnitude, ajustar o pico do fantasma de calibração 13 C ao center da frequência scanner. Definir os ganhos do receptor ao máximo. Clique em "Iniciar" para executar a sequência de calibração espectroscópica 13 C. Observe o ganho de transmissão relatado e frequência centric. </li><li> Definir uma aquisição de 13 C imaging deslocamento químico (CSI), que abrange as fatias anatômicas selecionados. Utilize as seguintes definições: 2D eco-planar espectroscópica imagiologia (EPSI) com orientação axial 12 x 12 centric codificado, TR = 400 ms, espessura de corte = 5 mm, campo de visão correspondentes imagens anatômicas, NS = 300, e largura de banda = 5.000 Hz . NOTA: As amostras Epsi uma única linha no k-space repetidamente após uma excitação RF para adquirir tanto a informação espacial e espectral simultaneamente. Para mais informações sobre as técnicas de aquisição, ver o artigo de Durst et al. 2015 76. </li><li> Baixar a sequência C CSI 13 e executar a pré-digitalização espectroscópica. Ajustar a frequência do scanner e transmitir o ganho como especificado pela sequência de calibraçãosaída. </li><li> Depois de a solução hiperpolarizado é depositado no balão de recolha, elabora ~ 3 mL para uma seringa e em seguida injectá-la no cateter ligado ao recipiente in vitro. Iniciar a aquisição. Após a aquisição for concluída, salve o arquivo de dados brutos para a reconstrução subsequente. </li></ol></li></ol> Reconstrução 11. Dados <ol><li> Aplicar um dos dois modelos cinéticos descritos para analisar os dados adquiridos. <ol><li> No primeiro método para descrever a cinética de LDH, valor cinética (K), comparar a soma do sinal de lactato (M LAC) para o sinal de todas as moléculas hiperpolarizados (M x) 21,77. <img alt="equação 2" src="/files/ftp_upload/54751/54751eq2.jpg"></li><li> No outro método, medir o lactato e piruvato de sinais ao longo do tempo e se encaixam estes a um modelo de cinética 17,25,71. Para resolver a taxa de câmbio metabólica, k PA → LAC, e de eficáciataxa de decaimento do sinal de lactato, r LAC, use as seguintes equações diferenciais lineares usando o modelo de câmbio diferencial de dois locais, produzindo para o lactato: <img alt="equação 3" src="/files/ftp_upload/54751/54751eq3.jpg"></li></ol></li></ol> Nota: O sinal de lactato taxa de decaimento r LAC eficaz é dependente do tempo de relaxamento longitudinal de lactato (t 1, a ALC), a taxa de troca metabólica oposto de lactato para piruvato K ALC → PA, a FA aplicada e TR, e a intensidade do sinal de piruvato (M Pa) e lactato (M ALC), tendo em conta a redução irreversível depois de cada sinal de excitação sucessiva: <img alt="equação 4" src="/files/ftp_upload/54751/54751eq4.jpg"> Portanto, r LAC resulta em um único termo, inseparável da decadência notável. Uma vez que é possível corrigir para tele virar ângulo e o tempo de repetição, e mesmo que não haja um fluxo ALC → PA, assume-se que a taxa de câmbio de lactato para piruvato (k ALC → PA) não precisam de ser incluídos no cálculo, com base nos resultados de Harrison et al. 2012 78. Seus resultados mostram que o k LAC → PA não desempenha um papel tão crucial como é de se supor. Este modo permite que o T 1 tempo de relaxamento de lactato a ser quantificado. Este modelo é independente de administração piruvato para a medição, o que, no caso em experiências in vitro, não é crucial e pode ser negligenciada. É, no entanto, desempenham um papel importante para nas medições in vivo 79.

Rolf F. Schulte e Marion I. Menzel trabalham na GE Global Research.

13 CMRSI com sondas hiperpolarizados é um método promissor para monitorizar em tempo real o metabolismo in vitro e in vivo. Um aspecto muito importante quando se emprega este processo experimental é a padronização adequada, especialmente em relação experimentos in vitro. Em primeiro lugar, a preparação da amostra tem de ser feito de forma adequada e consistente para conseguir a mesma concentração de material hiperpolarizado em cada experiência. Isto requer uma pesagem precisa de tan...

Presentemente, o método clínica mais amplamente utilizada para estadiamento do tumor, Reestadiamento, a monitorização da resposta ao tratamento e detecção de recorrência de uma ampla variedade de cancros é [18F] -FDG PET. 1 No entanto, recentemente, várias abordagens novas e alternativas têm surgido. Um desses métodos é de 13 CMRSI. Esta técnica envolve a introdução da molécula de C-13 em uma amostra biológica, seguido por MRI minimamente invasivo para avaliar o metabolismo in vitro ou in vivo em tempo real. No entanto, o maior desafio de 13 CMRSI, em comparação com os outros métodos, tais como [18F] -FDG PET ou tomografia computadorizada, é a sua baixa razão sinal-ruído. O sinal de NMR é directamente proporcional ao nível de polarização, um rácio da diferença população spin ½ núcleos em dois estados de energia à população total (Figura 1A). A polarização é um produto do thrazão E giromagnético (γ) dos núcleos e a intensidade do campo magnético aplicado sobre a temperatura. Um típico de polarização 1H núcleos é na ordem de 0,001% para 0,005% a 3 T, o que dá uma proporção relativamente baixa de sinal-para-ruído. Hoje MRI state-of-the-art tem sido um método de imagem sucesso apenas devido à grande abundância de 1 H em amostras biológicas ea relação gyromagnetic alta de 1 H (y 1H = 42,576 MHz / T). No entanto, observando outros núcleos, tais como o carbono, é mais exigente. A única, de isótopos de carbono magneticamente ativo estável, 13 C, torna-se apenas 1,1% de todos os átomos de carbono. Além disso, o rácio giromagnético de 13 C (13C γ = 10,705 MHz / T) é quatro vezes menor do que a de um H, conduzindo a uma eficiência de detecção mais baixo. Em resumo, a baixa abundância de 13 C e 13 C γ baixo conduzir a medições 13 C térmicos para atingir 0,0176% da sensibilidade de um 1Medição H-RMN in vivo. Polarização Nuclear dinâmica Um método para ultrapassar a sensibilidade relativamente fraca de 13 medições C é DNP. Foi originalmente descrita para os metais em 1953 por Albert W. Overhauser. No seu artigo, ele afirma: "Verificou-se que, se a ressonância de spin electrónico dos electrões de condução é saturada, os núcleos irão ser polarizadas no mesmo grau que seria se a sua proporção giromagnética fosse o do spin do electrão." 2 Mais tarde Naquele ano, Carver e Slichter confirmada experimentalmente a hipótese de Overhauser 3. Em 1958, Abragam e Proctor descreveu este efeito para os elétrons em líquidos e nomeou-o "efeito sólido". A temperaturas inferiores a 4 K,-spin do electrão polarização atinge cerca de 100% e é mais do que três ordens de magnitude maior do que a polarização-spin nuclear (Figura 1B) 4. Tsua ocorre porque o rácio giromagnético do electrão (γ e = 28024,944 MHz / T) é três ordens de grandeza maior do que os rácios gyromagnetic nucleares. As interacções fracas entre electrões e núcleos, tais como o efeito de Overhauser, o efeito sólido, o efeito transversal, e o efeito de mistura térmica, permitir a transferência de polarização de electrões gira para spins nucleares utilizando a irradiação de microondas com uma frequência perto do electrão correspondente ressonância paramagnética (EPR) 5,6 frequência. teoria DNP tem sido desenvolvido para envolver mais elétrons e mistura térmica. No entanto, até à data, nenhuma descrição teórica quantitativa unificado de DNP foi publicado 7,8. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54751/54751fig1.jpg"> Figura 1: compreensão dinâmica Polarização Nuclear e Hiperpolarização. A) Uma comparação esquemática da população de spinno estado de equilíbrio polarização térmica e o estado hiperpolarizado. B) A polarização é dependente da temperatura. A polarização de um electrão (e -) atinge 100% abaixo de 1.4 K. O DNP permite a transferência da polarização do electrónico para os núcleos de 13 C, o que aumenta a sua polarização até 10 vezes de 5. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54751/54751fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Para introduzir DNP em estudos de sistemas biológicos utilizando 13 C RMN, subsequente dissolução rápida amostra tinha de ser desenvolvido. 50 anos após a hipótese de Overhauser, Jan H. Ardenkjaer-Larsen et al. resolveu a questão tecnicamente difícil de levar a amostra congelada hyperpolarized no estado líquido com perda mínima hiperpolarização 6. Dissolução DNP abriu um novo campo de pesquisa chamado 13 CMRSI, fornecendo um novo método para investigar e caracterizar vários estados de doença 9,10. como portadores estáveis ​​de um elétron não emparelhado, a tritil tris radical (8-carboxi-2,2,6,6-tetra- (hidroxietil) -benzo- [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-il) -metil sal de sódio (OX063) ou (2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-il) oxilo (TEMPO) é normalmente utilizado. Estes são misturados com a molécula desejada marcada com 13 C e exposto a irradiação de microondas com uma frequência perto da frequência de EPR correspondente. Usando esta técnica, a polarização dos núcleos de 13 C pode ser aumentada até 37% 11. Isto resulta num aumento de polarização 10 vezes de 5 em comparação com a polarização equilíbrio térmico 11,12. No entanto, logo que a irradiação de microondas é parado e / ou o C-13 molécula é transferida para o estado líquido, a polarização decai com o tempo de relaxamento longitudinal (T1) do núcleo 13 C, que foi polarizada. Assim, oinvenção de técnicas de rápida dissolução ou qualquer técnica subsequente redução do tempo antes da medição experimental (isto é, injecção) é crucial para aplicações biológicas 13. Há três requisitos principais que a molécula candidato precisa cumprir para bem sucedidos 13 estudos CMRSI. Em primeiro lugar, o núcleo 13 C de interesse tem de ter um tempo suficientemente longo T 1 (&gt; 10 s). A escolha da etiqueta C-13 é crucial. Os melhores núcleos candidatos são carbonos sem contacto directo com 1 H-núcleos através de uma ligação. Também tem de ser rapidamente metabolizado dentro de 2 - 3 vezes 1 T, resultando em um produto metabólico a jusante com um desvio químico muito diferente da substância original. A mistura da amostra deve também formar um vidro amorfo quando em estado sólido de modo a que a distribuição espacial diminui a distância entre o electrão e 13 C, permitindo que o transfer de polarização. Se a molécula candidata não formar vidro amorfo, naturalmente, que deve ser altamente solúvel em um agente de envidraçamento, tal como o glicerol ou o sulfóxido de dimetilo 14. Estes requisitos resultar num número relativamente pequeno de moléculas candidatas. No entanto, mesmo depois da descoberta bem sucedida de uma molécula adequada, o desenvolvimento de um protocolo de trabalho para a hiperpolarização pode ser tecnicamente exigente 9,14,15. Nos últimos anos, vários substratos foram com sucesso polarizada, tal como [1- 13 C] piruvato 12,16 - 36, [2- 13 C] piruvato 37, [1- 13 C] etil piruvato 38, [1- 13 C ] lactato 39, [1- 13 C] fumarato 40 - 43, 13 C-bicarbonato 36,44,45, [1- 13 C] acetato de sódio 43,46 - 49, 13 C-ureia 6,36,50,51 , [5- 13 C] glutami15,52,53 NE, [1- 13 C] glutamato 53,54, [1- 13 C] 2-oxoglutarato 55, [1- 13 C] alanina, e outros 14,56. Um substrato particularmente interessante e utilizada para hiperpolarização é [1- 13 C] piruvato. É amplamente utilizada em estudos pré-clínicos para investigar a energia do metabolismo celular em várias doenças 14,17,22. [1- 13 C] piruvato preenche todos os requisitos para hiperpolarização bem sucedida, incluindo um transporte relativamente longo T 1 e rápida através da membrana celular antes posteriormente ser metabolizado. Estudos pré-clínicos com piruvato [1- 13 C] estão actualmente a ser traduzido para a clínica 57. Metabolismo do piruvato É bem conhecido que existe uma relação directa entre as mutações no DNA e alterações nas suas vias metabólicas de células cancerosas. Já na década de 1920, Otto Warburg Discovrado que há um aumento do metabolismo de glucose e produção de lactato em tumores em comparação com tecidos saudáveis 58-60. Subsequentemente, várias alternâncias em outras vias metabólicas, tais como a via de pentoses fosfato, o ciclo de ácido tricarboxílico, fosforilação oxidativa e da síntese de nucleótidos e lípidos, têm sido descritas. O piruvato é o produto final da glicólise. No tumor, ele sofre da glicólise anaeróbia catalisada pela LDH 61 e reage com a forma reduzida da nicotinamida adenina dinucleótido coenzima (NADH), o que resulta em lactato e a forma oxidada da coenzima (NAD +). Alternativamente, o piruvato é submetido a uma reacção de transaminação com o glutamato para formar alanina, catalisada por transaminase alanina (ALT). Ambas as reacções são prontamente reversível. Piruvato também sofre descarboxilação catalisada pela desidrogenase de piruvato (PDH) para dióxido de carbono e acetil-CoA, representing uma reacção irreversível neste passo. Alternâncias nestas taxas de reacção pode ser ligada ao metabolismo do tumor 17,21,22,25,62. As vias metabólicas estão resumidos na Figura 2. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54751/54751fig1.jpg"> Figura 2: Diagrama das principais reacção metabólica do piruvato. / Conversão de lactato piruvato é catalisada pela LDH, e conversão de piruvato / alanina é catalisada por ALT. O piruvato é irreversivelmente convertida a acetil-CoA e de CO 2 por PDH, e CO 2 está num equilíbrio dependente do pH com bicarbonato de 80. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54751/54751fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> A detecção de hiperpolarizado [1- 13 C] piruvato e seus metabolitos foi previamente demonstrada no rato, elearte 37,63 - 65, 66 fígado, músculo, rim e 62,67. Um estudo demonstrou diferenças significativas na relação lactato-to-alanina entre o fígado normal e em jejum de rato 66 e demonstraram um [1- 13 C] nível de lactato altamente elevada e hyperpolarized no cancro do fígado 68,69. Há evidências de que o grau do tumor pode ser identificada num adenocarcinoma transgénico da próstata de ratinho (TRAMP) usando hiperpolarizado piruvato [1- 13 C] 22, com os níveis de lactato hiperpolarizados que mostram uma elevada correlação com o grau histológico dos tumores excisados. A alanina a partir do piruvato catalisada por ALT foi também sugerida como um marcador útil no rato carcinoma hepatocelular 23. Medindo o fluxo metabólico piruvato-lactato foi usado para monitorização isquemia 63,65,70 e como uma resposta ao tratamento com drogas citotóxicas quimioterapia 17,40, segmentados &lt;sup&gt; 24,25,41, 26 ou radioterapia em modelos animais. Também tem sido utilizado para a detecção do fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) inibidor da resposta LY294002 em glioblastoma e o cancro da mama modelos de ratos 25. Alterações no metabolismo do piruvato em tumores cerebrais 26 e o cancro da próstata 24,71 também foram observadas após o tratamento. próstata Carcinoma Carcinoma da próstata é o cancro predominante em homens idosos e o segundo câncer líder envolvidos na morte de homens em todo o mundo 72. Até o momento, não há métodos confiáveis e não-invasivos estão disponíveis para o diagnóstico precoce e caracterização de câncer de próstata 73,74, enfatizando a necessidade urgente de técnicas de imagem metabólica novos para permitir a detecção rigorosa e estadiamento dos pacientes. Carcinoma da próstata foi usado como um modelo para demonstrar as possibilidades da DNP dissolução combinados com 13 CMRSI no pacienteS 57. Este trabalho foi continuado em um primeiro ensaio clínico utilizando [1- 13 C] piruvato e 13 CMRSI para a imagem do câncer de próstata, e tem apenas recentemente foi concluída (NCT01229618). A motivação por trás deste trabalho foi ilustrar em mais detalhe e para um público mais amplo a aplicação do método CMRSI 13 em um cenário pré-clínico com células. Medir o metabolismo catalisado-LDH de [1- 13 C] piruvato para [1- 13 C] lactato in vitro na linha de células de carcinoma da próstata PC3, demonstramos a eventual aplicação do DNP dissolução em estudos in vitro e abordar os passos cruciais e desafios durante os experimentos.

<table><tbody><tr><td>HyperSense DNP Polariser</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>3.35 T pré-clínico DNP hiperpolarizador</td></tr><tr><td>GE / Agilent MR901</td><td>GE Healthcare / Agilent Technologies</td><td></td><td>7 T scanner de ressonância magnética pré-clínica, com pequeno furo projetado para experimentos onroedor</td></tr><tr><td>Spinsolve Carbon</td><td>Magritek</td><td></td><td>1 T espectrômetro de RMN com ímã permanente</td></tr><tr><td>Óxido de deutério</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monbasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>Edetato dissódico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>Ácido pirúvico - 13C1</td><td>Cambridge Isotopes Laboratories</td><td>CLM-8077-1</td><td></td></tr><tr><td>Dotarem (0,5 mmol/L)</td><td>Guerbet</td><td></td><td>gadoterato meglumina&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Tris (8-carboxi-2,2,6,6-tetra-(hidroxietil)-benzo-[1,2-ndash; 4,5]-bis-(1,3)-ditiole-4-il)-metil sódio sal (OX063)</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>tritil radical usado como fonte de elétrons livres</td></tr><tr><td>da linha celular PC3</td><td>ATCC</td><td>CRL1435</td><td></td></tr><tr><td>meio F-12K&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>ATCC</td><td>SCRR-30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Tripsina-EDTA, 1x</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>Copo de plástico de amostra</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013-MSDS</td><td></td></tr></tbody></table>

hiperpolarizado 13 c metabolic espectroscopia de ressonância magnética e imagem

Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

Nas últimas décadas, novos métodos para o estadiamento do tumor, reestadiamento, a monitorização da resposta ao tratamento e detecção de recorrência de uma variedade de cânceres têm surgido em conjunto com a tomografia por emissão de positrões state-of-the-art com 18 F-fluorodeoxyglucose ([18 F ] -FDG PET). 13 C espectroscópica imagiologia de ressonância magnética (13 CMRSI) é um método de imagem minimamente invasivo que permite o controlo do metabolismo in vivo e em tempo real. Tal como acontece com qualquer outro método com base em 13 C ressonância magnética nuclear (RMN), que enfrenta o desafio de baixa polarização térmica e uma subsequente baixa relação de sinal-para-ruído devido ao relativamente baixo rácio giromagnético de 13 C e a sua baixa abundância natural em amostras biológicas. Ao superar estas limitações, a polarização nuclear dinâmica (DNP) com a dissolução da amostra subsequente recentemente habilitado comumente usados ​​sistemas de imagem por ressonância magnética (MRI) RMN e medir, Estudo, e chave vias metabólicas em vários sistemas biológicos. Uma molécula particularmente interessantes e promissoras utilizado em 13 CMRSI é [1- 13 C] piruvato, que, nos últimos dez anos, tem sido amplamente utilizada para in vitro, pré-clínicos, e, mais recentemente, estudos clínicos para investigar o metabolismo da energia celular em câncer e outras doenças. Neste artigo, vamos delinear a técnica de dissolução DNP usando um pré-clínico hiperpolarizadora DNP 3.35 T e demonstrar seu uso em estudos in vitro. Um protocolo semelhante para a hiperpolarização pode ser aplicado para a maior parte, em estudos in vivo, bem. Para isso, utilizou-se lactato desidrogenase (LDH) e a reacção catalisada metabólica de [1- 13 C] piruvato em lactato [1- 13 C] em uma linha de células de carcinoma da próstata, PC3, in vitro, utilizando 13 CMRSI.

Os resultados do "varrimento microondas" são ilustrados na Figura 3. Ele mostra que a frequência de microondas ideal para a [1- 13 C] é a amostra de piruvato 94,156 GHz para o hiperpolarizadora 3,35-T local. Todos hiperpolarização seguinte experiência (n = 14) foram realizados utilizando esta frequência de microondas, com uma potência de 100 mW. A irradiação de microondas foi aplicada durante 60 a 80 minutos, levando a uma hiperpolarização de estado sólido superior a 90%. Os resultados são ap...

A polarização nuclear dinâmica com subsequente dissolução da amostra permitiu estudos em tempo real do metabolismo em sistemas biológicos. O piruvato de [1-13C]hiperpolarizado foi usado para estudar a atividade da lactato desidrogenase em uma linhagem celular de carcinoma de próstata in vitro.

hiperpolarizado 13 C Metabolic Espectroscopia de Ressonância Magnética e imagem

In the past decades, new methods for tumor staging, restaging, treatment response monitoring, and recurrence detection of a variety of cancers have ...

O objetivo geral deste procedimento é hiperpolarizar moléculas marcadas com carbono 13 usando polarização nuclear dinâmica e medir sua conversão enzimática usando ressonância magnética de carbono 13, imagem retroscópica, in vitro. Este método aumenta o sinal ressonante do carbono em 10.000 a 100.000 vezes, permitindo que os compostos em camadas sejam distinguidos de seus produtos metabólicos e localizados no corpo por meio de imagens. A principal vantagem desse método, em comparação com, digamos, as técnicas de RV, é que ele fornece uma visão do metabolismo de substâncias que ocorrem naturalmente em organismos vivos em tempo real.Além disso, este método pode fornecer informações sobre o metabolismo do câncer e como é in vitro. Também pode ser aplicado a modelos animais e pacientes humanos. A aplicação dessa técnica excede a localização do tumor.Ele pode ser usado para encontrar e distinguir subtipos de tumores metabólicos e para monitorar o tratamento juntamente com técnicas de última geração. Para iniciar o procedimento, primeiro prepare uma solução milimolar de gadoterato meglumina e 13 piruvato concentrado de um carbono. Adicione o radical tritil OX063 à mistura para atingir uma concentração final de 15 milimolares e dissolva-o completamente.No software DNP Polarizer, clique em Cool Down'para diminuir a temperatura da inserção de temperatura variável, ou VTI, abaixo de 1.4 kelvin. Depois que o VTI esfriar, coloque cerca de oito microlitros da solução de amostra marcada com carbono 13 em um copo de amostra de plástico. Fixe o copo na haste de inserção da amostra.No software, clique em Inserir amostra'Selecione amostra normal'e depois Avançar'Isso levanta o suporte de amostra e abre as válvulas de entrada para o VTI, permitindo a inserção da amostra. No prompt, use a haste de inserção para empurrar o sample copo para dentro do VTI. Retire o copo de amostra e retire cuidadosamente a haste de inserção.Confirme se a amostra foi separada da haste e não foi empurrada para fora do VTI durante o procedimento de fechamento. Clique em Avançar'para fechar as válvulas e abaixar o copo de amostra no hélio líquido e, em seguida, clique em Concluir'Para encontrar uma frequência de polarização ideal, primeiro inicie o software RINMR. Na tela de configuração, clique em Selecionar amostra'e Faça micro varredura'Crie o arquivo onde os dados serão armazenados.Volte para o software DNP Polarizer. Selecione a guia Calibrar, defina os parâmetros de varredura de micro-ondas e inicie o processo de varredura de micro-ondas. Quando a varredura de micro-ondas terminar, observe a frequência com uma amplitude máxima de sinal medida.Retorne ao software RINMR e selecione Solid Build Up'Em seguida, no software DNP Polarizer, clique em Polarização'Insira a frequência ideal de microondas e a potência. Clique em Avançar'Ativar monitoramento de acúmulo de polarização'e clique em Concluir'Polarize a amostra por um período de tempo suficiente para atingir mais de 95% de polarização. Durante a polarização, conecte um frasco de coleta ao tubo de exaustão de amostra do hiperpolarizador e coloque-o próximo ao espectrômetro.Configure um espectrômetro de RMN de um tesla com a série de varredura de 13 carbonos de pulsos de RF de 110 graus em intervalos de três segundos. Durante a polarização do piruvato, comece a preparação da cultura de células. Remover o meio celular dos balões de cultura celular.Lave as células com cerca de 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato. Adicionar cinco mililitros de tripsina ao balão de cultura. Incubar a cultura por três a cinco minutos a 37 graus Celsius e, em seguida, desativar a tripsina com cerca de cinco mililitros de meio F12K contendo 10% de soro fetal de bezerro em volume.Em seguida, transfira o volume da suspensão celular contendo o número desejado de células para um tubo de centrífuga de plástico. Centrifugar a amostra de células a 1200 G durante cinco minutos. Rejeitar o sobrenadante e voltar a suspender a palete em meio F12K suficiente com 10%FCS para atingir um volume final de 800 microlitros.Transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e coloque o tubo em um recipiente plástico cheio de água morna. Para iniciar a coleta de dados por meio de espectroscopia de ressonância magnética de carbono 13, uma vez que a amostra da célula é preparada e a polarização do piruvato é maior que 95 por cento, clique em Executar dissolução no software DNP Polarizer. Carregue o volume medido do agente de dissolução através da válvula superior da câmara de dissolução.Mova o bastão de dissolução para a posição ativa. Confirme clicando em Avançar'Quando a amostra de célula estiver pronta para o experimento, clique em Concluir'no software DNP Polarizer para inicializar o processo de dissolução. Aguarde até que o processo de dissolução seja concluído.Adicione 200 microlitros da solução de piruvato hiperpolarizado a 800 microlitros da amostra de células. Misture bem com uma pipeta e, em seguida, coloque cerca de 600 microlitros da mistura em um tubo de RMN de cinco milímetros. Carregue o tubo de RMN no espectrômetro e clique em Executar'para iniciar a medição.Em seguida, mova o bastão de dissolução com o sample copo anexado para a posição de limpeza e clique em Concluir'no software DNP Polarizer. Para iniciar a ressonância magnética de carbono 13, após iniciar o processo de hiperpolarização, transfira 800 microlitros de amostra de células ressuspensas com um número de células de pelo menos 10 para o oitavo em uma seringa de três mililitros. Conecte a seringa a um cateter longo e coloque a seringa em uma mesa de ressonância magnética.Certifique-se de que o cateter seja longo o suficiente para alcançar fora do scanner de ressonância magnética. Coloque um simulador de calibração, contendo dez molares de carbono 13 ureia com 10% de gadoterato de meglumina ao lado da seringa. Coloque uma bobina receptora de RF sintonizada em carbono 13 na seringa.Insira a mesa de digitalização no scanner de forma que o objeto de interesse fique no isocentro do scanner de ressonância magnética. Conecte o frasco de conexão ao tubo de exaustão de amostra do hiperpolarizador e coloque-o próximo à extremidade do cateter. Execute uma sequência de localização padrão de três planos e ajuste a posição da seringa, se necessário.Em seguida, configure e execute uma sequência anatômica ponderada em T2 de prótons cobrindo a localização da seringa. A partir das imagens anatômicas resultantes, selecione cinco cortes contínuos da região de interesse, incluindo o simulador de carbono 13. Configure uma aquisição de calibração espectroscópica de carbono 13 e selecione a sequência de calibração de bloco 2D na biblioteca de sequências de pulso.Baixe a sequência de pulso para o scanner e execute uma pré-varredura espectroscópica. No gráfico de magnitude do espectro, defina o pico fantasma de calibração de carbono 13 para o centro da frequência do scanner. Defina os ganhos do receptor para o máximo e clique em Scan'para executar a sequência de calibração.Registre o ganho de transmissão relatado e a frequência cêntrica. Em seguida, configure uma aquisição de imagem de deslocamento químico de carbono 13 para as fatias anatômicas escolhidas. Escolha a sequência de imagens espectroscópicas ecoplanares 2D e baixe a sequência de pulso para o scanner.Execute a pré-varredura espectroscópica e ajuste a frequência cêntrica e o ganho de transmissão com base nos valores de calibração para concluir a configuração do espectrômetro de ressonância magnética. Quando o piruvato atingir 95% de polarização, clique em Executar dissolução no software DNP Polarizer e carregue o agente de dissolução. Mova o bastão de dissolução para a posição ativa.Clique em Avançar'e depois em Concluir'Quando a amostra hiperpolarizada dissolvida atingir o frasco de coleta, retire cerca de 1 mililitro da solução hiperpolarizada em uma seringa e injete-a no cateter de forma que 200 microlitros atinjam a amostra celular. Clique em Digitalizar'para iniciar a aquisição dos dados experimentais. Quando a coleta de dados estiver concluída, mova o bastão de dissolução com o sample copo anexado para a posição de limpeza e clique em Concluir'no software DNP NMR.A taxa de troca metabólica do piruvato para o lactato foi estudada em células PC3 do carcinoma de próstata monitorando as intensidades de sinal da espectroscopia de RMN de carbono 13 do lactato hiperpolarizado e do piruvato em relação à frequência e ao tempo. Os valores cinéticos de lactato foram avaliados por um modelo de razão simples e por um modelo diferencial de troca de dois locais, e normalizados para o número de células. Em ambos os modelos, foi observada uma tendência de diminuição da produção de lactato com o aumento do número de células.Isso é atribuído a maiores concentrações de células e maior viscosidade da amostra. Amostras com contagens de células abaixo de duas vezes dez elevado a sete mostram uma relação sinal-ruído de lactato muito pequena e, portanto, grandes valores de desvio padrão, indicando que as amostras devem conter pelo menos esse número de células para obter dados informativos. A localização espacial foi obtida com ressonância magnética com boa resolução espectral, permitindo que imagens de carbono 13 fossem adquiridas para regiões de frequência específicas.A distribuição espacial foi determinada a partir dos dados brutos. A imagem de carbono 13 também pode ser co-registrada com a imagem de prótons adquirida anteriormente. Uma vez dominado e executado corretamente, este experimento pode ser feito em menos de 60 minutos.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma hiperpolarização de uma molécula desejada usando a técnica de polarização nuclear dinâmica e como fazer experimentos simples de espectroscopia de RMN e imagem celular. Ao tentar este procedimento, é importante ser muito rápido. Depois que a amostra hiperpolarizada deixar o polarizador, lembre-se de que você perde todo o sinal de RMN ganho em menos de dois minutos.Em conclusão, a dissolução DNP pode ser usada para uma variedade de aplicações. Isso inclui estudar doenças como diabetes ou observar alterações metabólicas de vários tipos de câncer, mas também medir o pH do tecido.

hyperpolarized-13c-metabolic-magnetic-resonance-spectroscopy

Research

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Cancer Research

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hiperpolarizado¹³ C Metabolic Espectroscopia de Ressonância Magnética e imagem

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