hiperpolarizado ¹³ C Metabolic Espectroscopia de Ressonância Magnética e imagem

O objetivo geral deste procedimento é hiperpolarizar moléculas marcadas com carbono 13 usando polarização nuclear dinâmica e medir sua conversão enzimática usando ressonância magnética de carbono 13, imagem retroscópica, in vitro. Este método aumenta o sinal ressonante do carbono em 10.000 a 100.000 vezes, permitindo que os compostos em camadas sejam distinguidos de seus produtos metabólicos e localizados no corpo por meio de imagens. A principal vantagem desse método, em comparação com, digamos, as técnicas de RV, é que ele fornece uma visão do metabolismo de substâncias que ocorrem naturalmente em organismos vivos em tempo real.

Além disso, este método pode fornecer informações sobre o metabolismo do câncer e como é in vitro. Também pode ser aplicado a modelos animais e pacientes humanos. A aplicação dessa técnica excede a localização do tumor.

Ele pode ser usado para encontrar e distinguir subtipos de tumores metabólicos e para monitorar o tratamento juntamente com técnicas de última geração. Para iniciar o procedimento, primeiro prepare uma solução milimolar de gadoterato meglumina e 13 piruvato concentrado de um carbono. Adicione o radical tritil OX063 à mistura para atingir uma concentração final de 15 milimolares e dissolva-o completamente.

No software DNP Polarizer, clique em Cool Down'para diminuir a temperatura da inserção de temperatura variável, ou VTI, abaixo de 1.4 kelvin. Depois que o VTI esfriar, coloque cerca de oito microlitros da solução de amostra marcada com carbono 13 em um copo de amostra de plástico. Fixe o copo na haste de inserção da amostra.

No software, clique em Inserir amostra'Selecione amostra normal'e depois Avançar'Isso levanta o suporte de amostra e abre as válvulas de entrada para o VTI, permitindo a inserção da amostra. No prompt, use a haste de inserção para empurrar o sample copo para dentro do VTI. Retire o copo de amostra e retire cuidadosamente a haste de inserção.

Confirme se a amostra foi separada da haste e não foi empurrada para fora do VTI durante o procedimento de fechamento. Clique em Avançar'para fechar as válvulas e abaixar o copo de amostra no hélio líquido e, em seguida, clique em Concluir'Para encontrar uma frequência de polarização ideal, primeiro inicie o software RINMR. Na tela de configuração, clique em Selecionar amostra'e Faça micro varredura'Crie o arquivo onde os dados serão armazenados.

Volte para o software DNP Polarizer. Selecione a guia Calibrar, defina os parâmetros de varredura de micro-ondas e inicie o processo de varredura de micro-ondas. Quando a varredura de micro-ondas terminar, observe a frequência com uma amplitude máxima de sinal medida.

Retorne ao software RINMR e selecione Solid Build Up'Em seguida, no software DNP Polarizer, clique em Polarização'Insira a frequência ideal de microondas e a potência. Clique em Avançar'Ativar monitoramento de acúmulo de polarização'e clique em Concluir'Polarize a amostra por um período de tempo suficiente para atingir mais de 95% de polarização. Durante a polarização, conecte um frasco de coleta ao tubo de exaustão de amostra do hiperpolarizador e coloque-o próximo ao espectrômetro.

Configure um espectrômetro de RMN de um tesla com a série de varredura de 13 carbonos de pulsos de RF de 110 graus em intervalos de três segundos. Durante a polarização do piruvato, comece a preparação da cultura de células. Remover o meio celular dos balões de cultura celular.

Lave as células com cerca de 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato. Adicionar cinco mililitros de tripsina ao balão de cultura. Incubar a cultura por três a cinco minutos a 37 graus Celsius e, em seguida, desativar a tripsina com cerca de cinco mililitros de meio F12K contendo 10% de soro fetal de bezerro em volume.

Em seguida, transfira o volume da suspensão celular contendo o número desejado de células para um tubo de centrífuga de plástico. Centrifugar a amostra de células a 1200 G durante cinco minutos. Rejeitar o sobrenadante e voltar a suspender a palete em meio F12K suficiente com 10%FCS para atingir um volume final de 800 microlitros.

Transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e coloque o tubo em um recipiente plástico cheio de água morna. Para iniciar a coleta de dados por meio de espectroscopia de ressonância magnética de carbono 13, uma vez que a amostra da célula é preparada e a polarização do piruvato é maior que 95 por cento, clique em Executar dissolução no software DNP Polarizer. Carregue o volume medido do agente de dissolução através da válvula superior da câmara de dissolução.

Mova o bastão de dissolução para a posição ativa. Confirme clicando em Avançar'Quando a amostra de célula estiver pronta para o experimento, clique em Concluir'no software DNP Polarizer para inicializar o processo de dissolução. Aguarde até que o processo de dissolução seja concluído.

Adicione 200 microlitros da solução de piruvato hiperpolarizado a 800 microlitros da amostra de células. Misture bem com uma pipeta e, em seguida, coloque cerca de 600 microlitros da mistura em um tubo de RMN de cinco milímetros. Carregue o tubo de RMN no espectrômetro e clique em Executar'para iniciar a medição.

Em seguida, mova o bastão de dissolução com o sample copo anexado para a posição de limpeza e clique em Concluir'no software DNP Polarizer. Para iniciar a ressonância magnética de carbono 13, após iniciar o processo de hiperpolarização, transfira 800 microlitros de amostra de células ressuspensas com um número de células de pelo menos 10 para o oitavo em uma seringa de três mililitros. Conecte a seringa a um cateter longo e coloque a seringa em uma mesa de ressonância magnética.

Certifique-se de que o cateter seja longo o suficiente para alcançar fora do scanner de ressonância magnética. Coloque um simulador de calibração, contendo dez molares de carbono 13 ureia com 10% de gadoterato de meglumina ao lado da seringa. Coloque uma bobina receptora de RF sintonizada em carbono 13 na seringa.

Insira a mesa de digitalização no scanner de forma que o objeto de interesse fique no isocentro do scanner de ressonância magnética. Conecte o frasco de conexão ao tubo de exaustão de amostra do hiperpolarizador e coloque-o próximo à extremidade do cateter. Execute uma sequência de localização padrão de três planos e ajuste a posição da seringa, se necessário.

Em seguida, configure e execute uma sequência anatômica ponderada em T2 de prótons cobrindo a localização da seringa. A partir das imagens anatômicas resultantes, selecione cinco cortes contínuos da região de interesse, incluindo o simulador de carbono 13. Configure uma aquisição de calibração espectroscópica de carbono 13 e selecione a sequência de calibração de bloco 2D na biblioteca de sequências de pulso.

Baixe a sequência de pulso para o scanner e execute uma pré-varredura espectroscópica. No gráfico de magnitude do espectro, defina o pico fantasma de calibração de carbono 13 para o centro da frequência do scanner. Defina os ganhos do receptor para o máximo e clique em Scan'para executar a sequência de calibração.

Registre o ganho de transmissão relatado e a frequência cêntrica. Em seguida, configure uma aquisição de imagem de deslocamento químico de carbono 13 para as fatias anatômicas escolhidas. Escolha a sequência de imagens espectroscópicas ecoplanares 2D e baixe a sequência de pulso para o scanner.

Execute a pré-varredura espectroscópica e ajuste a frequência cêntrica e o ganho de transmissão com base nos valores de calibração para concluir a configuração do espectrômetro de ressonância magnética. Quando o piruvato atingir 95% de polarização, clique em Executar dissolução no software DNP Polarizer e carregue o agente de dissolução. Mova o bastão de dissolução para a posição ativa.

Clique em Avançar'e depois em Concluir'Quando a amostra hiperpolarizada dissolvida atingir o frasco de coleta, retire cerca de 1 mililitro da solução hiperpolarizada em uma seringa e injete-a no cateter de forma que 200 microlitros atinjam a amostra celular. Clique em Digitalizar'para iniciar a aquisição dos dados experimentais. Quando a coleta de dados estiver concluída, mova o bastão de dissolução com o sample copo anexado para a posição de limpeza e clique em Concluir'no software DNP NMR.

A taxa de troca metabólica do piruvato para o lactato foi estudada em células PC3 do carcinoma de próstata monitorando as intensidades de sinal da espectroscopia de RMN de carbono 13 do lactato hiperpolarizado e do piruvato em relação à frequência e ao tempo. Os valores cinéticos de lactato foram avaliados por um modelo de razão simples e por um modelo diferencial de troca de dois locais, e normalizados para o número de células. Em ambos os modelos, foi observada uma tendência de diminuição da produção de lactato com o aumento do número de células.

Isso é atribuído a maiores concentrações de células e maior viscosidade da amostra. Amostras com contagens de células abaixo de duas vezes dez elevado a sete mostram uma relação sinal-ruído de lactato muito pequena e, portanto, grandes valores de desvio padrão, indicando que as amostras devem conter pelo menos esse número de células para obter dados informativos. A localização espacial foi obtida com ressonância magnética com boa resolução espectral, permitindo que imagens de carbono 13 fossem adquiridas para regiões de frequência específicas.

A distribuição espacial foi determinada a partir dos dados brutos. A imagem de carbono 13 também pode ser co-registrada com a imagem de prótons adquirida anteriormente. Uma vez dominado e executado corretamente, este experimento pode ser feito em menos de 60 minutos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma hiperpolarização de uma molécula desejada usando a técnica de polarização nuclear dinâmica e como fazer experimentos simples de espectroscopia de RMN e imagem celular. Ao tentar este procedimento, é importante ser muito rápido. Depois que a amostra hiperpolarizada deixar o polarizador, lembre-se de que você perde todo o sinal de RMN ganho em menos de dois minutos.

Em conclusão, a dissolução DNP pode ser usada para uma variedade de aplicações. Isso inclui estudar doenças como diabetes ou observar alterações metabólicas de vários tipos de câncer, mas também medir o pH do tecido.