Hybrid-Cut: Um Método Seccionamento melhorado para amostras de tecidos de plantas recalcitrante

O objetivo geral do método de seccionamento de tecido de corte híbrido é melhorar a integridade dos tecidos vegetais recalcitrantes seccionados, aqueles com fibras resistentes e cristais de sílica, para criar amostras de tecido adequadas para estudos anatômicos e biológicos. Plantas que contêm alto nível de cristal e sílica podem sofrer rasgos graves da parafina e problemas durante o seccionamento. Este método melhora significativamente a integridade do tecido.

A principal vantagem desta técnica é que o seccionamento sob temperatura ultrabaixa no criostato endurece o bloco de parafina, reduzindo significativamente o problema de cisalhamento do cristal. A aplicação desta técnica pode se estender à hibridização in situ, FISH e avaliação interna, entre outros. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas para garantir que o bloco de parafina esteja firmemente aderido a um estágio podem ser desafiadoras.

Para começar, selecione plantas maduras de orquídea phalaenopsis no estágio de cinco folhas. Remova cuidadosamente as folhas, rasgando-as ao longo da nervura central. Usando um bisturi afiado, remova cuidadosamente os botões axilares da base da terceira ou quarta folha no sistema monopodial.

Coloque imediatamente as amostras em um frasco de cintilação de vidro contendo 15 mililitros de fixador PFA gelado. Aplique um vácuo nas amostras no fixador a quatro graus Celsius por 15 a 20 minutos. Pequenas bolhas serão liberadas das amostras.

Repita esta etapa até que a maioria das amostras afunde após a liberação do vácuo. Por fim, segure o aspirador durante a noite e solte-o lentamente no dia seguinte. Em seguida, mergulhe as amostras fixas em 15 mililitros de PBS e coloque no gelo por 15 minutos.

Desidrate as amostras em 15 mililitros de etanol em uma série de concentrações crescentes. 30%50%70%85%95%e finalmente 100%Infiltre as amostras com 15 mililitros de uma mistura de dois a um volume de etanol e substituto de xileno à temperatura ambiente. Continuar a infiltração colocando sequencialmente as amostras em 15 mililitros de cada um dos seguintes.

Uma mistura de um para um volume de etanol e substituto de xileno, uma mistura de um para dois volumes de etanol e substituto de xileno e, finalmente, um para dois Em seguida, incube os tecidos em um forno a 60 graus Celsius. Infiltre as amostras com 15 mililitros de substituto de xileno e mistura de parafina a 60 graus Celsius.

Finalmente, infiltre a parafina em 15 milímetros de parafina pura duas vezes por 12 horas cada a 60 graus Celsius. Repita esta etapa no dia seguinte. Para começar a incorporar, primeiro aqueça os moldes de metal a 62 graus Celsius e, em seguida, despeje aproximadamente 13 mililitros de cera derretida na base do molde.

Com uma pinça aquecida, transfira uma amostra de tecido para o molde e oriente-a para a posição desejada. Mova o molde com cuidado para a placa de resfriamento e deixe-o repousar até que a cera solidifique. Em seguida, use uma lâmina de barbear para aparar o bloco de amostra de parafina em uma coluna de tamanho apropriado com uma superfície trapezoidal na parte superior.

Adicione 800 microlitros de composto de temperatura de corte óptico, ou OCT, ao centro do estágio de criostato. Coloque o bloco de parafina no palco e oriente rapidamente o bloco de tecido para a posição desejada. Transfira o bloco de parafina e o estágio para uma câmara cristalina.

Congele rapidamente o OCT a 42 graus Celsius negativos por 10 minutos. Em seguida, resfrie o adaptador cristalino e a temperatura da câmara para 20 graus Celsius negativos e 16 graus Celsius negativos, respectivamente. Conecte o bloco e o stage ao adaptador crystat.

Agora, corte os tecidos em 10 micrômetros de espessura. Usando uma pinça, pegue as seções de tecido e coloque-as de forma que flutuem em 800 microlitros de água tratada com DEPC em uma lâmina revestida de poli-l-lisina. Transfira as lâminas para uma placa quente ajustada para 42 graus Celsius.

Deixe as seções ficarem achatadas e use papel de filtro para absorver a água das bordas. Deixe a amostra na placa quente a 42 graus Celsius durante a noite para permitir que o tecido seja montado na lâmina. Para desparafinizar as amostras, primeiro coloque as lâminas de tecido montadas em um rack de coloração.

Adicione 150 mililitros de xileno em um frasco de coloração e mergulhe a prateleira de lâminas por cinco minutos. Em seguida, reidratar as amostras colocando-as em concentrações decrescentes de etanol, 150 mililitros cada por três minutos de cada vez à temperatura ambiente. Por fim, mergulhe os espécimes em água bidestilada por três minutos.

Manchar as amostras colocando as lâminas em 150 mililitros de solução de hematoxilina por 1,5 minutos. Enxágüe por alguns segundos em 150 mililitros de água bidestilada contendo uma a duas gotas de ácido clorídrico N e, em seguida, lave as lâminas brevemente com água bidestilada Desidrate as amostras mais uma vez usando uma série de 150 mililitros de concentrações crescentes de etanol por três minutos à temperatura ambiente.

Mergulhe os espécimes em 150 mililitros de xileno por cinco minutos. Por fim, monte as amostras adicionando suavemente 600 microlitros de meio de montagem à base de xileno em cada lâmina e, em seguida, colocando uma lamínula sobre a amostra. Usando este método, seções de tecido de orquídeas phalaenopsis foram geradas, incluindo a gema axilar tipicamente difícil de cortar, que contém altos níveis de cristais.

Estruturas detalhadas foram preservadas, permitindo a visualização dos corpos proteicos. O corte híbrido também produziu seccionamento claro para visualização do meristema apical da parte aérea da semente germinada. Essas imagens mostram a preparação de seções transversais de folhas de plantas de arroz e trigo usando as técnicas tradicionais de corte de parafina versus híbrido.

Essas culturas normalmente contêm altos níveis de sílica, o que as torna difíceis de cortar. A integridade do tecido nas seções de corte híbrido foi significativamente melhorada, e as principais estruturas, muitas vezes distorcidas ou difíceis de encontrar em amostras de parafina, foram preservadas em sua totalidade no tecido de corte híbrido. Além disso, o rasgo foi observado apenas nas amostras seccionadas em parafina.

Além disso, a forte retenção da anatomia torna os tecidos de corte híbridos úteis para estudos de padrões espaciais de expressão gênica. Aqui, a hibridização in situ com Actina e Ciclina B1:1 foi realizada em seções de corte híbrido da segunda e terceira gemas axilares das orquídeas phalaenopsis. A preservação anatômica aprimorada permitiu a detecção de níveis mais altos de expressão dos genes-alvo nas células meristemáticas em desenvolvimento do terceiro gemo axilar.

Ao tentar este procedimento, é importante manter uma temperatura de menos 16 graus centígrados para endurecer o bloco de parafina. Isso deve resultar em uma seção de tecido de boa qualidade. Tivemos a ideia desse método depois que falhamos muitas vezes em realizar o seccionamento bem-sucedido em orquídeas usando o método tradicional de parafina ou criossecção.

Seguindo este procedimento, todos os experimentos como hibridização in situ e FISH podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, incluindo a investigação da localização espacial e função do gene. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar o corte de tecido de alta qualidade em amostra de planta recalcitrante.