A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An In Vitro Set-up para a investigação detalhada da Relação Neuron-glia

O objetivo geral deste ensaio de cocultura indireta é investigar o impacto dos astrócitos no desenvolvimento dos neurônios. Nosso laboratório está interessado no papel das interações neurônio-glia. Acredita-se que os astrócitos contribuam para a formação das sinapses, as estruturas de conexão do sistema nervoso central.

Para estudar seu papel, projetamos um modelo in vitro onde podemos combinar astrócitos primários e neurônios embrionários primários, em compartimentos separados. Os compartimentos são conectados por uma membrana permeável, que permite a análise das trocas entre os dois tipos de células. Usando essa abordagem, conseguimos monitorar a formação de sinapses por períodos de até quatro semanas.

Além disso, é possível investigar os papéis individuais dos astrócitos, por um lado, e dos neurônios, por outro, usando este ensaio. E, finalmente, também podemos investigar com mais detalhes o secretoma de nossos compartimentos celulares que contém moléculas que medeiam a influência recíproca de ambos os compartimentos celulares nesse sistema. Este método pode fornecer informações sobre as interações entre neurônios e astrócitos.

Além disso, pode ser aplicado a outros organismos modelo, como as células de ratos. Geralmente, indivíduos novos neste método teriam dificuldades porque a experiência é necessária para obter a operação de maturação ideal do tecido hipocampal após a dissecção. Para dissecar os córtices, remova a pele do crânio ao longo da linha média, começando do pescoço até o nível dos olhos.

Em seguida, segure a cabeça pela extremidade rostral com um par de pinças e faça uma incisão ao longo da linha média do crânio. Em seguida, corte as metades esquerda e direita do crânio para expor o cérebro. Depois disso, levante o cérebro do crânio e transfira-o para uma placa de Petri de 10 cm cheia de HBSS.

Proceda da mesma maneira com os espécimes restantes até que todos os cérebros sejam coletados no prato. Para separar os córtices, aperte o traseiro usando uma pinça. Faça uma incisão na linha média entre os dois hemisférios.

Fixe cuidadosamente o cérebro e corte o mesencéfalo e o bulbo olfatório usando um segundo par de pinças, o que resulta em duas metades corticais. Em seguida, fixe uma metade cortical com um par de pinças e retire as meninges destacando-as da borda lateral. E, posteriormente, puxando-o da superfície cortical usando um segundo par de pinças.

Oriente a metade cortical com sua superfície voltada para baixo. Disseque e remova cuidadosamente o hipocampo em forma de meia-lua. Em seguida, transferir os córtices para um tubo cónico de 15 ml.

Adicione um ml de denem e 0,1% de papaína a um tubo de reação de 2 ml. Incubar a suspensão em banho-maria a 37 graus Celsius até que a solução esteja límpida. Adicione L-cisteína e DNAse à mistura e agite suavemente.

Em seguida, filtre a mistura para obter um ml de solução estéril, adicione-a ao tecido cortical e incube por 30 minutos a uma hora a 37 graus Celsius. Para terminar a reação de digestão, adicione um ml de meio de astrócitos e titule cuidadosamente o tecido digerido. Em seguida, adicionar cinco ml de meio de astrócitos à suspensão celular.

Uma vez dissociado o tecido numa única suspensão celular, centrifugue-o durante cinco minutos. Em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante do sedimento resultante e ressuspender as células em um ml de meio de astrócitos. Adicionar a suspensão celular aos frascos T75 reabastecidos com nove ml de meio de astrócitos.

Após sete dias de cultivo, verifique se as células formaram uma monocamada confluente. Certificar-se de que a temperatura é regulada para 37 graus Celsius e que o filtro do balão é selado com película de laboratório para evitar a evaporação do dióxido de carbono. Para se livrar das células progenitoras e obter uma cultura de astrócitos puros, coloque os frascos T75 em um agitador orbital e agite as culturas durante a noite a 250 rotações por minuto.

No dia seguinte, aspirar o meio e adicionar 10 ml de meio de cultura fresco reabastecido com 20 RSE micromolar para eliminar as células em divisão residuais. Neste procedimento, coloque quantas inserções forem necessárias na placa de 24 poços. Cubra cada inserção com 10 microgramas por ml de poli d'lisina e incube por uma hora.

Após uma hora, lave as inserções duas vezes com PBS. Enquanto isso, aspire o meio de astrócitos e lave a cultura uma vez com 10 ml de PBS para garantir que o soro residual seja removido. Em seguida, adicione três ml de 0,05% de tripsina edta aos frascos e incube as células para tripsinização por aproximadamente 10 minutos.

Em seguida, ressuspenda suavemente as células em sete ml de meio astrócito. Transferir a suspensão celular para um tubo de 15 ml e centrifugar durante cinco minutos a 216 x g. Em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em um ml de meio de astrócitos.

Conte as células usando uma câmara de contagem. Posteriormente, encha a placa de 24 poços com 500 microlitros de meio astrócitos por poço. Aspire o PBS e transfira 25.000 células e 500 microlitros de meio astrócitos para cada inserção individual e incube a cultura a 37 graus Celsius.

Para dissecar o hipocampo, prepare três pratos de 10 cm cheios de meio de preparação e um tubo de 2 ml com um ml de meio de preparação. Dissecar os hipocampos dos noyadees do córtex e recolhê-los num tubo de dois ml cheio de meio de preparação. É fundamental que o hipocampo seja isolado sem um tecido adjacente de outras regiões do SNC.

Portanto, após a remoção do hipocampo, os tecidos contaminantes estranhos devem ser removidos adicionalmente. Após a dissecção, transfira o tubo para uma bancada de fluxo laminar estéril. Retirar cuidadosamente o meio de preparação e digerir o tecido hipocampal de um ml de solução de digestão contendo papaína.

Após 15 minutos de digestão, retire cuidadosamente a solução de digestão por sucção suave com a pipeta. Devido à alta sensibilidade do neurônio, é fundamental titular o hipocampo com cuidado para evitar bolhas e obter a intensidade ideal de titulação. Lavar o hipocampo três vezes com meio de neurónios, adicionando e aspirando cuidadosamente um ml de meio de cultura fresco por ciclo de lavagem.

Após a etapa final de lavagem, titular cuidadosamente o tecido em um ml de meio neural. Em seguida, conte as células usando uma câmara de contagem. Coloque 35.000 células em 500 microlitros de meio neurônio por poço da placa de 24 poços e incube os neurônios a 37 graus Celsius por uma hora.

Agora retire da incubadora as inserções preparadas, que foram semeadas com monocamadas de astrócitos confluentes. Troque o meio aspirando o meio astrócitos e substituindo-o por 500 microlitros de meio neurônio fresco. Em seguida, coloque as inserções com astrócitos cuidadosamente nos poços que contêm as culturas de neurônios usando uma pinça estéril.

Posteriormente, coloque a cocultura de astrócitos de neurônios indiretos resultante de volta na incubadora até os experimentos. Esta imagem mostra as monocamadas formadas por astrócitos na membrana do inserto da cultura de células. Os astrócitos são imunomarcados para GFAP e MMP2.

O esquema aqui ilustra a configuração da cocultura indireta. Embora duas culturas estejam fisicamente separadas, elas compartilham o mesmo meio. Dois mediadores moleculares secretados das interações da glia dos neurônios são revelados no meio de co-cultivo usando western blot com múltiplas isoformas de TNC, um regulador de crescimento definitivo e MMP2, um modificador de matriz extracelular.

Esta imagem mostra que os neurônios primários desenvolvem redes altamente interconectadas no dia 14 de cultivo. A co-localização do fagote marcador pré-sináptico com o andaime PSD95 pós-sináptico documenta a formação sináptica estruturalmente completa. Em conclusão, usando nosso sistema de ensaio, mostramos que é possível combinar astrócitos primários e neurônios primários no modelo de cocultura.

Ambos os sobretipos são separados, mas compartilham o mesmo meio. Portanto, também podemos investigar o secretoma de ambos os surtipos em nosso modelo. Neste modelo, as sinapses se desenvolvem e amadurecem.

Além disso, também podemos mostrar o surgimento de estruturas específicas adicionais, como redes perineuronais. Assim, nosso sistema modelo é adequado para investigar a influência dos astrócitos na formação, plasticidade e função das sinapses.